Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)
Summary
Detección de endotoxinas en nanomateriales modificados representa uno de los grandes retos en el campo de la nanomedicina. Aquí, presentamos un estudio de caso que describe el marco compuesto por tres formatos diferentes de LAL para estimar la potencial contaminación de endotoxina en nanopartículas.
Abstract
Cuando están presentes en productos farmacéuticos, una endotoxina de componentes de pared celular bacteriana Gram-negativas (a menudo también llamada lipopolisacárido) puede causar inflamación, fiebre, hipo o hipertensión y, en casos extremos, puede conducir a daño de órganos y tejidos que pueden se convierten en fatales. Las cantidades de endotoxinas en productos farmacéuticos, por lo tanto, están estrictamente reguladas. Entre los métodos disponibles para detección de endotoxinas y cuantificación, el ensayo de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) es de uso general en todo el mundo. Mientras que cualquier producto farmacéutico puede interferir con el ensayo LAL, nano-formulaciones representan un desafío particular debido a su complejidad. El objetivo de este trabajo es proporcionar a una guía práctica a los investigadores sin experiencia en la estimación de endotoxinas en la ingeniería de nanomateriales y nanopartículas formulado drogas. En este documento, se discuten recomendaciones prácticas para llevar a cabo análisis de gel-clot y tres formatos LAL como turbidez, cromogénico. Estos ensayos pueden utilizarse para determinar contaminación por endotoxinas en productos basados en nanotecnología, vacunas y adyuvantes.
Introduction
Una endotoxina es un componente de la pared celular bacteriana Gram-negativos1,2. Puede activar las células inmunes en muy bajas concentraciones de (picogramo)1,2. Los mediadores proinflamatorios (citoquinas, leucotrienos, eicosanoides, etc.) producidos por las células en respuesta a una endotoxina son responsables de la fiebre, hipotensión, hipertensión y problemas de salud más severos incluyendo falta múltiple del órgano 1 , 2 , 3. la severidad de las mediada inmune efectos secundarios provocados por la endotoxina depende de su potencia determinada por la composición de la endotoxina y estructura y medida en unidades de endotoxina Internacional (IUs o EUs)3. El número de estas unidades por kilogramo de peso corporal se utiliza para establecer una dosis de umbral pirogénico de la endotoxina. Esta dosis es de que 5 EU/kg para productos farmacéuticos administrados vía todas las rutas pero la ruta intratecal. Medicamentos dosis por metro cuadrado de superficie del cuerpo, líquidos intraoculares, radiofármacos y productos administrados vía intratecal ruta tienen una dosis de pirógenos diferente umbral, que es de 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (donde V es la volumen del producto destinado a la administración) y 0,2 EU/kg, respectivamente4. Más detalles sobre la dosis pirogénica de umbral para varios medicamentos y dispositivos se proporcionan y discuten en otra parte4,5,6.
Animales varían ampliamente en su sensibilidad a las reacciones mediadas por endotoxinas. Los seres humanos, primates no humanos y conejos están entre las especies más extremadamente sensibles a endotoxinas3. Para evitar mediada por endotoxinas efectos secundarios en los pacientes y evitar conclusiones inexactas de toxicidad preclínica y estudios de eficacia, es esencial para detectar y cuantificar endotoxinas en ambas formulaciones de grado clínico y preclínico exactamente. Varios métodos disponibles en la actualidad pueden lograr esta tarea. Uno de ellos es el ensayo de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), que se utiliza comúnmente en todo el mundo para productos biomédicos de la pantalla de la posible contaminación de endotoxina, así como para detectar infecciones bacterianas7,8,9. El lisado se prepara de amoebocytes, las células presentan en la sangre de los cangrejos de herradura Limulus polyphemus que residen en la costa este del continente de América del norte7. Interesante, hay algunas especies de cangrejos herradura (Tachypleus gigas y Tachypleus tridentatus) en Asia10. El lisado de Amoebocyte lysate (TAL) se utiliza en varios países asiáticos para la detección de endotoxina similar a cómo la LAL se utiliza en otros libres10. Los lisados (LAL y TAL) contienen un grupo de proteínas que al activarse le confieren actividad proteasa. Una de estas proteínas, el denominado Factor C se activa al contacto con la endotoxina. C Factor activado hiende Factor B, que a su vez también se convierte en una proteasa y hiende una enzima de coagulación pro para producir una coagulación enzimática. El resultado de esta cadena de reacciones es la formación de un gel, un aumento en la turbidez de la muestra y, en presencia de un sustrato cromogénico, la aparición de un producto coloreado, que sirven como base para gel-clot, turbiedad y ensayos cromogénicos, respectivamente. Aunque no existe ningún formato obligatorio de LAL, la US Food y Drug Administration (FDA) explica en la guía para documento de industria, que en caso de discrepancia en los resultados entre distintos formatos LAL, se tomó la decisión basado en el ensayo de gel-clot5 .
Muchos productos químicos de laboratorio de uso general (por ej., EDTA) y ensayos de drogas conocidos productos (p. ej., penicilina) interfieran con LAL11. La interferencia se suele identificar mediante la evaluación de la recuperación de la endotoxina estándar con una concentración conocida en una solución que contiene el material de prueba. Si la recuperación del punto es inferior al 50% o más del 200%, entonces el resultado de la LAL Ensayo para el material de prueba dada no es válido debido a la inhibición o aumento, respectivamente4. Formulaciones en base a nanotecnología son a menudo complejas e interfieren con la LAL a través de una variedad de mecanismos12,13,14. Se han descrito muchos enfoques para superar la interferencia: reconstitución de la muestra en los amortiguadores específicos y los tensioactivos, inactivación de la proteína por calefacción, destrucción de materiales huecos de lípidos por calentamiento y que complementa la muestra con exceso cationes divalentes5,12,13,14,15. También se han descrito métodos alternativos para situaciones cuando interferencia de LAL no puede superarse: ELISA, una célula de HEK-TLR4 reportero línea de ensayo y espectrometría de masas16,17,18, 19.
En este documento, se describen procedimientos experimentales para la realización de gel-clot, turbiedad y ensayos LAL cromogénicos. Estos ensayos también están disponibles en el laboratorio de caracterización de nanotecnología (NCL) Página Web20 en protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.3 (LAL gel-clot) y STE1.4 (LAL cromogénico). Se recomienda realizar al menos dos formatos diferentes para caracterizar la misma formulación de nano. Cuando no está de acuerdo resultados de la turbidez y el LAL cromogénico, los resultados de gel-clot se consideran5. Cuando no está de acuerdo resultados de los dos formatos LAL, adicional los resultados de estudios mediante test de activación de monocitos (MAT) o prueba de pirógenos de conejo (RPT) para verificar LAL son llevado a cabo21. Es importante tener en cuenta que cada método utilizado para la detección de endotoxina y evaluación pirógenos tiene ventajas y limitaciones21,22,23,24. Reconociendo las limitaciones del procedimiento utilizado para caracterizar una formulación determinada nanotecnología es esencial para obtener la justificación científica para el uso del procedimiento óptimo para nano-formulación.
En este estudio, doxorrubicina liposomal pegilada se utilizó como una formulación de nanopartículas de modelo. Esta formulación ha sido aprobada por la FDA en 1995 y utilizado para el tratamiento de pacientes de cáncer en todo el mundo25.
Protocol
Representative Results
Discussion
La información proporcionada en este protocolo se ha descrito antes15,26 y se basa en varios documentos normativos publicados por el US Food y Drug Administration (FDA o FDA) y farmacopea de Estados Unidos (USP)4 , 5 , 6 , 27y también está disponible en el sitio web NCL20 en protocolos STE1.2 (turbidez LAL), S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por fondos federales del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud, bajo contrato HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no reflejan necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de salud y servicios humanos, ni mención de nombres comerciales, productos comerciales, o las organizaciones implican la aprobación por el gobierno de Estados Unidos.
Materials
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
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