Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)
Summary
Rilevamento di endotossine in nanomateriali ingegnerizzati rappresenta una delle grandi sfide nel campo della nanomedicina. Qui, presentiamo un caso di studio che descrive il quadro composto da tre diversi formati LAL per stimare il potenziale contaminazione di endotossina in nanoparticelle.
Abstract
Quando sono presenti in prodotti farmaceutici, un’endotossina di componente la parete cellulare batterica gram-negativi (spesso anche chiamato lipopolisaccaride) può causare infiammazione, febbre, IPO – o ipertensione e, in casi estremi, può portare a danni del tessuto e dell’organo che può diventare fatale. Gli importi dell’endotossina in prodotti farmaceutici, pertanto, sono strettamente regolamentati. Tra i metodi disponibili per il rilevamento di endotossina e quantificazione, il dosaggio di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) è comunemente usato in tutto il mondo. Mentre qualsiasi prodotto farmaceutico può interferire con il dosaggio LAL, nano-formulazioni rappresentano una sfida particolare per la loro complessità. Lo scopo di questa carta è quello di fornire una guida pratica ai ricercatori inesperti nella stima endotossine nei nanomateriali ingegnerizzati e formulato in nanoparticelle di farmaci. Nel presente documento, consigli pratici per l’esecuzione di tre formati LAL tra cui torbidità, cromogenico e gel-clot saggi sono discussi. Queste analisi possono essere utilizzate per determinare la contaminazione da endotossine adiuvanti, vaccini e farmaci basati sulle nanotecnologie.
Introduction
Un’endotossina è un blocco di costruzione della parete cellulare batterica gram-negativi1,2. Può attivare le cellule immunitarie a molto bassa (picogrammo) concentrazioni1,2. I mediatori proinfiammatori (eicosanoidi, leucotrieni, citochine, ecc.) prodotti dalle cellule in risposta a un’endotossina sono responsabili di febbre, ipotensione, ipertensione e problemi di salute più gravi tra cui guasto multiplo dell’organo 1 , 2 , 3. la gravità di immune-mediata effetti collaterali innescati l’endotossina dipende dalla sua potenza determinata dalla struttura e composizione dell’endotossina e misurato in unità internazionali dell’endotossina (IUs o EUs)3. Il numero di queste unità per chilogrammo di peso corporeo viene utilizzato per impostare una soglia dose pirogeno dell’endotossina. Questa dose è di che 5 EU/kg per i prodotti di farmaco somministrato per via tutte le rotte ma la via intratecale. Farmaci dosati per metro quadrato di superficie corporea, liquidi intraoculari, radiofarmaci e prodotti amministrato via intratecale hanno una dose di pirogeno soglia diversa, ovvero 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (dove V è la volume del prodotto destinato alla somministrazione) e 0,2 EU/kg, rispettivamente4. Più particolari circa la dose soglia pirogeno per vari prodotti farmaceutici e dispositivi sono forniti e discussi altrove4,5,6.
Animali variano ampiamente nella loro sensibilità alle reazioni dell’endotossina-mediata. Gli esseri umani, primati non umani e i conigli sono tra le specie più estremamente sensibili alle endotossine3. Per evitare l’endotossina-mediata effetti collaterali nei pazienti ed evitare conclusioni inesatte di tossicità preclinica e studi di efficacia, è essenziale rilevare e quantificare le endotossine in entrambe le formulazioni grado clinico e preclinico accuratamente. Diversi metodi attualmente disponibili possono realizzare questo compito. Uno di loro è il dosaggio di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), che è comunemente usato in tutto il mondo a schermo prodotti biomedicali per la potenziale contaminazione di endotossina pure per rilevare infezioni batteriche7,8,9. Il lisato viene preparato da amoebocytes, le cellule presenti nel sangue dei granchi a ferro di cavallo del Limulus polyphemus che risiedono nella sponda orientale del continente Nord America7. Interessante, ci sono alcune specie di granchi a ferro di cavallo (Tachypleus gigas e Tachypleus tridentatus) in Asia10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) è utilizzato in diversi paesi asiatici per la rilevazione dell’endotossina simile a come il Leone è usato in altri Pinti10. I lisati (LAL e TAL) contengono un gruppo di proteine che, al momento dell’attivazione, conferiscono l’attività della proteasi. Una di queste proteine, il cosiddetto fattore C viene attivata in caso di contatto con l’endotossina. C attivata fattore fende il fattore B, che a sua volta anche diventa una proteasi e si unirà un enzima pro-coagulazione per la produzione di un enzima coagulazione. Il risultato di questa catena di reazioni è la formazione di un gel, un aumento della torbidità del campione e, in presenza di un substrato cromogenico, l’aspetto di un prodotto colorato, che servono come base per gel-clot, torbidità e le analisi cromogeniche, rispettivamente. Mentre non esiste un formato obbligatorio di LAL, la US Food and Drug Administration (FDA) spiega la guida per a documento di industria, che in caso di discrepanza nei risultati del test tra diversi formati LAL, la decisione è presa basato sul dosaggio di gel-clot5 .
Molti prodotti chimici di laboratorio comunemente usati (ad es., EDTA) e farmaci noti prodotti (ad es., penicillina) interferire con LAL test11. L’interferenza viene di solito identificato valutando il recupero dell’endotossina standard a spillo a una concentrazione nota in una soluzione contenente il materiale di prova. Se il recupero dei picchi è inferiore al 50% o più del 200%, quindi il risultato del LAL test per il materiale di prova specificato non è valido a causa della inibizione o miglioramento, rispettivamente4. Formulazioni a base di nanotecnologia sono spesso complesse e interferiscano con la LAL attraverso una varietà di meccanismi12,13,14. Sono stati descritti molti approcci per superare l’interferenza: ricostituzione di campione in buffer specifici e tensioattivi, inattivazione della proteina da riscaldamento, distruzione di materiali cavi basata sui lipidi riscaldamento e integrando il campione con eccesso cationi bivalenti5,12,13,14,15. Inoltre sono stati descritti metodi alternativi per situazioni in cui l’interferenza di LAL non può essere superato: ELISA, una cella di reporter HEK-TLR4 linea dosaggio e spettrometria di massa16,17,18, 19.
Vengono descritte procedure sperimentali per lo svolgimento di gel-clot, torbidità e cromogenico LAL saggi. Queste analisi sono anche disponibili sul sito Web laboratorio di caratterizzazione di nanotecnologia (NCL)20 nei protocolli STE1.2 (torbidità LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) e STE1.4 (cromogenico LAL). Si consiglia di effettuare almeno due diversi formati per caratterizzare la stessa formulazione di nano. Quando risultati della torbidità e cromogenico LAL in disaccordo, i risultati di gel-coagulo sono considerati5. Quando in disaccordo risultati due formati di LAL, ulteriori studi utilizzando prova di attivazione di monociti (MAT) o test di coniglio pirogeni (RPT) per verificare LAL risultati sono condotti21. È importante notare che ogni metodo utilizzato per il rilevamento di endotossina e valutazione pirogenicità ha vantaggi e limitazioni21,22,23,24. Riconoscere i limiti della procedura utilizzata per caratterizzare una formulazione di nanotecnologia dato è essenziale per ottenere la giustificazione scientifica per l’uso della procedura ottima per quel nano-formulazione.
In questo studio, doxorubicina liposomiale pegilata è stato usato come una formulazione di nanoparticelle di modello. Questa formulazione è stata approvata dalla FDA nel 1995 e utilizzata per il trattamento di pazienti di cancro in tutto il mondo25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le informazioni fornite in questo protocollo sono stato descritto prima15,26 e si basa su diversi documenti normativi pubblicati da la US Food and Drug Administration (FDA o FDA) e farmacopea statunitense (USP)4 , 5 , 6 , 27ed è anche disponibile sul sito Web NCL20 nei protocolli STE1.2 (torbidità LAL), STE1.3 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto da fondi federali dal National Cancer Institute, National Institutes of Health, sotto contratto HHSN261200800001E. Il contenuto di questa pubblicazione non riflettono necessariamente le opinioni o le politiche del dipartimento di salute e servizi umani, né fa menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali, o organizzazioni implicano l’approvazione dal governo statunitense.
Materials
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
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