JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Bioengineering

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

Published: January 30, 2019
doi:
10.3791/58830
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
,
1Nanotechnology Characterization Lab., Cancer Research Technology Program,Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by National Cancer Institute

Summary

Endotoxins mühendislik Nanomalzemeler içinde tespiti nanomedicine alanında büyük zorluklardan biri temsil eder. Burada, nano tanecikleri potansiyel endotoksin kirlenme tahmin etmek için üç farklı biçimlerinin LAL oluşan çerçeve açıklar bir örnek çalışma mevcut.

Abstract

Varsa ilaç ürünlerinde (sık sık da lipopolysaccharide denir) gram-negatif bakteri hücre duvarı bileşeni endotoksin inflamasyon, ateş, hipo – veya hipertansiyon neden olabilir ve, aşırı durumlarda olabilir doku ve organ hasarı için neden olabilir ölümcül olur. Bu nedenle, eczacılık ürünleri, endotoksin miktarda kesinlikle düzenlenmektedir. Arasında için kullanılabilen yöntemleri endotoksin algılama ve miktar, Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) tahlil dünya çapında yaygın olarak kullanılır. Herhangi bir ilaç ürün LAL tahlil ile müdahale ederken, nano-formülasyonları kendi karmaşıklığı nedeniyle belirli bir meydan okuma temsil eder. Bu yazının amacı araştırmacılar endotoxins mühendislik Nanomalzemeler ve uyuşturucu nanopartikül formüle tahmininde deneyimsiz için pratik bir rehber sağlamaktır. Burada, bulanıklık, chromogenic dahil olmak üzere üç LAL biçimleri ve jel-pıhtı testleri gerçekleştirmek için pratik öneriler ele alınmıştır. Bu deneyleri endotoksin kirlenme nanoteknoloji tabanlı ilaç ürünleri, aşılar ve adjuvan belirlemek için kullanılabilir.

Introduction

Bir endotoksin Ayagin Gram-negatif bakteri hücre duvarı1,2bir yapı taşıdır. Daha çok, bağışıklık hücreleri etkinleştirebilirsiniz düşük (picogram) konsantrasyonları1,2. Yanıt olarak bir endotoksin hücreleri tarafından üretilen proinflamatuar aracıların (sitokinler, lökotrienler, eikozanoidler, vb) ateş, hipotansiyon, hipertansiyon ve birden fazla organ yetmezliği gibi daha ciddi sağlık sorunları sorumlu 1 , 2 , 3. immün aracılı yan etkileri-endotoksin tarafından tetiklenen önem endotoksin kompozisyon ve yapısına göre belirlenen ve uluslararası endotoksin birimleri (IUS veya EUs)3‘ te ölçülen onun etki gücüne bağlıdır. Bu birim vücut ağırlığının kilogram başına endotoksin eşik pyrogenic doz ayarlamak için kullanılır. Bu doz intratekal rota ama tüm yolları üzerinden 5 EU/kg ilaç ürünleri için yönetilen değil. Vücut yüzeyi, göz içi sıvı, Radyofarmasötikler ve ürünleri yönetilen yolu ile intratekal rota metrekare doz uyuşturucu var 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V bir farklı eşik pyrogenic doz (V nerede birim yönetimi için tasarlanmış ürün) ve 0,2 EU/kg, sırasıyla4. Eşik pyrogenic doz için çeşitli ilaç ürünleri ve aygıtlar hakkında daha fazla bilgi sağlanır ve başka bir yerde ele4,5,6.

Hayvanlar onların duyarlılık reaksiyonları endotoksin-aracılı değişkenlik. İnsan, insan dışı primatlar ve tavşan endotoxins3‘ e en son derece hassas türler arasındadır. Hastalarda endotoksin-aracılı yan etkilerinden kaçınmak ve yanlış sonuçlara preklinik toksisite ve etkinlik çalışmaları engellemek için doğru algılamak ve her iki klinik ve önceden klinik sınıf formülasyonları endotoxins ölçmek için önemlidir. Birkaç mevcut Yöntem bu görevi elde edebilirsiniz. Yaygın olarak tüm dünyada ekran Biyomedikal ürünler bakteriyel enfeksiyonlar7,8,9algılamak için potansiyel endotoksin kirlenme de için için kullanılır Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) tahlil onlardan biri. Lysate amoebocytes hazırlanır, at nalı yengeç Limulus polyphemus kan hücreleri mevcut Kuzey Amerika7kıta Doğu kıyısında bulunan. İlginçtir, at nalı yengeçler birkaç farklı türleri vardır (Tachypleus gigas ve Tachypleus tridentatus) Asya10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) birçok Asya ülkesinde endotoksin nasıl LAL diğer cuntries10dakika sonra kullanılır benzer tespiti için kullanılır. Lysates (LAL ve TAL) etkinleştirme üzerine proteaz aktivitesi görüşmek proteinleri bir grup içerir. Bu proteinler, sözde faktör C birini endotoksin ile temas üzerine devreye girer. Aktif faktör C faktörü B, hangi sırayla da bir proteaz olur ve pıhtılaşma enzim üretmek için bir pro-pıhtılaşma enzim cleaves cleaves. Bu zincir reaksiyonların bir jel, artış örnek bulanıklık içinde ve chromogenic substrat, jel-pıhtı, bulanıklık ve chromogenic deneyleri için bir temel olarak hizmet bir renkli ürün görünümünü huzurunda oluşumu sonucudur, anılan sıraya göre. ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) açıklar için sağlanan bilgilerde açıklanan hiçbir zorunlu LAL biçimi ise sanayi belgesi, test sonuçlarını farklı LAL formatları arasında tutarsızlık durumunda karar verdi jel-pıhtı tahlil5 temel .

Çok yaygın olarak kullanılan laboratuvar kimyasalları (Örn., EDTA) ve ürünleri (Örneğin, penisilin) müdahale LAL ile bilinen ilaç deneyleri11. Girişim genellikle standart endotoksin kurtarılması, bilinen bir konsantrasyon test materyalini içeren bir çözüm içine çivili değerlendirmek tarafından tanımlanır. Spike kurtarma % 50 daha az veya fazla %200, ise o zaman LAL sonucu tahlil için verilen test materyalini inhibisyon veya geliştirme, sırasıyla4nedeniyle geçersiz. Nanoteknoloji tabanlı formülasyonları genellikle karmaşık ve LAL mekanizmaları12,13,14çeşitli engel. Girişim üstesinden gelmek için pek çok yaklaşım tarif var: örnek rekonstitüsyon özel arabellekleri ve yüzey, protein inactivation Isıtma, Isıtma ve aşırı örnekle ilave lipid tabanlı içi boş malzemeler imha tarafından divalent katyonlar5,12,13,14,15. Ne zaman LAL girişim üstesinden olamaz durumlar için alternatif yöntemler Ayrıca tarif edilmiştir: ELISA, HEK-TLR4 muhabiri hücre satır tahlil ve kütle spektrometresi16,17,18, 19.

Burada, jel-pıhtı, bulanıklık ve chromogenic LAL deneyleri yürütmek için deneysel yordamlar açıklanmıştır. Bu deneyleri de protokolleri STE1.2 (bulanıklık LAL), STE1.3 (jel-pıhtı LAL) Nanoteknoloji karakterizasyon Laboratuvarı (NCL) Web sitesi20 mevcuttur ve STE1.4 (chromogenic LAL). Bu aynı nano-formülasyonu karakterize etmek için en az iki farklı biçimleri yapmak için tavsiye edilir. Bulanıklık ve chromogenic LAL sonuçlarını katılmıyorum, jel-pıhtı sonuçları5kabul edilir. Ne zaman sonuçları iki LAL biçimlerinin katılmıyorum, ek çalışmalar LAL doğrulamak için monosit harekete geçirmek testi (MAT) veya tavşan pyrogen testi (RPT) kullanarak bulgulardir21yaptı. Her yöntemin endotoksin algılama için kullanılan ve pyrogenicity değerlendirme21,22,23,24avantajları ve sınırlamalar vardır unutmamak gerekir. Verilen nanoteknoloji formülasyonu karakterize etmek için kullanılan yordam sınırlamaları kabul ederek bu nano-formülasyon için en uygun yordamı kullanmak için bilimsel gerekçesi elde etmek için esastır.

Bu çalışmada, pegile liposomal doksorubisin modeli nanopartikül formülasyonu kullanıldı. Bu formülasyon 1995’te bize FDA tarafından onaylanmış ve kanser hastaları dünya çapında25tedavi etmek için kullanılır.

Protocol

1. hazırlanması nanopartikül örnekleri LAL çalışma örnek sınıf su hazırlamak. Örnek pH 6-8 aralığının dışında ise, pH pyrogen ücretsiz sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak ayarlayın. LAL kullanarak sınıf su çalışma örneği birkaç dilutions hazır olun. En yüksek seyreltme en fazla geçerli seyreltme (MVD) fazla olamaz emin olun. MVD tahmini hakkında ayrıntılı bilgi için tartışma bölümüne bakın. 2. LAL formatları arasında reaktifler ortak hazırlanması Seyreltik sodyum hidroksit hisse senedi 0,1 n bir konsantrasyon, çalışan bir çözüm hazırlamak için pyrogen ücretsiz LAL reaktif su kullanarak konsantre Pyrogen-Alerjik LAL reaktif su kullanarak konsantre hidroklorik asit stok sulandırmak ve 0,1 n son bir konsantrasyon, çalışan bir çözüm hazırlamak Denetim standart endotoksin (CSE) hazırlanması Üretici tarafından sağlanan analiz belgesi göre ÖAM sulandırmak.Not: sertifika bilgiler hakkındaki önemli notları için tartışma bölümüne bakınız. Katalog numarası ve belirli bir ÖAM formülasyon farklı LAL biçimlerde uygulanması ile ilgili ayrıntılar için Malzemeler tablo bakın. LAL reaktifin hazırlanması LAL reaktif üreticisi tarafından sağlanan analiz belgesi göre yeniden oluşturma.Not: LAL reaktif hazırlık ile ilgili önemli ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın. Katalog numarası ve belirli bir LAL reaktif formülasyon farklı LAL biçimde uygulanması ile ilgili ayrıntılar için Malzemeler tablo bakın. 3. bulanıklık LAL tahlil Kalibrasyon standartları hazırlanması 900 µL LAL sınıf su ve ÖAM’in 100 µL kullanarak, bir kalibrasyon standart 0,001 konsantrasyon aralığından 1 EU/ml ile hazırlanması etkinleştirmek için gerektiği kadar çok sayıda ara dilutions hazırlayın. İlk etiket tüpler ve LAL-grade su 900 μL her tüpün içine ekleyin. Sonra 10 EU/mL solutionn kalibrasyon standart 1EU/mL konsantrasyonu ile hazırlamak için 100 μL ekleyin. Seri 10 kat seyreltme üç alt kalibrasyon standartları hazırlamak için yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın. 0,001 1 EU/mL aralığında değişen dört kalibrasyon standartları hazırladık doğrulayın. Kalite denetimleri hazırlanması 0,05 EU/mL kalite kontrol 1 EU/mL ÖAM çözüm 50 µL LAL-grade su 950 µL ile birleştirerek hazırlayın.Not: denetim hazırlık ile ilgili ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın. İnhibisyon/geliştirme (IEC) denetimleri hazırlanması IEC 0,05 EU/mL konsantrasyonu ile 25 µL 1 EU/mL ÖAM çözüm ve test nanomaterial verilen bir seyreltme, 475 µL birleştirerek hazır olun.Not: ek ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın. Deneysel bir işlem Yaklaşık 30 dakika üzerinde önceden çevirerek ısınmak araç sağlar. Set-up algılama dalga boyu için 660 nm bu bulanıklık LAL için uygundur. Kullanıcı adınızı ve şifrenizi yazarak giriş yapın. Yazılım (Tablo reçetesi) bilgisayar ekranında ilgili simgesini tıklatarak açın. Veri toplama yazılım ana ekranında seçin. Test kimliği ve veri grubu bilgileri genel sekmesindeki ilgili uzaya ana ekranda girin. Tıklayın donanım sekmesini araç türü açılır menüsünden seçin. Set-up algılama dalga boyu için 660 nm bu gibi uygun için chosing tarafından bulanıklık LAL LAL bulanıklık yöntemi. Bir seri numarası, sistem kimliği ve seri bağlantı noktası bilgileri ekranda görüntülendiğinden emin olun. Tamam’ ı tıklatın. Onaylamak için bir kez daha Tamam ‘ ı tıklatın. Örnek kimliği örnek test sırayla girin. Negatif kontrol, standart eğri ve test örnekleri girmek için varsayılan düğmeleri kullanın. Her örnek için yinelenen tüpler hazırlamak ve 200 µL (test oranı 4:1) veya negatif kontrol (su), kalibrasyon standartları, kalite kontrol, IEC ve test nano tanecikleri 100 µL (test oranı 1:1) önceden etiketli cam tüpler içine ekleyin. 50 µL (test oranı 4:1) veya 100 µL (test oranı 1:1) LAL reaktif ilk test şişe, kısaca ve test içine ekleme enstrüman atlıkarınca yuvası girdap ekleyin. 1:1 oran kullandıysanız, LAL reaktif 100 µL birimdir. Diğer örnekler için yukarıda açıklanan yordamı yineleyin. İşlem tek tek örnekler.Not: daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın. 4. chromogenic LAL Kalibrasyon standartları hazırlanması 900 µL LAL sınıf su ve ÖAM’in 100 µL kullanarak, bir kalibrasyon standart hazırlanması 1 EU/mL bir konsantrasyon ile etkinleştirmek için gerektiği kadar çok sayıda ara dilutions hazırlayın. 900 µL LAL-grade su ve 1 EU/mL kalibrasyon Standart 100 µL kullanarak, ikinci bir kalibrasyon standart 0.1 EU/mL bir konsantrasyon, hazır olun. Seri 10 kat seyreltme iki alt kalibrasyon standartları hazırlamak için yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın. 0,001 1 EU/mL aralığında değişen dört kalibrasyon standartları hazırladık doğrulayın. Kalite kontrol hazırlanması. 0,05 EU/mL kalite kontrol 1 EU/mL ÖAM çözüm 50 µL LAL-grade su 950 µL ile birleştirerek hazırlayın.Not: denetim hazırlık ile ilgili ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın. İnhibisyon/geliştirme (IEC) denetimleri hazırlanması 0,05 EU/mL 1 EU/mL ÖAM çözüm 25 μL test nanomaterial 475 μL ile birleştirerek hazırlayın.Not: ek ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın. Deneysel bir işlem Yaklaşık 30 dakika üzerinde önceden çevirerek ısınmak araç sağlar. Set-up algılama dalga boyu için 405 nm bu bulanıklık LAL için uygundur. Yazılım bilgisayar ekranında ilgili simgesini tıklatarak açın. Kullanıcı adınızı ve şifrenizi yazarak giriş yapın. Veri toplama yazılım ana ekranında seçin. Test kimliği ve veri grubu bilgileri genel sekmesindeki alanlara karşılık gelen ana ekranda girin. Tıklayın donanım sekmesini araç türü açılır menüsünden seçin. Aracı seçin. Bir seri numarası, sistem kimliği ve seri bağlantı noktası bilgileri ekranda görüntülendiğinden emin olun. Tamam’ ı tıklatın. Onaylamak için bir kez daha Tamam ‘ ı tıklatın. Örnek kimliği örnek test sırayla girin. Negatif kontrol, girmek için varsayılan düğmeleri kullanın standart eğri ve test örnekleri. Her örnek için yinelenen tüpler hazırlamak ve 200 µL (test oranı 4:1) veya negatif kontrol (su), kalibrasyon standartları, kalite kontrol, IEC ve test nano tanecikleri 100 µL (test oranı 1:1) önceden etiketli cam tüpler içine ekleyin. 50 µL (test oranı 4:1) veya 100 µL (test oranı 1:1) LAL reaktif ilk test şişe, kısaca ve test içine ekleme enstrüman atlıkarınca yuvası girdap ekleyin. 1:1 oran kullandıysanız, LAL reaktif 100 µL birimdir. Diğer örnekler için yukarıda açıklanan yordamı yineleyin. İşlem tek tek örnekler. 5. jel-pıhtı LAL Not: Bu tahlil endotoxins görsel gözlem ve pıhtı tepki tüp tespiti dayalı örnek varlığı tanımlar. Deneysel adımlar aşağıda açıklanmıştır. Sonuçları kaydetmek için bir tezgah sayfasını kullanın. Bu tezgah sayfasını zorunlu değildir ve tahlil sonuçları kayıt başka yolları de kabul edilir. Böyle bir tezgah yaprak örneği bir okuyucu kolaylık sağlamak için ek materyalleri sağlanır. Lambda (l) jel-pıhtı Testin duyarlılığı ve 0,03 EU/mL. Analiz test örnekleri sayısını karşılamak için gerektiği kadar çok sayıda tepki tüpler etiketleyin. 1. adım, adım 2 ve adım 3 testin kullanılan çoğaltır sayısı hakkında ayrıntılı bilgi için tezgah sayfasına bakın. Aliquot 100 μL tüp başına su, denetimleri veya test örneği. Öyle ki son konsantrasyon 4λ için eşit ÖAM hazırlayın. 2λ ÖAM’in nihai toplama ulaşmak için su veya test örnek 100 μL ile yukarıda belirtilen standart 100 μL birleştirin. Lambda ve yarı-lambda ve çeyrek lambda elde etmek için üç kez daha tekrarlayın. Su banyosu sıcaklığı 37 ° c olduğundan emin olun Ve tüpler ile kabin içine su banyosu 1 h için yer, lysate Tüp, girdap kısaca başına 100 μL ekleyin. Yumuşak bir hareket ile tüp tersine çevirin. El ile kayıt sonuçları kullanarak “+” (firma pıhtı) ya da “-” (pıhtı veya gevşek pıhtı) tezgah gökyüzünde. Analizine göre USP bahis 854ile devam; destek malzemesi olarak tezgah sayfasını kullanın

Representative Results

Bu formülasyon LAL deneyleri içinde test ettikten sonra oluşturulan veri örneği Tablo 1′ de gösterilen. Pegile liposomal doksorubisin chromogenic LAL seyreltme 5, müdahale. Ancak, bu girişim büyük dilutions tarafından üstesinden oldu. Spike kurtarma 50 ile % 200 arasında bu formülasyon dilutions 50 ve 500 bulanıklık ve chromogenic LAL yanı sıra, seyreltme 5 bulanıklık LAL olarak test edildi zamandı. Seyreltme faktörü ayarlandığında sonuçları he…

Discussion

Bu protokol için sağlanan bilgi15,26 daha önce açıklanan ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA bize veya FDA) ve Amerika Birleşik Devletleri Pharmacopoeia (USP)4 tarafından yayımlanan farklı düzenleyici belgelere dayanan , 5 , 6 , 27ve kullanılabilir protokolleri STE1.2 (bulanıklık LAL), STE1.3 (jel-pıhtı LAL) NCL Web site…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışma federal fonların Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri, sözleşmeli HHSN261200800001E. Bu yayın içeriğini sayısı veya ilkeleri, bölümü sağlık ve insan Hizmetleri yansıtmayabilir ne ticari adlarını, ticari ürünler, söz etmez veya kuruluşların ABD hükümeti tarafından onaylandığı anlamına.

Materials

Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. . Bacterial Endotoxins Test. , (2011).
  5. FDA, U. . Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).
  6. FDA, U. . Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. , 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL – a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. . NCL assay cascade Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015)
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. , (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33 (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)–the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. . Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).

Tags

Endotoxin DetectionLimulus Amoebocyte LysateLAL AssayNano-formulationsCalibration StandardsQuality ControlEndotoxin UnitDilution PreparationNano MedicinesSafety EvaluationTest SamplesInstrument SettingsStandard CurveNegative ControlTest Materials
Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image