नैनो में Endotoxin का पता लगाने-योगों Limulus Amoebocyte Lysate (लाल) परख का उपयोग
Summary
इंजीनियर मैटीरियल्स में endotoxins का पता लगाने nanomedicine के क्षेत्र में भव्य चुनौतियों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है । यहाँ, हम एक मामले का अध्ययन है कि नैनोकणों में संभावित endotoxin संदूषण का अनुमान करने के लिए तीन अलग लाल स्वरूपों से बना ढांचे का वर्णन प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
जब दवा उत्पादों में मौजूद, एक ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरियल कोशिका दीवार घटक endotoxin (अक्सर भी lipopolysaccharide कहा जाता है) सूजन, बुखार, hypo या उच्च रक्तचाप पैदा कर सकता है, और, चरम मामलों में, ऊतक और अंग क्षति के लिए नेतृत्व कर सकते है कि घातक हो जाते हैं । दवा उत्पादों में endotoxin की मात्रा, इसलिए, कड़ाई से विनियमित रहे हैं । endotoxin डिटेक्शन और ठहराव के लिए उपलब्ध तरीकों के बीच, Limulus Amoebocyte Lysate (लाल) परख सामांयतः दुनिया भर में इस्तेमाल किया जाता है । जबकि किसी भी दवा उत्पाद लाल परख के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, नैनो-योगों उनकी जटिलता के कारण एक विशेष चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस पेपर का उद्देश्य इंजीनियर मैटीरियल्स और nanoparticle-तैयार की गई दवाओं में endotoxins का आकलन करने में अनुभवहीन शोधकर्ताओं को प्रैक्टिकल गाइड उपलब्ध कराना है । साथ ही, turbidity, chromogenic और जेल-थक्का परख सहित तीन लाल स्वरूपों प्रदर्शन के लिए व्यावहारिक सिफारिशों पर चर्चा कर रहे हैं । इन परख नैनो में endotoxin संदूषण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है आधारित दवा उत्पादों, टीके, और adjuvants ।
Introduction
एक endotoxin ग्राम के एक इमारत ब्लॉक नकारात्मक बैक्टीरियल सेल दीवार1,2है । यह बहुत कम (picogram) सांद्रता1,2पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं । भड़काऊ मध्यस्थों (साइटोकिंस, leukotrienes, eicosanoids, आदि) एक endotoxin के जवाब में कोशिकाओं द्वारा उत्पादित बुखार, हाइपरटेंशन, उच्च रक्तचाप, और कई अंग विफलता सहित अधिक गंभीर स्वास्थ्य समस्याओं के लिए जिम्मेदार हैं 1 , 2 , 3. endotoxin द्वारा ट्रिगर प्रतिरक्षा मध्यस्थता पक्ष प्रभाव की गंभीरता endotoxin संरचना और संरचना द्वारा निर्धारित अपनी शक्ति पर निर्भर करता है और अंतरराष्ट्रीय endotoxin इकाइयों में मापा (IUs या EUs)3. शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम इन इकाइयों की संख्या endotoxin की दहलीज pyrogenic खुराक सेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस खुराक सभी मार्गों लेकिन intrathecal मार्ग के माध्यम से प्रशासित दवा उत्पादों के लिए 5 यूरोपीय संघ/ दवाओं शरीर की सतह के प्रति वर्ग मीटर की खुराक, intraocular तरल पदार्थ, radiopharmaceuticals, और intrathecal मार्ग के माध्यम से प्रशासित उत्पादों एक अलग दहलीज pyrogenic खुराक है, जो है १०० यूरोपीय संघ/एम2, ०.२ यूरोपीय संघ/एमएल, १७५ यूरोपीय संघ/ व्यवस्थापन के लिए लक्षित उत्पाद की मात्रा), और ०.२ EU/किग्रा, क्रमशः4. विभिंन दवा उत्पादों और उपकरणों के लिए दहलीज pyrogenic खुराक के बारे में अधिक जानकारी प्रदान की और कहीं पर चर्चा कर रहे है4,5,6।
जानवरों endotoxin-मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं के लिए उनकी संवेदनशीलता में व्यापक रूप से बदलती हैं । मनुष्यों, गैर-मानव रहनुमाओं, और खरगोशों endotoxins3के लिए सबसे अत्यंत संवेदनशील प्रजातियों में से हैं । रोगियों में endotoxin मध्यस्थता दुष्प्रभावों से बचने और नैदानिक विषाक्तता और प्रभावकारिता अध्ययन के गलत निष्कर्ष को रोकने के लिए, यह सही का पता लगाने और दोनों नैदानिक और पूर्व नैदानिक ग्रेड योगों में endotoxins यों तो आवश्यक है. वर्तमान में उपलब्ध कई विधियाँ इस कार्य को प्राप्त कर सकती हैं. उनमें से एक है Limulus Amoebocyte Lysate (लाल) परख, जो सामांयतः दुनिया भर में इस्तेमाल के लिए संभावित endotoxin संदूषण के लिए जैव चिकित्सा उत्पादों स्क्रीन के रूप में अच्छी तरह के रूप में जीवाणु संक्रमण का पता लगाने के लिए7,8,9। lysate amoebocytes से तैयार है, घोड़े की नाल केकड़े के रक्त में मौजूद कोशिकाओं Limulus polyphemus उत्तर अमेरिका के महाद्वीप के पूर्वी किनारे में रहने वाले7। दिलचस्प है, वहां घोड़े की नाल केकड़ों की कुछ अलग प्रजातियों (Tachypleus गीगा और Tachypleus tridentatus) एशिया में10रहे हैं । Tachypleus Amoebocyte Lysate (ताल) के लिए कई एशियाई देशों में प्रयोग किया जाता है इसी तरह endotoxin का पता लगाने के लिए कैसे लाल अंय cuntries10में प्रयोग किया जाता है । lysates (लाल और ताल) प्रोटीन का एक समूह है कि सक्रियकरण पर सक्रियता प्रदान गतिविधि शामिल हैं । इन प्रोटीन में से एक, तथाकथित कारक सी endotoxin के साथ संपर्क करने पर सक्रिय है । सक्रिय कारक सी सट फैक्टर बी, जो बारी में भी एक को चिढ़ाने के लिए हो जाता है और एक थक्के एंजाइम का उत्पादन करने के लिए एक प्रो थक्के एंजाइम सट । प्रतिक्रियाओं की इस श्रृंखला का परिणाम एक जेल के गठन, नमूना turbidity में वृद्धि और, एक chromogenic सब्सट्रेट की उपस्थिति में, एक रंगीन उत्पाद है, जो जेल के लिए एक नींव के रूप में सेवा की उपस्थिति-थक्का, turbidity, और chromogenic परख, क्रमशः. हालांकि कोई अनिवार्य लाल स्वरूप है, अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) उद्योग दस्तावेज के लिए मार्गदर्शन में बताते हैं, कि अलग लाल स्वरूपों के बीच परीक्षा परिणामों में विसंगति के मामले में, निर्णय जेल-थक्का परख 5 के आधार पर किया जाता है .
कई सामांयतः प्रयोगशाला रसायनों का इस्तेमाल किया (जैसे, EDTA) और ज्ञात दवा उत्पादों (जैसे, पेनिसिलिन) लाल परख11के साथ हस्तक्षेप । हस्तक्षेप आमतौर पर एक परीक्षण सामग्री युक्त समाधान में एक ज्ञात एकाग्रता पर नुकीला endotoxin मानक की वसूली का आकलन करके पहचाना जाता है । यदि स्पाइक वसूली से कम ५०% या २००% से अधिक है, तो दिया परीक्षण सामग्री के लिए लाल परख का परिणाम निषेध या वृद्धि के कारण अवैध है, क्रमशः4। नैनो-आधारित योगों अक्सर जटिल और तंत्र की एक किस्म के माध्यम से लाल के साथ हस्तक्षेप कर रहे हैं12,13,14. कई दृष्टिकोण के हस्तक्षेप को दूर करने के लिए वर्णित किया गया है: विशिष्ट बफ़र और सर्फेक्टेंट में नमूना पुनर्गठन, हीटिंग द्वारा प्रोटीन निष्क्रियण, लिपिड आधारित खोखले सामग्री के विनाश हीटिंग द्वारा और अतिरिक्त के साथ नमूने का सप्लीमेंट divalent cations५,१२,१३,१४,१५. लाल हस्तक्षेप को दूर नहीं किया जा सकता है जब स्थितियों के लिए वैकल्पिक तरीकों भी वर्णित किया गया है: एलिसा, एक HEK-TLR4 रिपोर्टर सेल लाइन परख, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री16,17,18, 19. शी.
जेल-थक्का, turbidity, और chromogenic लाल परख के आयोजन के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाएं बताई गई हैं । इन परख नैनो लक्षण लैब (एनसीएल) वेबसाइट20 प्रोटोकॉल में भी उपलब्ध है एसटी में 1.2 (turbidity लाल), ए. ए. 1.3 (जेल-थक्का लाल) और एसटी के 1.4 (chromogenic लाल) । यह एक ही नैनो-निर्माण की विशेषताएं करने के लिए दो अलग स्वरूपों का संचालन करने के लिए सिफारिश की है । जब turbidity और chromogenic लाल असहमत के परिणाम, जेल-थक्का परिणाम5माना जाता है । जब दो लाल स्वरूपों के परिणाम असहमत हैं, अतिरिक्त अध्ययन लाल निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए या तो monocyte सक्रियण परीक्षण (चटाई) या खरगोश पायरोजेन परीक्षण (RPT) का उपयोग21आयोजित कर रहे हैं । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक विधि endotoxin डिटेक्शन और pyrogenicity असेसमेंट के लिए उपयोग किए गए लाभ और सीमाएँ21,22,23,24है । किसी दिए गए नैनो निर्माण को चिह्नित करने के लिए उपयोग की गई कार्यविधि की सीमाएं पहचानने के लिए उस नैनो-निर्माण के लिए इष्टतम प्रक्रिया के उपयोग के लिए वैज्ञानिक औचित्य प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
इस अध् ययन में PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन को मॉडल nanoparticle योगों के रूप में इस् तेमाल किया गया । यह निर्माण १९९५ में अमेरिका एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया है और कैंसर रोगियों का इलाज दुनिया भर में25के लिए इस्तेमाल किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में दी गई जानकारी15,26 से पहले बताई गई है और अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (अमेरिका एफडीए या एफडीए) और संयुक्त राज्य अमेरिका फार्माकोपिया (खासियत)4 द्वारा प्रक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अध्ययन राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों, अनुबंध HHSN261200800001E के तहत से संघीय कोष द्वारा समर्थित किया गया । इस प्रकाशन की सामग्री जरूरी विचार या स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग की नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, न ही व्यापार के नाम का उल्लेख करता है, वाणिज्यिक उत्पादों, या अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन मतलब संगठनों ।
Materials
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
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