나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여
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Summary
조작된 nanomaterials에 독의 검출 nanomedicine 분야에서 대상 과제 중 하나를 나타냅니다. 여기, 우리는 나노 입자에서 잠재적인 내 오염 추정 세 가지 다른 랄 형식으로 구성 된 프레임 워크를 설명 하는 사례 연구를 제시.
Abstract
제약 제품에 존재 하는 경우 (종종 라고도 lipopolysaccharide) 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 내 염증, 발열, 저자 또는 고혈압, 발생할 수 있습니다. 그리고, 극단적인 경우에 수 있습니다. 조직 및 장기 손상으로 이어질 수 있습니다. 치명적 된다. 따라서, 제약 제품에도의 양은 엄격 하 게 통제 된다. 도 탐지 및 정량화에 대 한 사용할 수 있는 방법, 중 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 주로 세계적으로 사용 됩니다. 어떤 제약 제품 랄 분석 결과 방해할 수 있습니다, 하는 동안 나노-공식 그들의 복잡으로 인해 특정 도전을 나타냅니다. 이 문서의 목적은 연구 설계 나노 소재 및 나노 공식화 약물 독 추정에 미숙한 실용적인 가이드를 제공 하. 여기, 탁도, 발을 포함 한 세 랄 포맷 응고 젤 분석 실험을 수행 하기 위한 실질적인 권장 사항은 설명 합니다. 이 분석 실험 나노기술 기반 약물 제품, 백신, 그리고 adjuvants 내 오염 확인을 사용할 수 있습니다.
Introduction
내 그람 음성 세균 세포 벽1,2의 빌딩 블록 이다. 그것은 매우에 면역 세포를 활성화할 수 있습니다 (picogram) 농도1,2낮은. 셀 한도에 대 한 응답에 의해 생성 된 proinflammatory 중재자 (cytokines, leukotrienes, eicosanoids, 등) 발열, 저 혈압, 고혈압, 그리고 여러 기관 실패를 포함 하 여 더 심각한 건강 문제에 대 한 책임은 1 , 2 , 3. 면역 중재 측면-효과도 의해 실행의 심각도 내 구성과 구조에 의해 결정 고도 국제 단위 (IUs 또는 EUs)3에서 측정 된 힘에 따라 달라 집니다. 이러한 단위 몸 무게의 킬로그램 당 수는 내 화성 복용량을 임계값을 설정 하는 데 사용 됩니다. 이 복용량은 EU/5kg 약 제품에 대 한 관리 를 통해 intrathecal 경로 하지만 모든 노선. 몸 표면, 안구 내부 체액, 방사성 의약품, 및 intrathecal 경로 관리 를 통해 제품의 평방 미터 당 약을 복용 하는 약 있다 다른 임계값 화성 복용량은 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (V가는 볼륨 관리를 위한 제품의), 그리고 0.2 EU/kg, 각각4. 다양 한 약품 및 장치에 대 한 임계값 화성 복용량에 대 한 자세한 내용은 제공 되 고 다른4,,56논의.
동물도 중재 반응에 그들의 감도에서 넓게 변화 한다. 인간, 비 인간 영장류, 그리고 토끼 독3가장 매우 민감한 종족 중입니다. 환자에도 중재 부작용을 피하기 위해 고의 전 임상 독성 및 효능 연구의 부정확 한 결론을 방지, 정확 하 게 감지 하 고 두 임상 및 전 임상 등급 정립에서 독을 계량 필수적 이다. 현재 사용할 수 있는 여러 가지 방법을이 작업을 달성할 수 있다. 그들 중 하나는 일반적으로 화면 생물 의학 제품에 잠재적인 내 오염 뿐만 아니라 세균 감염7,,89감지로 세계 전반 사용 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 이다. 셀 말굽 게 Limulus polyphemus 의 혈액에 존재 하는 lysate amoebocytes에서 준비 북미7대륙의 동쪽 해 안에 거주. 흥미롭게도, 말굽 게의 몇 가지 다른 종이 있다 (Tachypleus gigas 및 Tachypleus tridentatus) 아시아10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (탈)도 다른 cuntries10에 랄을 사용 하는 방법을 유사한의 검출에 대 한 여러 아시아 국가에서 사용 됩니다. (랄 및 탈) lysates 포함 단백질 활성화 시 부여 하는 프로 테아 제 활동의 그룹. 이러한 단백질, 소위 요소 C 중 하나 내와 접촉 시 활성화 됩니다. 활성화 인자 C 앞 요소 B는 또한 차례 차례로 되는 효소 응고 효소를 생산 하는 프로 응고 효소를 앞. 반응의이 체인의 결과 젤, 샘플 탁도 하 고, 비 기질, 젤 응고, 탁도, 그리고 비 분석 실험을 위한 기초 역할을, 착 색된 제품의 외관의 존재 증가의 형성 각각. 산업 문서, 다른 랄 포맷 간의 테스트 결과에 주문서, 결정은 한다 젤 응고 분석 결과5 기반은 필수 랄 형식이, 미국 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)에 대 한 지침에 설명 합니다. .
일반적으로 사용 되는 많은 실험실 화학 물질 (예., EDTA) 및 제품 (예: 페니실린) 방해 랄 알려진된 마약 분석 실험11. 방해는 일반적으로 테스트 자료를 포함 하는 솔루션으로 알려진된 농도에 아군도 표준의 복구를 평가 하 여 식별 됩니다. 스파이크 복구 50% 미만 또는 200% 이상에 대 한 분석 결과 LAL의 결과 다음 경우 주어진된 시험 체 억제 또는 향상, 각각4유효 하지 않습니다. 나노기술 기반 정립은 종종 복잡 하 고 메커니즘12,,1314의 다양 한 통해 랄을 방해. 많은 접근 방해를 극복 하기 위해 설명 되었습니다: 난방, 난방 및 과잉을 가진 샘플을 보완 하 여 지질 기반 투명 재료의 파괴에 의해 단백질 비활성화 특정 버퍼에 계면 활성 제, 샘플 재구성 divalent 양이온5,12,13,,1415. LAL 방해를 극복할 수 없을 때 상황에 대 한 대체 방법을 또한 설명 되었습니다: ELISA, HEK TLR4 기자 셀 라인 분석 결과, 및 질량 분석16,,1718, 19.
여기, 젤 응고, 탁도, 및 비 랄 분석 실험 수행에 대 한 실험 절차에 설명 되어 있습니다. 이 분석 실험 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고 랄)에 나노기술 특성화 연구소 (NCL) 웹사이트20 에서 사용할 수 있습니다 및 STE1.4 (비 랄). 같은 나노 제제의 특성을 두 개 이상 다른 포맷을 수행 하는 것이 좋습니다. 탁도 및 비 랄의 결과 동의 하지 않을 때 젤 응고 결과5를간주 됩니다. 두 랄 형식의 결과 동의 하는 경우21랄 확인 monocyte 활성화 테스트 (매트) 또는 토끼 pyrogen 테스트 (RPT)을 사용 하 여 연구 결과 추가 실시. 각 방법도 검색에 사용 되 고 pyrogenicity 평가 장점과 한계21,,2223,24에 중요 하다. 주어진된 나노기술 정립 하는 데 사용 하는 프로시저의 한계를 인식 그 나노 제제에 대 한 최적의 절차의 사용에 대 한 과학적 정당성을 얻기 위해 필수적 이다.
이 연구에서는 PEGylated 자주 독 소 루비 모델 나노 배합으로 사용 되었다. 이 1995 년에 미국 FDA에 의해 승인 하 고 암 환자 전세계25치료를 위해 사용.
Protocol
1입니다. 나노 샘플의 준비 준비 랄에 연구 샘플 학년 물. 샘플 pH 범위를 6-8 인 경우에, pyrogen 무료 수산화 나트륨 또는 염 산을 사용 하 여 pH를 조정 합니다. 랄을 사용 하 여 학년 물 연구 샘플의 여러 희석을 준비 합니다. 높은 희석은 최대 유효 희석 (MVD)를 초과 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. MVD 추정에 대 한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오. 2. 랄 형식 사이 시 약 일반의 준비 LAL 시 약 물 pyrogen 무료를 사용 하 여 0.1 n.의 농도에서 작업 솔루션을 준비 하는 집중된 수산화 나트륨 재고 희석 LAL 시 약 물 pyrogen 무료를 사용 하 여 집중된 염 산 주식을 희석 하 고 0.1 n.의 최종 농도에 작업 솔루션을 준비 제어 표준도 (CSE)의 준비 제조업체에서 제공 하는 분석의 인증서에 따라 CSE reconstitute참고: 인증서에 제공 하는 정보에 관한 중요 사항에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오. 카탈로그 번호 및 다른 랄 형태로 특정된 CSE 공식의 응용 프로그램에 대 한 세부 사항에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. LAL 시 약의 준비 LAL 시 약 제조업체에서 제공 하는 분석의 인증서에 따라 reconstitute참고: LAL 시 약 준비에 관한 중요 한 세부 사항에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오. 카탈로그 번호 및 다른 랄 형태로 주어진된 LAL 시 약 배합의 응용 프로그램에 대 한 세부 사항에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 3. 탁 랄 분석 결과 교정 표준의 준비 Using 랄 학년 물 900 µ L, CSE의 100 µ L, 많은 중간 희석 교정 0.001에서 1 EU/mL의 농도 범위와 표준의 준비를 활성화 하는 데 필요한 준비. 첫 번째 튜브 라벨 고 각 관으로 랄 급 물 900 μ를 추가 합니다. 1EU/mL의 농도 함께 교정 표준 준비 10 EU/mL solutionn의 100 μ를 추가 합니다. 3 더 낮은 교정 표준 준비 위에서 설명한 대로 직렬 10 희석을 반복 합니다. 1 EU/mL 0.001에서 배열 하는 4 개의 교정 표준 준비 된 확인 합니다. 품질 컨트롤의 준비 1 EU/mL CSE 솔루션의 50 µ L 랄 급 물 950 µ L 결합 하 여 0.05 EU/mL 품질 관리를 준비 합니다.참고: 컨트롤 준비에 관한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오. 금지/향상 (IEC) 컨트롤의 준비 1 EU/mL CSE 솔루션의 25 µ L의 주어진된 희석에 테스트 접한 475 µ L를 결합 하 여 0.05 EU/mL의 농도와 IEC를 준비 합니다.참고: 추가 정보에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오. 실험 절차 약 30 분 사전에 설정 하 여 워밍업 악기를 허용 합니다. 설정 검출 파장 660 nm이 탁도 랄에 대 한 적절 한입니다. 사용자 이름 및 암호를 입력 하 여 로그인. 컴퓨터 화면에 해당 아이콘을 클릭 하 여 소프트웨어 (테이블의 재료)를 엽니다. 소프트웨어 홈 화면에 데이터 수집 을 선택 합니다. 일반 탭에서 해당 공간으로 홈 화면에 테스트 ID와 데이터 그룹 정보를 입력 합니다. 하드웨어 탭을 클릭 하 여 드롭다운 메뉴에서 악기 종류를 선택 합니다. 설정 검출 파장 660 nm이 적합 chosing에 의해 탁 랄 랄 탁도 방법. 일련 번호, 시스템 ID 및 직렬 포트 정보는 화면에 표시를 확인 합니다. 확인을 클릭 합니다. 확인 한번 더 확인을 클릭 합니다. 샘플 테스트는 동일한 순서에 샘플 ID를 입력 합니다. 기본 단추를 사용 하 여 부정적인 제어, 표준 곡선 및 테스트 샘플 입력. 각 샘플에 대 한 중복 튜브를 준비 하 고 미리 레이블이 유리 튜브로 200 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 부정적인 제어 (물), 교정 표준, 품질 관리, IEC 및 테스트 나노 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다. 첫 번째 테스트 유리병, 그것을 짧게, 그리고 테스트에 삽입 슬롯 악기 회전 목마에 소용돌이를 50 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 LAL 시 약의 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다. 1:1 비율을 사용 하는 경우 LAL 시 약의 볼륨은 100 µ L입니다. 다른 샘플에 대 한 위에서 설명한 절차를 반복 합니다. 프로세스는 한 번에 하나씩 샘플링합니다.참고: 자세한 내용은 토론 섹션을 참조 하십시오. 4. 비 랄 교정 표준의 준비 Using 랄 학년 물 900 µ L, CSE의 100 µ L, 많은 중간 희석 1 EU/mL의 농도와 교정 표준의 준비를 활성화 하는 데 필요한 준비. Using 900 µ L 랄 급 물과 표준 1 EU/mL 교정의 100 µ L, 0.1 EU/mL의 농도에서 두 번째 교정 표준 준비. 두 더 낮은 교정 표준 준비 위에서 설명한 대로 직렬 10 희석을 반복 합니다. 1 EU/mL 0.001에서 배열 하는 4 개의 교정 표준 준비 된 확인 합니다. 품질 컨트롤의 준비입니다. 1 EU/mL CSE 솔루션의 50 µ L 랄 급 물 950 µ L 결합 하 여 0.05 EU/mL 품질 관리를 준비 합니다.참고: 컨트롤 준비에 관한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오. 금지/향상 (IEC) 컨트롤의 준비 1 EU/mL CSE 솔루션의 25 μ 테스트 접한의 475 μ와 결합 하 여 0.05 EU/mL를 준비 합니다.참고: 추가 정보에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오. 실험 절차 약 30 분 사전에 설정 하 여 워밍업 악기를 허용 합니다. 설정 검출 파장 405 nm이 탁도 랄에 대 한 적절 한입니다. 컴퓨터 화면에 해당 아이콘을 클릭 하 여 소프트웨어를 엽니다. 사용자 이름 및 암호를 입력 하 여 로그인. 소프트웨어 홈 화면에 데이터 수집 을 선택 합니다. 일반 탭에서 해당 공간으로 홈 화면에 테스트 ID와 데이터 그룹 정보를 입력 합니다. 하드웨어 탭을 클릭 하 여 드롭다운 메뉴에서 악기 종류를 선택 합니다. 악기를 선택 하십시오. 일련 번호, 시스템 ID 및 직렬 포트 정보는 화면에 표시를 확인 합니다. 확인을 클릭 합니다. 확인 한번 더 확인을 클릭 합니다. 샘플 테스트는 동일한 순서에 샘플 ID를 입력 합니다. 기본 단추 부정적인 제어 입력을 사용 하 여 표준 곡선 및 테스트 샘플. 각 샘플에 대 한 중복 튜브를 준비 하 고 미리 레이블이 유리 튜브로 200 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 부정적인 제어 (물), 교정 표준, 품질 관리, IEC 및 테스트 나노 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다. 첫 번째 테스트 유리병, 그것을 짧게, 그리고 테스트에 삽입 슬롯 악기 회전 목마에 소용돌이를 50 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 LAL 시 약의 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다. 1:1 비율을 사용 하는 경우 LAL 시 약의 볼륨은 100 µ L입니다. 다른 샘플에 대 한 위에서 설명한 절차를 반복 합니다. 프로세스는 한 번에 하나씩 샘플링합니다. 5. 젤-응고 랄 참고:이 분석 결과 시각적 관찰 및 반응 관에 응고의 검출에 따라 샘플에서 독의 존재를 식별 합니다. 아래 실험 단계를 설명 합니다. 벤치 시트를 사용 하 여 결과 기록. 이 벤치 시트는 필수, 그리고 시험 결과 기록 하는 다른 방법을 받아들일 수 있습니다. 같은 벤치 시트의 예로 독자의 편의 위해 보충 자료 제공 됩니다. 람다 (l) 젤 응고 시험의 감도 이며 0.03 EU/mL입니다. 분석 된 테스트 샘플의 수를 수용 하는 데 필요한 많은 반응 튜브 라벨. 1 단계, 2 단계 분석 결과의 3 단계에서 사용 하는 복제의 수에 대 한 자세한 내용은 벤치 시트를 참조 하십시오. 튜브 당 물, 컨트롤 또는 테스트 샘플의 aliquot 100 μ. 최종 농도 4λ는 CSE를 준비 합니다. 2λ의 CSE의 최종 농도 달성 하기 위해 물 또는 테스트 샘플의 100 μ와 위에서 언급 한 기준의 100 μ를 결합 한다. 람다와 반 람다 및 1/4 람다 3 번 이상 반복 합니다. 물 목욕에서 온도 37 ° c. 추가 테스트 튜브, 소용돌이 짧게 당 lysate의 100 μ 고 모든 튜브 랙 1 h 물 목욕 합니다. 부드러운 모션으로 튜브를 반전. “+” (상사 병)를 사용 하 여 수동으로 레코드 결과 또는 “-” (응고 또는 느슨한 응고) 벤치 시트에. USP 내기 854에 따라 분석 하십시오; 벤치 시트를 사용 하 여 자료를 지원
Representative Results
LAL 분석 실험에서이 테스트 한 후 생성 된 데이터의 예는 표 1에 표시 됩니다. PEGylated 자주 독 소 루비 5 희석에서 비 랄와 방해. 그러나,이 간섭 큰 희석에 의해 극복 됐다. 50과 200% 사이 스파이크 복구 때이 희석 탁 랄에에서 5에서 뿐만 아니라 희석 50 및 탁도 및 비 랄, 500에서 테스트 되었습니다. 희석 비율 조정, 결과 두 분석 실험에 희석 사이 일관 했다. 또한…
Discussion
이 프로토콜에서 제공 하는 정보15,26 전에 설명 하고있다 고는 미국 식품 의약품 안전 청은 미국 식약청 (FDA) 및 미국 약전 (USP)4 에 의해 게시 된 여러 규제 문서 , 5 , 6 , 27, 그리고 또한 NCL 웹사이트20 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구는 국립 암 연구소에서 연방 기금에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회, HHSN261200800001E 계약. 이 발행물의 콘텐츠 뷰 또는 정책의는 부의 보건 및 인적 서비스, 반드시 반영 하지 않습니다도 무역 이름, 상용 제품의 언급지 않습니다 또는 조직 미국 정부에 의해 승인을 의미 합니다.
Materials
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
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Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).