JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
English

Automatically Generated
Bioengineering

Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Published: January 30, 2019
doi:
10.3791/58830
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
,
1Nanotechnology Characterization Lab., Cancer Research Technology Program,Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by National Cancer Institute

Summary

Påvisning af endotoksiner i industrielt fremstillet nanomateriale repræsenterer en af de store udfordringer inden for Nanomedicin. Vi præsenterer her, et casestudie, der beskriver rammerne består af tre forskellige LAL formater til at vurdere potentielle endotoxin forurening i nanopartikler.

Abstract

Når de findes i farmaceutiske produkter, en Gram-negative bakterielle cellevæg komponent endotoxin (ofte også kaldet LPS) kan forårsage betændelse, feber, hypo- eller hypertension, og i ekstreme tilfælde kan føre til væv og orgel skader, der kan blive fatal. Mængder af endotoxin i farmaceutiske produkter, derfor er strengt reguleret. Blandt de metoder, der er til rådighed for endotoxin påvisning og kvantificering, er Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay almindeligt anvendt over hele verden. Mens enhver farmaceutisk produkt, der kan forstyrre LAL assay, udgør nano-formuleringer en særlig udfordring på grund af deres kompleksitet. Formålet med dette dokument er at give en praktisk vejledning for forskere uerfarne i estimeringen af endotoksiner i nanomaterialer og nanopartikel-formuleret narkotika. Heri, diskuteres praktiske anbefalinger til at udføre tre LAL formater herunder turbiditet, kromogent og gel-blodprop assays. Disse assays kan bruges til at bestemme endotoxin forurening i nanoteknologi-baserede lægemidler, vacciner og adjuvanser.

Introduction

En endotoxin er en byggesten af Gram-negative bakterielle cellevæg1,2. Det kan aktivere immunceller på meget lav (pikogram) koncentrationer1,2. Proinflammatoriske mæglere (cytokiner, leukotriener, eicosanoider, etc.) produceret af celler som reaktion på en endotoxin er ansvarlig for feber, hypotension, hypertension og mere alvorlige sundhedsmæssige problemer, herunder flere organsvigt 1 , 2 , 3. sværhedsgraden af immun-medieret bivirkninger udløst af endotoxin afhænger dens potens bestemmes af endotoxin sammensætning og struktur og måles i internationale endotoxin enheder (IUs eller EUs)3. Antallet af disse enheder pr. kg kropsvægt bruges til at indstille en tærskel pyrogen dosis af endotoxin. Denne dosis er 5 EU/kg for lægemidler administreres via alle ruter men ruten Intratekal. Lægemidler doseres pr kvadratmeter af kroppens overflade, intraokulært væsker, radioaktive lægemidler og produkter administreres via Intratekal rute har en forskellige pyrogen tærskeldosis, som er 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (hvor V er den volumenet af det produkt, der er beregnet til administration), 0,2 EU/kg, henholdsvis4. Flere detaljer om den pyrogen tærskeldosis for forskellige lægemidler og enheder leveres og diskuteret andetsteds4,5,6.

Dyr varierer meget i deres følsomhed over for endotoxin-medierede reaktioner. Mennesker, ikke-menneskelige primater og kaniner er blandt de mest ekstremt følsomme over for endotoksiner3arter. For at undgå endotoxin-medieret bivirkninger hos patienter og forebygge urigtige konklusioner af prækliniske toksicitet og effekt studier, er det nødvendigt at præcist at detektere og kvantificere endotoksiner i både kliniske og prækliniske grade formuleringer. Flere i øjeblikket tilgængelige metoder kan opnå denne opgave. En af dem er Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analysen, som er almindeligt anvendt over hele verden til skærmen biomedicinske produkter for den potentielle endotoxin forurening samt at opdage bakterieinfektioner7,8,9. Den lysate er fremstillet af amoebocytes, cellerne i blod fra horseshoe krabber Limulus Polyfem bosiddende i øst-kysten af det europæiske kontinent Nordamerika7. Interessant, der er et par forskellige arter af horseshoe krabber (Tachypleus gigas og Tachypleus tridentatus) i Asien10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) er brugt i flere asiatiske lande til påvisning af endotoxin svarende til hvordan LAL bruges i andre cuntries10. Lysates (LAL og TAL) indeholder en gruppe af proteiner, der ved aktivering giver protease aktivitet. En af disse proteiner, den såkaldte faktor C aktiveres ved kontakt med endotoxin. Aktiveret faktor C kløver Factor B, som til gengæld også bliver en protease og kløver et pro-koagulation enzym til at producere en blodpropper enzym. Resultatet af denne kæde af reaktioner er dannelsen af en gel, en stigning i stikprøven Turbiditet og i overværelse af et kromogent substrat, udseendet af en farvet produkt, der tjener som et fundament for gel-blodprop, turbiditet og kromogent assays, henholdsvis. Mens der er ingen obligatoriske LAL format, US Food and Drug Administration (FDA) forklarer i retningslinjer for baseret industrien dokument, at beslutningen om foretages i tilfælde af uoverensstemmelse i testresultater mellem forskellige LAL formater, på gel-blodprop assay5 .

Mange almindeligt anvendte laboratoriekemikalier (fx., EDTA) og kendte lægemiddel produkter (fx penicillin) forstyrrer LAL-undersøgelser,11. Indblanding identificeres normalt ved at vurdere inddrivelse af endotoxin standard aks på en kendt koncentration i en løsning, der indeholder testmateriale. Hvis spike opsving er mindre end 50% eller mere end 200%, så resultatet af LAL assay for er den givne prøvemateriale ugyldig på grund af hæmning eller ekstraudstyr, henholdsvis4. Nanoteknologi-baserede formuleringer er ofte komplekse og forstyrre LAL gennem en række mekanismer12,13,14. Mange tilgange er blevet beskrevet til at overvinde indblanding: prøve rekonstituering i specifikke buffere og overfladeaktive stoffer, protein inaktiveres ved opvarmning, ødelæggelse af lipid-baserede hule materialer ved opvarmning og supplere prøve med overskud divalent kationer5,12,13,14,15. Alternative metoder til situationer, hvor LAL indblanding ikke kan overvindes er også blevet beskrevet: ELISA, en HEK-TLR4 reporter celle line assay og massespektrometri16,17,18, 19.

Heri, er eksperimentelle procedurer for udførelse af gel-blodprop, turbiditet og kromogent LAL assays beskrevet. Disse analyser er også tilgængelige på nanoteknologi karakterisering Lab (NCL) hjemmeside20 i protokoller STE1.2 (turbiditet LAL), STE1.3 (gel-blodprop LAL) og STE1.4 (kromogent LAL). Det anbefales at foretage mindst to forskellige formater for at karakterisere den samme nano-formulering. Når resultaterne af Turbiditet og kromogent LAL er uenige, anses gel-blodprop resultater5. Når resultaterne af to LAL formater er uenige, gennemført yderligere undersøgelser, enten monocyt aktivering test (MAT) eller kanin pyrogen test (RPT) til at kontrollere LAL resultater er21. Det er vigtigt at bemærke, at hver metode bruges til registrering af endotoxin og sikkerhedsforsøg vurdering har fordele og begrænsninger21,22,23,24. Erkendelse af begrænsninger af den procedure, der anvendes til at karakterisere en given nanoteknologi formulering er afgørende for at opnå videnskabelig begrundelse for anvendelse af proceduren for optimal for at nano-formulering.

I denne undersøgelse, blev pegyleret liposomal doxorubicin brugt som en model nanopartikel formulering. Denne formulering er godkendt af det amerikanske FDA i 1995 og anvendes til behandling af kræft patienter på verdensplan25.

Protocol

1. forberedelse af nanopartikel prøver Forberede undersøgelse prøven i LAL grade vand. Hvis prøven pH-værdien er uden for området 6-8, Juster pH-værdien ved hjælp af pyrogen-fri natriumhydroxid eller saltsyre. Ved hjælp af LAL grade vand forberede flere fortyndinger af eksemplet undersøgelse. Sørg for, at den højeste fortynding ikke overskrider maksimale gyldig fortynding (MVD). Henvise til afsnittet diskussion for detaljer om MVD skøn. 2. forberedelse af reagenser fælles mellem LAL formater Fortynde koncentreret natriumhydroxidopløsning lager ved hjælp af pyrogen-fri LAL reagens vand til at forberede en arbejdsgruppe løsning ved en koncentration på 0,1 N. Fortynde koncentreret saltsyre lager ved hjælp af pyrogen-fri LAL reagens vand og forberede en brugsopløsning i en endelig koncentration på 0,1 N. Forberedelse af kontrol Standard Endotoxin (CSE) Rekonstruere CSE ifølge analysecertifikatet leveret af fabrikanten.Bemærk: Se afsnittet diskussion for vigtige noter vedrørende oplysningerne i certifikatet. Henvises til Tabel af materialer for detaljer vedrørende katalog nummer og anvendelsen af en bestemt CSE formulering i forskellige LAL formater. Forberedelse af LAL reagens Rekonstruere LAL reagens ifølge analysecertifikatet leveret af producenten.Bemærk: Se afsnittet diskussion for vigtige detaljer vedrørende LAL reagens. Henvises til Tabel af materialer for detaljer vedrørende katalog nummer og anvendelsen af en given LAL reagens formulering i forskellige LAL format. 3. turbiditet LAL Assay Forberedelse af Kalibreringsstandarder Med 900 µL af LAL klasse vand og 100 µL af CSE, fremstilles så mange mellemliggende fortyndinger som nødvendige for, at udarbejdelsen af en kalibreringsstandardens med et koncentrationsområde fra 0,001 til 1 EU/mL. Først etiketten rør og tilføje 900 μl af LAL-grade vand ind i hvert rør. Derefter tilsættes 100 μl af 10 EU/mL solutionn at forberede kalibrering standard med koncentrationen af 1EU/mL. Gentag den serielle 10-fold fortynding, som beskrevet ovenfor for at forberede tre lavere Kalibreringsstandarder. Kontroller, at fire Kalibreringsstandarder spænder fra 0,001 til 1 EU/mL er udarbejdet. Forberedelse af kvalitetskontrol Forberede en 0,05 EU/mL kvalitetskontrol ved at kombinere 50 µL af opløsningen 1 EU/mL CSE med 950 µL af LAL-grade vand.Bemærk: Se afsnittet diskussion for detaljer vedrørende kontrol forberedelse. Forberedelse af hæmning/ekstraudstyr (IEC) kontrol Forberede IEC med koncentration på 0,05 EU/mL ved at kombinere 25 µL af opløsningen 1 EU/mL CSE og 475 µL af prøven nanomateriale ved en given fortynding.Bemærk: Se afsnittet diskussion for yderligere detaljer. Eksperimentel procedure Tillad instrument til at varme op ved at dreje det på ca 30 min i forvejen. Set-up påvisning bølgelængde på 660 nm som det er passende for turbiditet LAL. Log på ved at skrive brugernavnet og adgangskoden. Åbn software (Table of Materials) ved at klikke på det tilsvarende ikon på en computerskærm. Vælg indsamle data på software-startskærmen. Postere den test-ID og data gruppe information i den tilsvarende plads i fanen Generelt på skærmen Hjem. Klik på fanen Hardware vælger apparattype fra en dropdown menu. Set-up påvisning bølgelængde på 660 nm som dette er relevant for turbiditet LAL af chosing LAL turbiditet metode. Kontrollere, at et serienummer, system-ID og serial portoplysninger vises på skærmen. Klik på OK. Klik på OK endnu en gang for at bekræfte. Indtast ID som prøven i den samme rækkefølge prøven er testet. Brug standardknapper til at angive den negative kontrol, kurve og test standardprøverne. Forberede dublerede rør til hver prøve og tilføje 200 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) af negativ kontrol (vand), Kalibreringsstandarder, kvalitetskontrol, IEC og test nanopartikler i forvejen afmærket glasrør. Tilføje 50 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) af LAL reagens til første test hætteglas, vortex det kortvarigt, og Indsæt i test slot i instrument karrusel. Hvis forholdet 1:1 er brugt, er mængden af LAL reagens 100 µL. Gentag fremgangsmåden ovenfor for andre prøver. Processen prøver én ad gangen.Bemærk: Henvise til diskussion sektionen for flere detaljer. 4. kromogent LAL Forberedelse af Kalibreringsstandarder Med 900 µL af LAL klasse vand og 100 µL af CSE, fremstilles så mange mellemliggende fortyndinger som nødvendige for, at udarbejdelsen af en kalibreringsstandardens med en koncentration på 1 EU/mL. Med 900 µL LAL-grade vand og 100 µL 1 EU/mL kalibreringsstandardens, forberede en anden kalibrering standard i en koncentration på 0,1 EU/mL. Gentag den serielle 10-fold fortynding, som beskrevet ovenfor for at forberede to lavere Kalibreringsstandarder. Kontroller, at fire Kalibreringsstandarder spænder fra 0,001 til 1 EU/mL er udarbejdet. Forberedelse af kvalitetskontrol. Forberede en 0,05 EU/mL kvalitetskontrol ved at kombinere 50 µL af opløsningen 1 EU/mL CSE med 950 µL af LAL-grade vand.Bemærk: Se afsnittet diskussion for detaljer vedrørende kontrol forberedelse. Forberedelse af hæmning/ekstraudstyr (IEC) kontrol Forberede 0,05 EU/mL ved at kombinere 25 μL af 1 EU/mL CSE løsningen med 475 μL af prøven nanomateriale.Bemærk: Se afsnittet diskussion for yderligere detaljer. Eksperimentel procedure Tillad instrument til at varme op ved at dreje det på ca 30 min i forvejen. Set-up påvisning bølgelængde på 405 nm som det er passende for turbiditet LAL. Åbn softwaren ved at klikke på det tilsvarende ikon på en computerskærm. Log på ved at skrive brugernavnet og adgangskoden. Vælg indsamle data på software-startskærmen. Angiv test ID og data gruppeoplysninger i tilsvarende plads i fanen Generelt på skærmen Hjem. Klik på fanen Hardware vælger apparattype fra en dropdown menu. Vælg instrumentet. Kontrollere, at et serienummer, system-ID og serial portoplysninger vises på skærmen. Klik på OK. Klik på OK endnu en gang for at bekræfte. Indtast ID som prøven i den samme rækkefølge prøven er testet. Brug standardknapper til at angive negativ kontrol, kurve og test standardprøverne. Forberede dublerede rør til hver prøve og tilføje 200 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) af negativ kontrol (vand), Kalibreringsstandarder, kvalitetskontrol, IEC og test nanopartikler i forvejen afmærket glasrør. Tilføje 50 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) af LAL reagens til første test hætteglas, vortex det kortvarigt, og Indsæt i test slot i instrument karrusel. Hvis forholdet 1:1 er brugt, er mængden af LAL reagens 100 µL. Gentag fremgangsmåden ovenfor for andre prøver. Processen prøver én ad gangen. 5. gel-blodprop LAL Bemærk: Denne analysen identificerer forekomsten af endotoksiner i stikprøven baseret på visuel observation og registrering af en blodprop i reaktion tube. De eksperimenterende trin er beskrevet nedenfor. Bruge en bænk ark til at registrere resultaterne. Denne bænk ark er ikke obligatorisk, og andre måder at optagelse assay resultater er også acceptabel. Et eksempel på sådan en bænk ark er fastsat i supplerende materialer for bekvemmeligheden af en læser. Lambda (l) er følsomheden af gel-blodprop analysen og 0,03 EU/mL. Mærke så mange reaktion rør som skulle rumme antallet af analyserede klargjorte prøver. Henvise til bænken ark for at få oplysninger om antallet flergangsbestemmelser bruges i trin 1, trin 2 og trin 3 i analysen. Alikvot 100 μl vand, kontrol eller test stikprøven pr tube. Forberede CSE, således at den endelige koncentration er lig med 4λ. Kombinere 100 μL af standard nævnt ovenfor med 100 μl vand eller test prøve at opnå den endelige koncentration af CSE af 2λ. Gentag tre gange for at opnå lambda og halv-lambda og en fjerdedel lambda. Sørg for at temperaturen i vandbadet er 37 ° C. Tilsæt 100 μL af lysate pr. reagensglas, vortex kort og placere rack med alle rør i vandbad til 1 h. Vend røret med en jævn bevægelse. Manuelt at registrere resultater ved hjælp af “+” (fast blodprop) eller “-” (ingen blodprop eller løs blodprop) på arket bænk. Fortsættes analysen efter USP BET 854; bruge arket bænk som støttemateriale

Representative Results

Eksempel på data genereret efter afprøvning denne formulering i LAL assays er vist i tabel 1. Pegyleret liposomal doxorubicin blandede sig med kromogent LAL ved fortynding 5. Men denne indgriben blev overvundet af større fortyndinger. Spike opsving var mellem 50 og 200%, da denne formulering blev testet på fortyndinger 50 og 500 i Turbiditet og kromogent LAL samt på fortynding 5 i turbiditet LAL. Når justeret med fortyndingsfaktoren, var resultaterne konsekvent mell…

Discussion

Oplysningerne i denne protokol er blevet beskrevet før15,26 og bygger på flere lovgivningsmæssige dokumenter udgivet af US Food and Drug Administration (US FDA eller FDA) og Amerikas Forenede Stater farmakopé (USP)4 , 5 , 6 , 27, og er også tilgængelig på NCL hjemmeside20 i protokoller STE1.2 (turbiditet L…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Undersøgelsen blev støttet af føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt HHSN261200800001E. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis synspunkter eller politikker af Department of Health og Human Services, og heller ikke nævner af firmanavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering.

Materials

Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. . Bacterial Endotoxins Test. , (2011).
  5. FDA, U. . Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).
  6. FDA, U. . Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. , 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL – a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. . NCL assay cascade Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015)
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. , (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33 (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)–the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. . Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).

Tags

Endotoxin DetectionLimulus Amoebocyte LysateLAL AssayNano-formulationsCalibration StandardsQuality ControlEndotoxin UnitDilution PreparationNano MedicinesSafety EvaluationTest SamplesInstrument SettingsStandard CurveNegative ControlTest Materials
Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image