Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)
Summary
Détection d’endotoxines dans les nanomatériaux représente un des grands défis dans le domaine de la nanomédecine. Nous présentons ici une étude de cas décrivant le cadre composé de trois formats différents de LAL pour évaluer la contamination potentielle d’endotoxines dans les nanoparticules.
Abstract
Lorsqu’ils sont présents dans les produits pharmaceutiques, une endotoxine de composant de paroi cellulaire bactérienne Gram négative (souvent aussi appelée lipopolysaccharide) peut provoquer une inflammation, fièvre, hypo – ou hypertension et, dans certains cas extrêmes, peut conduire à des dommages des tissus et des organes qui peuvent devenir fatale. Les montants de l’endotoxine dans les produits pharmaceutiques, par conséquent, sont strictement réglementés. Parmi les méthodes disponibles pour l’endotoxine détection et la quantification, le dosage de Limulus Amébocytes Lysate (LAL) est couramment utilisé dans le monde entier. Alors que tous les produits pharmaceutiques peuvent interférer avec le test LAL, nano-formulations représentent un défi particulier en raison de leur complexité. Le but de cet article est de fournir un guide pratique aux chercheurs inexpérimentés dans l’estimation des endotoxines en nanomatériaux et nanoparticules-formulé des médicaments. Dans les présentes, des recommandations pratiques pour l’exécution de trois formats LAL, y compris la turbidité, épreuve à développement chromogène et essais de gel-caillot sont discutées. Ces tests peuvent servir à déterminer la contamination d’endotoxines dans les médicaments basés sur la nanotechnologie, des vaccins et des adjuvants.
Introduction
Une endotoxine est un bloc de construction de la paroi cellulaire bactérienne Gram négative1,2. Il peut activer les cellules immunitaires à très faible (picogramme) concentrations1,2. Les médiateurs pro-inflammatoires (cytokines, leucotriènes, eicosanoïdes, etc.) produites par les cellules en réponse à une endotoxine sont responsables de la fièvre, hypotension, hypertension et plus graves problèmes de santé, notamment une défaillance multiviscérale 1 , 2 , 3. la gravité des médiation immunitaire-effets secondaires provoqués par l’endotoxine dépend de sa puissance déterminée par la composition de l’endotoxine et structure et mesurée en unités d’endotoxine international (IUs ou EUs)3. Le nombre de ces unités par kilogramme de poids corporel est utilisé pour définir la dose seuil d’endotoxine pyrogène. Cette dose est que 5 EU/kg pour les médicaments administrés par toutes les voies, mais la voie intrathécale. Les médicaments dosés par mètre carré de surface corporelle, liquides intraoculaires, radiopharmaceutiques et produits administrés via intrathécale route ont une dose seuil différent pyrogène, c’est-à-dire 100 EU/m2, 0,2 UE/mL, EU 175/V (où V est la volume du produit destiné à l’administration) et 0,2 EU/kg, respectivement4. Plus de détails sur la dose seuil de pyrogène pour divers produits pharmaceutiques et dispositifs sont fournies et traitées ailleurs4,5,6.
Animaux varie grandement dans leur sensibilité aux réactions induite par l’endotoxine. Les humains, les primates non humains et les lapins sont parmi les espèces de plus extrêmement sensibles aux endotoxines3. Pour éviter les induite par l’endotoxine des effets secondaires chez les patients et éviter des conclusions inexactes de toxicité préclinique et les études d’efficacité, il est essentiel de correctement détecter et quantifier les endotoxines dans les deux formulations de grade clinique et préclinique. Plusieurs méthodes actuellement disponibles peuvent réaliser cette tâche. L’un d’eux est le test de Limulus Amébocytes Lysate (LAL), qui est couramment utilisé dans le monde entier à l’écran des produits biomédicaux pour l’éventuelle contamination d’endotoxine ainsi quant à détecter des infections bactériennes7,8,9. Le lysat est préparé à partir des amoebocytes, les cellules présentent dans le sang du limule Limulus polyphemus résidant sur la rive est du continent de l’Amérique du Nord,7. Fait intéressant, il y a quelques espèces différentes de limules (Tachypleus gigas et tridentatus Tachypleus) en Asie,10. Le lysat Tachypleus des Amébocytes (TAL) est utilisé dans plusieurs pays d’Asie pour la détection de l’endotoxine semblable à comment la LAL est utilisé dans une autre série de10. Les lysats (LAL et TAL) contiennent un groupe de protéines qui, lors de leur activation, confèrent une activité protéase. Une de ces protéines, le facteur de ce que l’on appelle C est activée au contact de l’endotoxine. C facteur activée Clive facteur B, qui à son tour devient une protéase et fend une enzyme coagulation pro afin de produire une enzyme de la coagulation. Le résultat de cette chaîne de réactions est la formation d’un gel, une augmentation de la turbidité de l’échantillon et, en présence d’un substrat chromogène, l’apparence d’un produit coloré, qui servent de base pour gel-caillot, turbidité et épreuves chromogènes, respectivement. Alors qu’il n’y a aucun format obligatoire de LAL, la Food and Drug Administration (FDA) explique les directives relatives à l’industrie, qu’en cas de divergence dans les résultats entre différents formats LAL, la décision est prise fondé sur l’essai de gel-caillot5 .
Beaucoup utilisés couramment des produits chimiques de laboratoire (p. ex.., EDTA) et essais de médicament connu produits (par exemple, la pénicilline) interfèrent avec la LAL11. L’interférence est habituellement identifiée en évaluant la récupération de l’endotoxine standard dopé à une concentration connue dans une solution contenant la substance d’essai. Si le recouvrement de spike est inférieure à 50 % ou plus de 200 %, puis le résultat de la LAL assay pour la substance d’essai donnée n’est pas valide en raison de l’inhibition ou le développement, respectivement4. Formulations à base de nanotechnologie sont souvent complexes et interfèrent avec la LAL au moyen de divers mécanismes12,13,14. Plusieurs approches ont été décrites pour surmonter l’interférence : reconstitution d’échantillon en tampons spécifiques et des agents tensio-actifs, inactivation des protéines en chauffant, la destruction des lipides à base de matériaux creux en chauffage et en complétant l’échantillon avec excès les cations divalents5,12,13,14,15. Méthodes alternatives pour les situations où l’interférence LAL ne puisse être surmonté ont également été décrits : ELISA, une cellule de journaliste HEK-TLR4 line test et spectrométrie de masse16,17,18, 19.
Dans les présentes, les procédures expérimentales pour tenue de gel-caillot, turbidité et chromogénique LAL dosages sont décrites. Ces tests sont également disponibles sur le laboratoire de caractérisation de nanotechnologie (NCL) site Web20 protocoles STE1.2 (turbidité LAL), STE1.3 (gel-caillot LAL) et STE1.4 (chromogénique LAL). Il est recommandé d’effectuer au moins deux différents formats afin de caractériser la même formulation-nano. Lorsque les résultats de la turbidité et chromogénique LAL sont en désaccord, les résultats de gel-caillot sont considérés5. Lorsque les résultats des deux formats LAL sont en désaccord, autres études utilisant un test d’activation des monocytes (MAT) ou sur lapin pyrogène (RPT) pour vérifier les LAL constatations sont effectué21. Il est important de noter que chaque méthode utilisée pour la détection d’endotoxines et évaluation de pyrogénicité a avantages et limites21,22,23,24. Reconnaissant les limites de la méthode utilisée pour caractériser une formulation donnée nanotechnologie est essentiel pour obtenir une justification scientifique pour l’utilisation de la procédure optimale pour cette nano-formulation.
Dans cette étude, doxorubicine liposomale pégylé a été utilisé comme une préparation de nanoparticules de modèle. Cette formulation a été approuvée par la FDA en 1995 et utilisée pour le traitement du cancer patients dans le monde entier25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les informations fournies dans le présent protocole a été décrit avant15,26 et s’appuie sur plusieurs documents de réglementation publiées par la US Food, Drug Administration (US FDA ou FDA) et United States Pharmacopoeia (USP)4 , 5 , 6 , 27et est également disponible sur le site Web NCL20 protocoles STE…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été financée par des fonds fédéraux de l’Institut National du Cancer, National Institutes of Health, sous contrat HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les vues ou les politiques du département de Health and Human Services, ni mentionne des noms commerciaux, des produits commerciaux, ou organisations impliquent l’approbation par le gouvernement américain.
Materials
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
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