Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus
Summary
Обнаружения эндотоксинов в инженерии наноматериалов представляет собой один из Гранд вызовы в области наномедицины. Здесь мы представляем тематическое исследование, которое описывает платформу, состоящий из трех различных форматов Лал оценить потенциальное загрязнение эндотоксина в наночастиц.
Abstract
Когда присутствует в фармацевтической продукции, грамотрицательных бактериальных клеточных стенок компонент эндотоксина (часто также называют липополисахарида) может вызвать воспаление, лихорадка, гипо – или гипертензия и, в крайних случаях, может привести к повреждения тканей и органов, которые может стать смертельным. Таким образом, количество эндотоксина в фармацевтической продукции, строго регламентированы. Среди методов, доступных для обнаружения эндотоксинов и количественной оценки пробирного Limulus Lysate Amoebocyte (Лал) широко используется во всем мире. Хотя любой фармацевтический продукт может мешать Лал assay, нано составы представляют собой особую проблему из-за их сложности. Этот документ призван служить практическим руководством для исследователей неопытных в оценке эндотоксинов в инженерии наноматериалов и сформулированы наночастиц наркотиков. Здесь обсуждаются практические рекомендации для выполнения трех Лал форматов, включая мутность, Хромогенный и гель сгусток анализов. Эти анализы могут использоваться для определения эндотоксина загрязнения на основе нанотехнологий лекарственных препаратов, вакцин и адъювантов.
Introduction
Эндотоксина является строительным блоком грамотрицательных бактериальных клеточных стенок1,2. Он может активировать клетки иммунной системы в очень низкой концентрации (пикограмм)1,2. Провоспалительных медиаторов (цитокинов, лейкотриенов, эйкозаноидов, и т.д.) производятся клетками в ответ на эндотоксина отвечают за лихорадка, гипотония, гипертония и более серьезные проблемы здравоохранения, включая несколько полиорганной недостаточности 1 , 2 , 3. тяжесть иммунной опосредованного побочных эффектов, вызванных эндотоксина зависит от его потенции определяется эндотоксина состав и структура и измеряется в международных эндотоксина единиц (IUs или EUs)3. Количество этих единиц на килограмм массы тела используется для задания порога пирогенных дозы эндотоксина. Эта доза является 5 ЕС/кг для лекарственных средств осуществляется через все маршруты но Интратекальное маршрут. Препараты, дозированной на квадратный метр поверхности тела, внутриглазной жидкости, радиофармацевтические препараты и продукты управляемых через Интратекальное маршрута имеют разные порог пирогенных дозу, которая составляет 100 ЕС/м2, 0,2 ЕС/мл, 175 ЕС/V (где V- объем продукта, предназначенные для администрирования) и 0,2 ЕС/кг, соответственно4. Подробнее о порог пирогенных дозы для различных лекарственных средств и устройств предоставляются и обсуждаться в другом месте4,5,6.
Животные отличаются в их чувствительность к эндотоксинов опосредованной реакций. Среди наиболее чрезвычайно чувствительны к эндотоксинов3видов людей, нечеловеческих приматов и кроликов. Чтобы избежать эндотоксинов опосредованной побочных эффектов у пациентов и предотвратить неточные выводы доклинических токсичности и эффективности исследований, важно для точного выявления и количественной оценки эндотоксинов в обе формулировки доклинические и клинические класса. Несколько имеющихся в настоящее время методов можно добиться выполнения этой задачи. Одним из них является assay Limulus Lysate Amoebocyte (Лал), который широко используется во всем мире для экрана биомедицинских продуктов для потенциальных эндотоксина загрязнения, а также относительно выявления бактериальных инфекций7,8,9. Lysate готовится из amoebocytes, клетки присутствует в крови подковы крабов Limulus Полифема проживающих в Восточном берегу континента Северной Америке7. Интересно, что есть несколько различных видов подковы крабов (Tachypleus gigas и Tachypleus tridentatus) в Азии10. Tachypleus Lysate Amoebocyte (Таль) используется в нескольких странах Азии для обнаружения эндотоксинов аналогичны как Лал используется в других cuntries10. Лизатов (Лал и Таль) содержат группы белков, которые после активации предоставляют активности протеаз. Один из этих белков, так называемый фактор C активируется при контакте с эндотоксин. Активированный фактор C расщепляет фактор B, который в свою очередь также становится протеазы и расщепляет про свертывания фермента производить фермент свертывания крови. Результатом этой цепи реакций является формирование гель, увеличение образца мутности и, при наличии Хромогенный субстрат, появление цветных продукта, которые служат основой для гель сгусток, мутность и хромогенных анализов, соответственно. Пока не существует обязательной Лал формата, США продуктов питания и медикаментов (FDA) объясняет в руководстве для промышленности документа, что в случае расхождения в результатах теста между различными форматами Лал, решение принимается на основании гель сгусток assay5 .
Многие часто используемые Лабораторные химикаты (например., ЭДТА) и известных наркотиков продуктов (например, пенициллин) вмешиваться в Лал assays11. Вмешательство обычно определяется путем оценки восстановления стандартных эндотоксина шипами в известных концентрациях в решение, содержащее тестовый материал. Если Спайк восстановления менее чем 50% или более чем на 200%, то в результате Лал проба для данного испытания материал является недопустимым из-за торможения или повышение, соответственно4. Составы на основе нанотехнологий часто сложны и мешать Лал через различные механизмы12,,1314. Были описаны многие подходы для преодоления вмешательства: пример воссоздания в конкретных буферов и ПАВ, инактивация белка путем нагревания, уничтожение липидов-материалов на основе полых путем нагрева и дополняющего образца с избытком двухвалентной катионов5,12,13,14,15. Также были описаны альтернативные методы для ситуаций, когда Лал вмешательство не может преодолеть: ELISA, мобильный репортер ГЭС-TLR4 линия пробирного и масс-спектрометрии16,,1718, 19.
Здесь описаны экспериментальной процедуры для проведения гель сгусток, мутность и хромогенных Лал анализов. Эти анализы также доступны на веб-сайт Лаборатории характеристика нанотехнологий (NCL)20 в протоколах STE1.2 (мутность Лал), STE1.3 (гель сгусток Лал) и STE1.4 (хромогенных Лал). Рекомендуется проводить по крайней мере два различных форматов характеризовать же нано разработке. Когда результаты мутность и хромогенных Лал согласны, гель сгусток результаты считаются5. Когда результаты двух форматов Лал согласны, дополнительные исследования с использованием Моноцит активации тест (мат) или кролик пирогена тест (RPT) для проверки Лал выводы, провел21. Важно отметить, что каждый метод, используемый для обнаружения эндотоксинов и pyrogenicity оценки имеет свои преимущества и недостатки21,,2223,24. Признавая ограничения процедуры, используемые для характеристики данного нанотехнологии формулировка имеет важное значение для получения научного обоснования оптимального для этого нано разработки процедуры для использования.
В этом исследовании Пегилированный липосомальных доксорубицин был использован как формулировка наночастиц модели. Эта формулировка был одобрен FDA США в 1995 году и используется для лечения раковых больных во всем мире25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Информация, представленная в настоящем протоколе было описано до15,26 и опирается на ряд нормативных документов, опубликованных в США продуктов питания и медикаментов (FDA, США или FDA) и Фармакопеи США (USP)4 , 5 , 6</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано федеральным фондам от национального института рака, национальные институты здравоохранения, по контракту HHSN261200800001E. Содержание этой публикации, не обязательно отражают взгляды или политику Департамента здравоохранения и социальных служб, ни упоминание названия торговых марок, коммерческих продуктов, или организаций означает одобрения правительства США.
Materials
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
- Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
- Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).
- Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).
- US Pharmacopeia. . Bacterial Endotoxins Test. , (2011).
- FDA, U. . Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).
- FDA, U. . Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).
- Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).
- Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
- Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. , 13-18 (2015).
- Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL – a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).
- Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).
- Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).
- Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).
- Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).
- Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
- Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
- Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
- Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
- Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
- . NCL assay cascade Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015)
- Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).
- Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. , (2018).
- Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).
- Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33 (1), 47-53 (2016).
- Barenholz, Y. Doxil(R)–the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).
- Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
- FDA, U. . Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).
- Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).
- Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).
- Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).
- Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).
