Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays
Summary
Erkennung von Endotoxinen in Nanomaterialien stellt eine der großen Herausforderungen im Bereich der Nanomedizin. Hier präsentieren wir Ihnen eine Fallstudie, die beschreibt den Rahmen, bestehend aus drei verschiedenen LAL-Formaten, mögliche Endotoxin-Kontamination in Nanopartikel zu schätzen.
Abstract
Wenn Sie in pharmazeutischen Produkten, eine gramnegative bakterielle Zellwand Komponente Endotoxin (oft auch als Lipopolysaccharid) kann dazu führen, dass Entzündungen, Fieber, Hypo- oder Hypertonie, und, in extremen Fällen kann zu führen Gewebe und Organ-Schäden, die möglicherweise werden Sie tödlich. Die Beträge von Endotoxin in pharmazeutischen Produkten sind daher streng geregelt. Unter den Methoden für die Endotoxin-Erkennung und Quantifizierung ist der Test Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) weltweit verbreitet. Während der LAL-Test Arzneimittel stören kann, stellen Nano-Formulierungen aufgrund ihrer Komplexität eine besondere Herausforderung dar. Dieses Papier soll eine praktische Anleitung zum Forscher unerfahrenen bei der Abschätzung der Endotoxine in Nanomaterialien und Nanopartikel formuliert Drogen zu bieten. Hier werden praktische Empfehlungen für die Durchführung von drei LAL-Formate einschließlich Trübung, chromogenen und Gel-Clot Assays diskutiert. Diese Tests können zur Endotoxin-Kontamination in Nanotechnologie-basierte Medikamente, Impfstoffe und Adjuvantien herangezogen werden.
Introduction
Ein Endotoxin ist ein Baustein der gramnegativen bakteriellen Zellwand1,2. Es kann aktivieren Immunzellen auf sehr niedrige (Picogram) Konzentrationen1,2. Die proinflammatorischen Mediatoren (Zytokine, Leukotrienen, Eikosanoide, etc.) produziert von den Zellen als Reaktion auf ein Endotoxin sind verantwortlich für Fieber, Hypotonie, Hypertonie und schweren gesundheitlichen Problemen einschließlich Multiorganversagen 1 , 2 , 3. immunvermittelte Nebenwirkungen ausgelöst durch das Endotoxin Schweregrad auf seine Potenz durch die Endotoxin-Zusammensetzung und Struktur bestimmt und in internationalen Endotoxin Units (IUs oder EUs)3gemessen. Die Anzahl dieser Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht wird verwendet, um eine pyrogene Schwellendosis von Endotoxin festgelegt. Diese Dosis ist 5 EU/kg für Arzneimittel über alle Routen aber die intrathekale Route verabreicht. Pro Quadratmeter Körperoberfläche, intraokulare Flüssigkeiten, radioaktive Arzneimittel und Produkte verabreicht über intrathekale Route dosiert Medikamente haben eine unterschiedliche pyrogene Schwellendosis, die 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (wo V ist die Volumen des Produktes für die Verwaltung), und 0,2 EU/kg, bzw.4. Weitere Details über die pyrogene Schwellendosis für verschiedene Medikamente und Geräte werden zur Verfügung gestellt und4,5,6an anderer Stelle erläutert.
Tiere sind sehr unterschiedlich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin-vermittelten Reaktionen. Menschen, nicht-menschlichen Primaten und Kaninchen sind unter den meisten extrem empfindlich auf Endotoxine3Arten. Endotoxin-vermittelte Nebenwirkungen bei Patienten zu vermeiden und zu verhindern, dass falsche Schlussfolgerungen der präklinischen Toxizität und Wirksamkeitsstudien, ist es wichtig, genau zu erkennen und zu quantifizieren, Endotoxine in beiden klinischen und präklinischen Grade Formulierungen. Einige derzeit verfügbare Methoden können diese Aufgabe erreichen. Eine davon ist die Probe, Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), die häufig, weltweit zu Bildschirm biomedizinische Produkte für die mögliche Endotoxin Verunreinigung sowie verwendet wird zu bakteriellen Infektionen7,8,9zu erkennen. Die lysate aus Amöbozyten bereit ist, die Zellen im Blut von Pfeilschwanzkrebse Limulus Polyphemus präsentieren mit Wohnsitz in der Ostküste des Kontinents Nordamerika7. Interessanterweise gibt es ein paar verschiedene Arten von Pfeilschwanzkrebse (Tachypleus Gigas und Tachypleus Tridentatus) in Asien10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) wird in mehreren asiatischen Ländern verwendet, für den Nachweis von Endotoxin ähnlich wie die LAL in anderen Cuntries10verwendet wird. Die Lysaten (LAL und TAL) enthalten eine Gruppe von Proteinen, die bei Aktivierung Protease-Aktivität zu verleihen. Eines dieser Proteine, die so genannte Faktor C wird bei Kontakt mit Endotoxin aktiviert. Aktivierten Faktor C spaltet Faktor B, die wiederum auch wird eine Protease und bindet sich ein Pro-gerinnende Enzym zu einer Blutgerinnung Enzym herzustellen. Das Ergebnis dieser Kette von Reaktionen ist die Bildung eines Gels, eine Erhöhung der in der Probe Trübung und in Anwesenheit von einem chromogenen Substrat, das Erscheinungsbild der ein farbiges Produkt, das als Grundlage für Gel-Clot, Trübung und chromogenen Tests dienen, bzw.. Zwar gibt es keine verbindlichen LAL-Format, die US Food and Drug Administration (FDA) erklärt in der Anleitung für Papier, Industrie, daß im Falle von Abweichungen in den Testergebnissen zwischen verschiedenen LAL-Formaten, die Entscheidung getroffen wird anhand der Gel-Clot-Assay5 .
Viele gängigen Laborchemikalien (zB., EDTA) und bekannte Droge Produkte (z. B. Penicillin) LAL stören assays11. Der Eingriff wird in der Regel durch Beurteilung der Erholung von der Endotoxin standard versetzt in einer bekannten Konzentration in einer Lösung, die das Testmaterial identifiziert. Wenn die Spitze Erholung weniger als 50 % oder mehr als 200 %, dann das Ergebnis der LAL assay für ist die gegebenen Testmaterial durch Hemmung oder Verstärkung, bzw.4ungültig. Nanotechnologie-basierte Formulierungen sind oft komplex und stören die LAL durch eine Vielzahl von Mechanismen12,13,14. Viele Ansätze sind beschrieben worden, um die Störungen zu überwinden: Probe Rekonstitution in speziellen Puffer und Tensiden, Protein-Inaktivierung durch Erhitzen, Vernichtung von Lipid-basierte hohl Material durch Erhitzen und Ergänzung der Probe mit Selbstbeteiligung zweiwertigen kationen5,12,13,14,15. Alternative Methoden für Situationen, in denen LAL Störungen überwunden werden kann sind auch beschrieben worden: ELISA, ein HEK-TLR4 Reporter Cell line Assay und Massenspektrometrie16,17,18, 19.
Experimentelle Verfahren für die Durchführung von Gel-Clot, Trübung und chromogenen LAL-Assays sind hier beschrieben. Diese Tests sind auch auf die Nanotechnologie Charakterisierung Lab (NCL) Webseite20 in Protokollen STE1.2 (Trübung LAL), STE1.3 (Gel-Clot LAL) und STE1.4 (chromogene LAL). Es wird empfohlen, mindestens zwei verschiedene Formate zur Charakterisierung der gleichen Nano-Formulierung durchzuführen. Wenn Ergebnisse der Trübung und chromogenen LAL nicht einverstanden sind, gelten die Gel-Clot Ergebnisse5. Wenn die Ergebnisse von zwei LAL Formaten nicht einverstanden sind, durchgeführt21zusätzliche Studien mit Monocyte Aktivierung Test (MAT) oder Kaninchen Pyrogentest (RPT), um LAL zu überprüfen sind. Es ist wichtig zu beachten, dass jede Methode Endotoxin-Erkennung und Pyrogenität Bewertung Vorteile und Einschränkungen21,22,23,24 hat. Grenzen des Verfahrens verwendet, um eine gegebene Nanotechnologie Formulierung charakterisieren zu erkennen ist wichtig, wissenschaftliche Rechtfertigung für die Anwendung des Verfahrens für die Nano-Formulierung optimal erhalten.
In dieser Studie wurde pegylierte liposomale Doxorubicin als Modell Nanopartikel Formulierung verwendet. Diese Formulierung wurde 1995 von der US-Zulassungsbehörde FDA genehmigt und zur Behandlung von Krebs-Patienten weltweit25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Informationen in diesem Protokoll ist beschrieben worden, vor15,26 und stützt sich auf mehrere regulatorischer Dokumente, herausgegeben von der US Food and Drug Administration (FDA oder FDA) und Vereinigte Staaten Arzneibuch (USP)4 , 5 , 6 , 27, und ist auch auf den NCL Webseite20 Protokolle STE1.2 (Trübung…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde unterstützt durch Bundesmittel aus dem National Cancer Institute, National Institutes of Health, vertraglich HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health And Human Services, noch erwähnt von Handelsnamen, kommerzielle Produkte oder Organisationen die Billigung der US-Regierung.
Materials
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
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