זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus
Summary
זיהוי של endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים מייצג אחד האתגרים הגדול ביותר בתחום של ננו-רפואה. כאן, אנו מציגים חקר מקרה המתארת את המסגרת המורכבת LAL שלושה פורמטים שונים כדי להעריך את פוטנציאל זיהום אנדוטוקסין בחלקיקים.
Abstract
כאשר נוכח מוצרים פרמצבטיים, אנדוטוקסין רכיב הקיר תא החיידק גראם שליליים (הנקרא לעתים קרובות גם ליפופוליסכריד) יכול לגרום דלקת, חום, היפו – או יתר לחץ דם, במקרים קיצוניים, יכול לגרום נזק לרקמות ו עוגב זה ייתכן להיות קטלני. כמויות אנדוטוקסין במוצרי תרופות, לכן, הם מווסתים. בין השיטות הזמינות אנדוטוקסין זיהוי, כימות, וזמינותו Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) הוא נפוץ ברחבי העולם. בעוד כל מוצר התרופות עלולות להפריע וזמינותו לל, ננו-ניסוחים מייצגים אתגר מסוים עקב המורכבות שלהם. מטרת מאמר זה היא לספק מדריך מעשי חוקרים מנוסים באומדן endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים וסמים ניסח ננו-חלקיק. במסמך זה, המלצות מעשיות לביצוע שלוש תבניות LAL כולל עכירות, הדפסות כסף, ג’ל-קריש מבחני נידונות. מבחני אלה יכול לשמש כדי לקבוע אנדוטוקסין זיהום מוצרים מבוססי ננו-טכנולוגיה תרופות, חיסונים, adjuvants.
Introduction
אנדוטוקסין היא אבן בניין של הקיר תא החיידק גראם שליליים1,2. זה יכול להפעיל את התאים החיסוניים ב מאוד נמוכה (picogram) ריכוזים1,2. המתווכים proinflammatory (ציטוקינים, לאוקוטריאנים, eicosanoids, וכו ‘) המיוצר על ידי תאי בתגובה אנדוטוקסין אחראים קדחת, תת לחץ דם, יתר לחץ דם, בעיות בריאות חמורות יותר, כולל אי ספיקת איברים מרובים 1 , 2 , 3. חומרת בתיווך החיסון תופעות המופעלות על-ידי אנדוטוקסין תלוי מחריפותו נקבעים על-ידי אנדוטוקסין הרכב ואת מבנה ומדד אנדוטוקסין הבינלאומי יחידות (IUs או EUs)3. המספר של יחידות אלה לכל קילוגרם של משקל גוף משמשת להגדרת מנה פירוגני הסף של אנדוטוקסין. מינון זה הוא ש-5 האיחוד האירופי לק”ג למוצרים סמים מנוהל באמצעות כל נתיבי אבל המסלול במחלה. סמים עצומות למטר מרובע של פני השטח של הגוף, נוזלים תוך-עיני, radiopharmaceuticals מוצרים מנוהל באמצעות מסלול במחלה יש מנה פירוגני סף שונות, אשר הוא 100 האיחוד האירופי/m2, האיחוד האירופי 0.2/mL, האיחוד האירופי 175/V (איפה V נפח של המוצר מיועד עבור ניהול), ו- 0.2 האיחוד האירופי לק”ג, בהתאמה4. פרטים נוספים אודות המנה פירוגני מסף סמים מוצרים והתקנים שונים הינם מסופקים, נדון במקום אחר4,5,6.
חיות להשתנות באופן נרחב את רגישותם בתיווך אנדוטוקסין תגובות. בני אדם, קופים, ארנבים הם בין המינים רגישים ביותר ביותר endotoxins3. כדי למנוע תופעות לוואי בתיווך אנדוטוקסין בחולים ולמנוע המסקנות לא מדויק של רעילות פרה ולימודי היעילות, זה חיוני כדי לזהות ולכמת endotoxins ניסוחים כיתה-קליניים ומחקרים קליניים מראש שני במדויק. מספר שיטות זמין כרגע ניתן להשיג משימה זו. אחד מהם הוא וזמינותו Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), אשר נמצא בשימוש נפוץ ברחבי העולם מוצרים ביו מסך עבור פוטנציאל אנדוטוקסין לזיהום גם באשר לזהות זיהומים חיידקיים7,8,9. Lysate הוא מוכן מן amoebocytes, התאים הנוכחי בדם של הפרסה סרטנים Limulus פוליפמוס המתגוררים לחוף המזרחי של יבשת צפון אמריקה7. מעניין, יש כמה מינים שונים של סרטנים פרסה (Tachypleus גיגס , Tachypleus tridentatus) ב אסיה10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (טל) משמש במספר מדינות אסיה איתור אנדוטוקסין הדומה איך LAL משמש cuntries10. Lysates (LAL וטל) מכילים קבוצה של חלבונים המקנים בעת הפעלת פרוטאז פעילות. אחד החלבונים האלה, הגורם כביכול C מופעל בעת מגע עם אנדוטוקסין. C גורם שהופעל cleaves Factor B, אשר בתורו גם הופך פרוטאז ודבק אנזים קרישת pro כדי לייצר אנזים קרישת דם. התוצאה של תגובות שרשרת הזאת היא היווצרות של ג’ל, עלייה של עכירות מדגם ו, בנוכחות מצע הדפסות כסף, המראה של מוצר צבעוניים, אשר לשמש בסיס ג’ל-קריש דם, עכירות, מבחני הדפסות כסף, בהתאמה. אמנם יש תבנית LAL אין חובה, של מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) מסביר ההדרכה עבור תעשיית המסמך, כי במקרה של אי-התאמה בתוצאות הבדיקה בין פורמטים שונים לל, ההחלטה בהתבסס על וזמינותו ג’ל-קריש5 .
רבים נפוץ כימיקלים המעבדה (למשל., EDTA), סמים ידוע מוצרים (לדוגמה פניצילין) להפריע LAL מבחני11. ההפרעות מזוהה בדרך כלל על-ידי הערכת ההתאוששות של אנדוטוקסין תקן עלה בריכוז ידוע לתוך פתרון המכיל את החומר. אם השחזור ספייק הוא פחות מ- 50% או יותר מאשר 200%, אז התוצאה של LAL assay עבור החומר מבחן נתון אינו חוקי עקב עיכוב או שיפור, בהתאמה4. ניסוחים המבוסס על ננו-טכנולוגיה מורכבים לעיתים קרובות ומשבשים LAL באמצעות מגוון רחב של מנגנונים12,13,14. גישות רבות תוארו להתגבר על ההפרעות: שיחזור מדגם מאגרים ספציפיים, פיתחה, חלבון איון על ידי חימום, הרס של חומרי חלול מבוססי השומנים על ידי חימום ומשלימות את הדגימה. עם עודף קטיונים דו ערכיים5,12,13,14,15. שיטות אלטרנטיביות במצבים כאשר לא ניתן להתגבר על הפרעות LAL גם תוארו: אליסה, תא כתב HEK-TLR4 קו assay, ספקטרומטר מסה16,17,18, 19.
במסמך זה, מתוארים הליכים ניסיוני לעריכת ג’ל-קריש דם, עכירות, מבחני LAL הדפסות כסף. מבחני אלה הינם גם זמינים על אתר ננוטכנולוגיה אפיון מעבדה (NCL)20 בפרוטוקולים STE1.2 (עכירות LAL), STE1.3 (LAL ג’ל-clot) ו STE1.4 (LAL הדפסות כסף). מומלץ לבצע לפחות שתי תבניות שונות לאפיון הננו-ניסוח זהה. כאשר תוצאות של עכירות, הדפסות כסף LAL מסכימים, התוצאות ג’ל-קריש דם נחשבים5. כאשר התוצאות של שתי תבניות LAL מסכימים, נוספים הם ממצאי מחקרים באמצעות מונוציט הפעלת מבחן (MAT) או ארנב pyrogen מבחן (RPT) כדי לוודא LAL ערכו21. חשוב לציין כי כל שיטה המשמש לצורך זיהוי אנדוטוקסין לפירוגניות הערכה יש יתרונות ומגבלות21,22,23,24. הכרה במגבלות של ההליך שימוש כדי לאפיין את ניסוח ננוטכנולוגיה נתון חיוני להשגת הצדקה מדעית לשימוש של האופטימלית עבור הננו-ניסוח זה ההליך.
במחקר זה, שימש PEGylated liposomal דוקסורוביצין ניסוח nanoparticle מודל. ניסוח זה אושר על ידי FDA בארה ב בשנת 1995 ומשמשת לטיפול סרטן מטופלים ברחבי העולם25.
Protocol
Representative Results
Discussion
במידע הנמסר פרוטוקול זה תואר קודם15,26 ומסתמך על מספר מסמכי רגולציה שפורסם על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA או ה-FDA) ואת ארצות הברית פרמקופיאה (USP)4 , 5 , 6 , 27, והוא גם זמין באתר NCL<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי כספים פדרליים של המכון הלאומי לסרטן, מכוני הבריאות הלאומיים, תחת חוזה HHSN261200800001E. התוכן של פרסום זה אינן משקפות בהכרח את ההשקפות או מדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של, ולא הזכיר של שמות מסחריים, מוצרים מסחריים, או ארגונים מעיד על ממשלת ארה ב.
Materials
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
- Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
- Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).
- Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).
- US Pharmacopeia. . Bacterial Endotoxins Test. , (2011).
- FDA, U. . Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).
- FDA, U. . Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).
- Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).
- Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
- Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. , 13-18 (2015).
- Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL – a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).
- Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).
- Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).
- Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).
- Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).
- Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
- Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
- Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
- Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
- Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
- . NCL assay cascade Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015)
- Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).
- Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. , (2018).
- Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).
- Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33 (1), 47-53 (2016).
- Barenholz, Y. Doxil(R)–the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).
- Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
- FDA, U. . Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).
- Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).
- Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).
- Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).
- Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).
