나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여
Summary
조작된 nanomaterials에 독의 검출 nanomedicine 분야에서 대상 과제 중 하나를 나타냅니다. 여기, 우리는 나노 입자에서 잠재적인 내 오염 추정 세 가지 다른 랄 형식으로 구성 된 프레임 워크를 설명 하는 사례 연구를 제시.
Abstract
제약 제품에 존재 하는 경우 (종종 라고도 lipopolysaccharide) 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 내 염증, 발열, 저자 또는 고혈압, 발생할 수 있습니다. 그리고, 극단적인 경우에 수 있습니다. 조직 및 장기 손상으로 이어질 수 있습니다. 치명적 된다. 따라서, 제약 제품에도의 양은 엄격 하 게 통제 된다. 도 탐지 및 정량화에 대 한 사용할 수 있는 방법, 중 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 주로 세계적으로 사용 됩니다. 어떤 제약 제품 랄 분석 결과 방해할 수 있습니다, 하는 동안 나노-공식 그들의 복잡으로 인해 특정 도전을 나타냅니다. 이 문서의 목적은 연구 설계 나노 소재 및 나노 공식화 약물 독 추정에 미숙한 실용적인 가이드를 제공 하. 여기, 탁도, 발을 포함 한 세 랄 포맷 응고 젤 분석 실험을 수행 하기 위한 실질적인 권장 사항은 설명 합니다. 이 분석 실험 나노기술 기반 약물 제품, 백신, 그리고 adjuvants 내 오염 확인을 사용할 수 있습니다.
Introduction
내 그람 음성 세균 세포 벽1,2의 빌딩 블록 이다. 그것은 매우에 면역 세포를 활성화할 수 있습니다 (picogram) 농도1,2낮은. 셀 한도에 대 한 응답에 의해 생성 된 proinflammatory 중재자 (cytokines, leukotrienes, eicosanoids, 등) 발열, 저 혈압, 고혈압, 그리고 여러 기관 실패를 포함 하 여 더 심각한 건강 문제에 대 한 책임은 1 , 2 , 3. 면역 중재 측면-효과도 의해 실행의 심각도 내 구성과 구조에 의해 결정 고도 국제 단위 (IUs 또는 EUs)3에서 측정 된 힘에 따라 달라 집니다. 이러한 단위 몸 무게의 킬로그램 당 수는 내 화성 복용량을 임계값을 설정 하는 데 사용 됩니다. 이 복용량은 EU/5kg 약 제품에 대 한 관리 를 통해 intrathecal 경로 하지만 모든 노선. 몸 표면, 안구 내부 체액, 방사성 의약품, 및 intrathecal 경로 관리 를 통해 제품의 평방 미터 당 약을 복용 하는 약 있다 다른 임계값 화성 복용량은 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (V가는 볼륨 관리를 위한 제품의), 그리고 0.2 EU/kg, 각각4. 다양 한 약품 및 장치에 대 한 임계값 화성 복용량에 대 한 자세한 내용은 제공 되 고 다른4,,56논의.
동물도 중재 반응에 그들의 감도에서 넓게 변화 한다. 인간, 비 인간 영장류, 그리고 토끼 독3가장 매우 민감한 종족 중입니다. 환자에도 중재 부작용을 피하기 위해 고의 전 임상 독성 및 효능 연구의 부정확 한 결론을 방지, 정확 하 게 감지 하 고 두 임상 및 전 임상 등급 정립에서 독을 계량 필수적 이다. 현재 사용할 수 있는 여러 가지 방법을이 작업을 달성할 수 있다. 그들 중 하나는 일반적으로 화면 생물 의학 제품에 잠재적인 내 오염 뿐만 아니라 세균 감염7,,89감지로 세계 전반 사용 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 이다. 셀 말굽 게 Limulus polyphemus 의 혈액에 존재 하는 lysate amoebocytes에서 준비 북미7대륙의 동쪽 해 안에 거주. 흥미롭게도, 말굽 게의 몇 가지 다른 종이 있다 (Tachypleus gigas 및 Tachypleus tridentatus) 아시아10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (탈)도 다른 cuntries10에 랄을 사용 하는 방법을 유사한의 검출에 대 한 여러 아시아 국가에서 사용 됩니다. (랄 및 탈) lysates 포함 단백질 활성화 시 부여 하는 프로 테아 제 활동의 그룹. 이러한 단백질, 소위 요소 C 중 하나 내와 접촉 시 활성화 됩니다. 활성화 인자 C 앞 요소 B는 또한 차례 차례로 되는 효소 응고 효소를 생산 하는 프로 응고 효소를 앞. 반응의이 체인의 결과 젤, 샘플 탁도 하 고, 비 기질, 젤 응고, 탁도, 그리고 비 분석 실험을 위한 기초 역할을, 착 색된 제품의 외관의 존재 증가의 형성 각각. 산업 문서, 다른 랄 포맷 간의 테스트 결과에 주문서, 결정은 한다 젤 응고 분석 결과5 기반은 필수 랄 형식이, 미국 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)에 대 한 지침에 설명 합니다. .
일반적으로 사용 되는 많은 실험실 화학 물질 (예., EDTA) 및 제품 (예: 페니실린) 방해 랄 알려진된 마약 분석 실험11. 방해는 일반적으로 테스트 자료를 포함 하는 솔루션으로 알려진된 농도에 아군도 표준의 복구를 평가 하 여 식별 됩니다. 스파이크 복구 50% 미만 또는 200% 이상에 대 한 분석 결과 LAL의 결과 다음 경우 주어진된 시험 체 억제 또는 향상, 각각4유효 하지 않습니다. 나노기술 기반 정립은 종종 복잡 하 고 메커니즘12,,1314의 다양 한 통해 랄을 방해. 많은 접근 방해를 극복 하기 위해 설명 되었습니다: 난방, 난방 및 과잉을 가진 샘플을 보완 하 여 지질 기반 투명 재료의 파괴에 의해 단백질 비활성화 특정 버퍼에 계면 활성 제, 샘플 재구성 divalent 양이온5,12,13,,1415. LAL 방해를 극복할 수 없을 때 상황에 대 한 대체 방법을 또한 설명 되었습니다: ELISA, HEK TLR4 기자 셀 라인 분석 결과, 및 질량 분석16,,1718, 19.
여기, 젤 응고, 탁도, 및 비 랄 분석 실험 수행에 대 한 실험 절차에 설명 되어 있습니다. 이 분석 실험 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고 랄)에 나노기술 특성화 연구소 (NCL) 웹사이트20 에서 사용할 수 있습니다 및 STE1.4 (비 랄). 같은 나노 제제의 특성을 두 개 이상 다른 포맷을 수행 하는 것이 좋습니다. 탁도 및 비 랄의 결과 동의 하지 않을 때 젤 응고 결과5를간주 됩니다. 두 랄 형식의 결과 동의 하는 경우21랄 확인 monocyte 활성화 테스트 (매트) 또는 토끼 pyrogen 테스트 (RPT)을 사용 하 여 연구 결과 추가 실시. 각 방법도 검색에 사용 되 고 pyrogenicity 평가 장점과 한계21,,2223,24에 중요 하다. 주어진된 나노기술 정립 하는 데 사용 하는 프로시저의 한계를 인식 그 나노 제제에 대 한 최적의 절차의 사용에 대 한 과학적 정당성을 얻기 위해 필수적 이다.
이 연구에서는 PEGylated 자주 독 소 루비 모델 나노 배합으로 사용 되었다. 이 1995 년에 미국 FDA에 의해 승인 하 고 암 환자 전세계25치료를 위해 사용.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 제공 하는 정보15,26 전에 설명 하고있다 고는 미국 식품 의약품 안전 청은 미국 식약청 (FDA) 및 미국 약전 (USP)4 에 의해 게시 된 여러 규제 문서 , 5 , 6 , 27, 그리고 또한 NCL 웹사이트20 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구는 국립 암 연구소에서 연방 기금에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회, HHSN261200800001E 계약. 이 발행물의 콘텐츠 뷰 또는 정책의는 부의 보건 및 인적 서비스, 반드시 반영 하지 않습니다도 무역 이름, 상용 제품의 언급지 않습니다 또는 조직 미국 정부에 의해 승인을 의미 합니다.
Materials
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
- Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
- Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).
- Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).
- US Pharmacopeia. . Bacterial Endotoxins Test. , (2011).
- FDA, U. . Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).
- FDA, U. . Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).
- Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).
- Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
- Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. , 13-18 (2015).
- Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL – a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).
- Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).
- Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).
- Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).
- Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).
- Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
- Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
- Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
- Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
- Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
- . NCL assay cascade Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015)
- Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).
- Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. , (2018).
- Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).
- Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33 (1), 47-53 (2016).
- Barenholz, Y. Doxil(R)–the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).
- Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
- FDA, U. . Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).
- Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).
- Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).
- Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).
- Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).
