Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios
Summary
Deteção de endotoxinas em nanomateriais engenharia representa um dos grandes desafios no campo da nanomedicina. Aqui, apresentamos um estudo de caso que descreve a estrutura composta por três diferentes formatos LAL para estimar a contaminação potencial de endotoxinas em nanopartículas.
Abstract
Quando presentes em produtos farmacêuticos, uma parede de pilha bacteriana gram-negativos endotoxina de componente (muitas vezes também chamada lipopolissacarídeo) pode causar inflamação, febre, hipo – ou hipertensão arterial e, em casos extremos, pode levar a danos de tecidos e órgãos que podem tornar-se fatal. As quantidades de endotoxina em produtos farmacêuticos, portanto, são estritamente regulamentadas. Entre os métodos disponíveis para a detecção de endotoxinas e quantificação, o ensaio de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) é comumente usado em todo o mundo. Enquanto qualquer produto farmacêutico pode interferir com o ensaio LAL, nano-formulações representam um desafio particular devido à sua complexidade. O objetivo deste trabalho é fornecer um guia prático para pesquisadores inexperientes na estimativa de endotoxinas em nanomateriais engenharia e drogas nanopartículas-formulado. Neste documento, recomendações práticas para a realização de três formatos LAL, incluindo turbidez, cromogênico e gel-coágulo ensaios são discutidas. Estes ensaios podem ser usados para determinar a contaminação de endotoxinas em medicamentos baseados em nanotecnologia, vacinas e adjuvantes.
Introduction
Uma endotoxina é um bloco de construção da parede de pilha bacteriana gram-1,2. Ele pode ativar as células do sistema imunológico em muito baixas concentrações de (picograma)1,2. Os mediadores proinflammatory (citocinas, leucotrienos, eicosanoides, etc) produzidos pelas células em resposta a uma endotoxina são responsáveis pela febre, hipotensão, hipertensão e mais graves problemas de saúde, incluindo a falência múltipla de órgãos 1 , 2 , 3. a severidade dos imune-mediada-efeitos colaterais provocados a endotoxina depende de sua potência determinada pela estrutura e composição de endotoxinas e medido em unidades de endotoxina internacional (IUs ou EUs)3. O número dessas unidades por quilograma de peso corporal é usado para definir uma dose pirogénica limiar da endotoxina. Esta dose é que 5 EU/kg para medicamentos administrados através de todas as rotas, mas a via intratecal. Drogas dosadas por metro quadrado de superfície corporal, fluidos intra-ocular, radiofármacos e produtos administrado via intratecal rota têm uma dose pirogénica limiar diferente, que é 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, EU 175/V (onde V é o volume do produto destinado a administração) e EU 0.2/kg, respectivamente4. Mais detalhes sobre a dose pirogénica limiar para vários medicamentos e dispositivos são fornecidos e discutiram em outra parte4,5,6.
Animais variam muito em sua sensibilidade para reações mediadas por endotoxinas. Os seres humanos, os primatas não-humanos e coelhos estão entre as espécies mais extremamente sensíveis a endotoxinas3. Para evitar mediada por endotoxina de efeitos colaterais em pacientes e evitar conclusões imprecisas de toxicidade pré-clínica e estudos de eficácia, é essencial para detectar com precisão e quantificar endotoxinas em ambas as formulações de grau e pré-clínicos. Vários métodos atualmente disponíveis podem realizar esta tarefa. Um deles é o ensaio de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), que é comumente usado em todo o mundo para a tela de produtos biomédicos para a potencial contaminação de Endotoxinas, bem como para detectar infecções bacterianas7,8,9. O lisado é preparado a partir amoebocytes, as células presentes no sangue de caranguejos-ferradura Limulus polyphemus residentes na costa leste do continente da América do Norte7. Curiosamente, há poucas espécies diferentes de caranguejos-ferradura (Tachypleus gigas e Tachypleus tridentatus) em Ásia10. O Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) é usado em vários países asiáticos para a detecção de endotoxina semelhante como o leite é usado em outros cuntries10. Os lysates (LAL e TAL) contêm um grupo de proteínas que, após a ativação, conferir atividade de protease. Uma destas proteínas, o chamado Factor C é ativada em caso de contacto com endotoxina. Ativado fator C cliva o fator B, que por sua vez também se torna uma protease e fende uma pro-coagulação enzimática para produzir uma enzima de coagulação. O resultado dessa cadeia de reações é a formação de um gel, um aumento na turbidez da amostra e, na presença de um substrato cromogénico, a aparência de um produto colorido, que servem como base para gel-coágulo, turbidez e ensaios cromogênico, respectivamente. Enquanto não há nenhum formato obrigatório da LAL, a Food and Drug Administration (FDA) explica na orientação para documento da indústria, que, em caso de discrepância nos resultados do teste entre diferentes formatos LAL, a decisão é feita com base no ensaio de gel-coágulo5 .
Muitos comumente utilizados produtos químicos de laboratório (ex., EDTA) e ensaios de drogas conhecida produtos (por exemplo, penicilina) interferem com LAL11. A interferência é geralmente identificada por avaliar a recuperação do padrão de endotoxina cravado em uma concentração conhecida em uma solução contendo o material de ensaio. Se a recuperação de pico é menor do que 50% ou mais de 200%, então o resultado da LAL do ensaio para o material determinado teste é inválido devido à inibição ou realce, respectivamente4. Formulações à base de nanotecnologia são muitas vezes complexas e interferem com o leite através de uma variedade de mecanismos12,13,14. Muitas abordagens têm sido descritas para superar a interferência: reconstituição de amostra em buffers específicos e surfactantes, inativação de proteínas por aquecimento, destruição de materiais ocos baseados em lipídios por aquecimento e completando a amostra com excesso cátions divalentes5,12,13,14,15. Métodos alternativos para situações em que a interferência de leite não pode ser superada também têm sido descritos: ELISA, uma célula de repórter HEK-TLR4 linha de ensaio e espectrometria de massa16,17,18, 19.
Neste documento, os procedimentos experimentais para a realização de ensaios LAL cromogênico, turbidez e gel-coágulo são descritos. Estes ensaios também estão disponíveis no site laboratório de caracterização de nanotecnologia (NCL)20 em protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.3 (gel-coágulo LAL) e STE1.4 (LAL cromogênico). Recomenda-se realizar pelo menos dois formatos diferentes para caracterizar a mesma formulação-nano. Quando resultados de turbidez e LAL cromogênica discordam, os resultados do gel-coágulo são considerados5. Quando os resultados dos dois formatos LAL discordam, adicionais de conclusões de estudos usando o teste de ativação de monócitos (esteira) ou teste de pirogênio coelho (RPT) para verificar LAL são realizados21. É importante notar que cada método utilizado para detecção de endotoxinas e avaliação pirogénicos tem vantagens e limitações21,22,23,24. Reconhecer as limitações do procedimento usado para caracterizar uma formulação de determinada nanotecnologia é essencial para obter justificação científica para a utilização do procedimento ideal para essa formulação-nano.
Neste estudo, doxorrubicina lipossomal peguilado foi usada como uma formulação de nanopartículas de modelo. Esta formulação foi aprovada pela FDA em 1995 e usada no tratamento de pacientes de câncer em todo o mundo25.
Protocol
Representative Results
Discussion
As informações fornecidas neste protocolo tem sido descritas antes15,26 e se baseia em vários documentos normativos publicados pela Food e Drug Administration (FDA ou FDA) e farmacopeia dos Estados Unidos (USP)4 , 5 , 6 , 27e também está disponível no site NCL20 em protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.3 (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado por fundos federais do Instituto Nacional de câncer, National Institutes of Health, sob contrato HHSN261200800001E. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do departamento de saúde e serviços humanos, nem faz menção de nomes comerciais, produtos comerciais, ou organizações implicam o endosso pelo governo dos EUA.
Materials
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
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