JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
English

Automatically Generated
Bioengineering

Deteksjon av Endotoxin i Nano-formuleringer bruker Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analyser

Published: January 30, 2019
doi:
10.3791/58830
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
,
1Nanotechnology Characterization Lab., Cancer Research Technology Program,Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by National Cancer Institute

Summary

Deteksjon av endotoxins i utvikling nanomaterialer representerer en av de store utfordringene innen nanomedicine. Her presenterer vi en studie som beskriver rammeverket består av tre ulike LAL formater å beregne potensiell endotoxin forurensning i nanopartikler.

Abstract

Når finnes i legemidler, en Gram-negative bakteriell cellevegg komponenten endotoxin (også kalt lipopolysakkarid) kan forårsake betennelser, feber, hypo- eller høyt blodtrykk, og, i ekstreme tilfeller kan føre til vev og organ skade som kan bli fatal. Beløpene i endotoxin i legemidler, derfor er strengt regulert. Blant metodene tilgjengelig for endotoxin gjenkjenning og kvantifisering, er Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analysen vanlig over hele verden. Mens farmasøytiske produkter kan påvirke LAL analysen, representerer nano-formuleringer en spesiell utfordring på grunn av sin kompleksitet. Formålet med utredningen er å gi en praktisk guide til forskere uerfaren i estimering endotoxins foretatt nanomaterialer og hydrogenion-formulert narkotika. Praktiske anbefalinger for tre LAL formater, inkludert turbiditet, kromogent og gel-blodpropp analyser diskuteres her. Disse analyser kan brukes til å fastslå endotoxin forurensning i nanoteknologi-baserte legemidler og vaksiner adjuvans.

Introduction

En endotoxin er en av Gram-negative bakteriell cellevegg1,2. Det kan aktivere immunceller i svært lav (hører) konsentrasjoner1,2. Proinflammatory meglere (cytokiner, leukotrienes, eicosanoids, etc.) produsert av cellene som svar på en endotoxin er ansvarlig for feber, hypotensjon, hypertensjon og mer alvorlige helseproblemer, inkludert flere organsvikt 1 , 2 , 3. alvorlighetsgraden av immun-mediert bivirkninger utløst av endotoxin avhenger av sin styrke etter endotoxin sammensetning og struktur og målt i internasjonale endotoxin enheter (IUs eller EUs)3. Antall disse enheter per kilo kroppsvekt brukes til å angi en terskel pyrogenic dose endotoxin. Denne dosen er 5 EU/kg for legemidler administreres via alle ruter men intratekal ruten. Narkotika dosert per kvadratmeter av kroppsdeler, intraokulært væsker, radiopharmaceuticals og produkter administreres via intratekal ruten har en annen terskelen pyrogenic dose, som er 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (hvor V er den volumet av produktet beregnet på administrasjon), og 0,2 EU/kg, henholdsvis4. Mer informasjon om terskelen pyrogenic dosen for ulike legemidler og enheter tilbys og diskutert annetsteds4,5,6.

Dyr varierer mye i deres følsomhet for endotoxin-medierte reaksjoner. Mennesker og ikke-menneskelige primater kaniner er blant artene mest følsomme endotoxins3. For å unngå endotoxin-mediert bivirkninger hos pasienter og hindre feil konklusjoner av prekliniske toksisitet og effekt studier, er det viktig å nøyaktig oppdage og kvantifisere endotoxins i både kliniske og pre-klinisk klasse formuleringer. Flere tilgjengelige metoder kan oppnå denne oppgaven. En av dem er Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analysen, som er vanlig brukt verden over skjermen biomedisinsk produkter potensielle endotoxin forurensning også å oppdage bakterieinfeksjoner7,8,9. Den lysate er forberedt fra amoebocytes, cellene presenterer i blodet av hestesko krabbe Limulus Polyfemos bosatt i den østlige bredden av kontinentet i Nord-Amerika7. Interessant, det er noen forskjellige arter av hestesko krabbe (Tachypleus gigas og Tachypleus tridentatus) i Asia10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) brukes i flere asiatiske land for påvisning av endotoxin ligner på hvordan LAL brukes i andre cuntries10. Lysates (LAL og TAL) inneholder en gruppe proteiner som ved aktivering konferere protease aktivitet. En av disse proteinene, den såkalte faktoren C aktiveres ved kontakt med endotoxin. Aktivert faktor C kløyver faktor B, som også blir en protease og innstiftet en pro-clotting enzym å produsere en clotting enzym. Resultatet av denne kjeden av reaksjoner er dannelsen av en gel, en økning i prøven turbiditet og, i nærvær av et kromogent substrat utseendet på et farget produkt, som tjener som grunnlag for gel-blodpropp og turbiditet kromogent analyser, henholdsvis. Mens det er ingen obligatorisk LAL format, US Food and Drug Administration (FDA) forklarer i veiledning for basert bransje dokumentet, at i tilfelle uoverensstemmelser i testresultater mellom ulike LAL formater, vedtaket er gjort på gel-blodpropp analysen5 .

Mange brukte laboratoriekjemikaler (f.eks., EDTA) og kjente stoffet produkter (f.eks penicillin) forstyrre LAL søk11. Forstyrrelser identifiseres ved å vurdere utvinning av endotoxin standard piggete i en kjent konsentrasjon i en løsning som inneholder test materialet. Hvis spisspotensial er mindre enn 50% eller mer enn 200%, så resultatet av LAL analysen er gitt test materialet ugyldig på grunn av hemming eller ekstrautstyr, henholdsvis4. Nanoteknologi prosesseringsoperasjoner er ofte kompliserte og forstyrre LAL gjennom en rekke mekanismer12,13,14. Mange tilnærminger har blitt beskrevet for å overvinne forstyrrelser: eksempel rekonstituering i bestemte buffere og tensider, protein inaktivering av oppvarming, ødeleggelse av lipid-baserte hul materialer ved oppvarming og supplere prøven med overflødig divalent kasjoner5,12,13,14,15. Alternative metoder for situasjoner der LAL forstyrrelser ikke kan overvinne har også blitt beskrevet: ELISA, en HEK-TLR4 reporter celle linje analysen og massespektrometri16,17,18, 19.

Her, er eksperimentelle prosedyrer for å gjennomføre gel-blodpropp og turbiditet kromogent LAL analyser beskrevet. Disse analyser er også tilgjengelig på Nanoteknologi karakterisering Lab (NCL) nettsted20 i protokoller STE1.2 (turbiditet LAL), STE1.3 (gel-blodpropp LAL) og STE1.4 (kromogent LAL). Det anbefales å gjennomføre minst to forskjellige formater som betegner samme nano-utformingen. Når resultatene av turbiditet og kromogent LAL uenig, anses gel-blodpropp resultatene5. Når resultatene fra to LAL formater uenig, gjennomført ekstra studier bruker enten monocytt Aktivisering (MAT) eller kanin pyrogen testen (RPT) for å bekrefte LAL funnene er21. Det er viktig å merke seg at hver metode brukt for endotoxin påvisning og pyrogenicity vurdering har fordeler og begrensninger21,22,23,24. Erkjennelsen begrensninger av prosedyren for å karakterisere gitt nanoteknologi formulering er avgjørende for å få vitenskapelig begrunnelse for bruk av prosedyren optimalt for at nano-formulering.

I denne studien ble pegylert liposomal doksorubicin brukt som modell hydrogenion formulering. Denne formuleringen er godkjent av den amerikanske FDA i 1995 og brukt til behandling av kreft pasienter verden over25.

Protocol

1. forberedelse av hydrogenion prøver Forberede studie eksemplet i LAL klasse vann. Hvis prøven pH er utenfor 6-8, justere pH ved hjelp pyrogen-fri natriumhydroksid eller saltsyre. Bruke LAL klasse vann forberede flere fortynninger av studien prøven. Kontroller at høyeste fortynning ikke overstiger maksimal gyldig fortynning (MVD). Se drøftingen for detaljer om MVD estimering. 2. forberedelse av reagenser felles mellom LAL formater Fortynne konsentrert natriumhydroksid lager med pyrogen-gratis LAL reagens vann for å forberede en fungerende løsning i en konsentrasjon av 0,1 N. Fortynne konsentrert saltsyre lager med pyrogen-gratis LAL reagens vann og forberede en fungerende løsning på en siste konsentrasjon av 0,1 N. Utarbeidelse av kontroll Standard Endotoxin (CSE) Rekonstituer CSE ifølge analysesertifikatet leveres av produsenten.Merk: Se drøftingen for viktige notater om informasjonen i sertifikatet. Se Tabellen for materiale for detaljer om katalognummer og anvendelse av en gitt CSE formulering i ulike LAL formater. Utarbeidelse av LAL reagens Rekonstituer LAL reagensen ifølge analysesertifikatet leveres av produsenten.Merk: Se drøftingen for viktige detaljer om LAL forberedelse av reagenser. Se Tabellen for materiale for detaljer om katalognummer og anvendelse av en gitt LAL reagens formulering annet LAL format. 3. turbiditet LAL analysen Forberedelse av kalibrering Bruke 900 µL LAL klasse vann og 100 µL av CSE, forberede så mange mellomliggende fortynninger som kreves for å aktivere utarbeidelse av en kalibrering standard med en konsentrasjon varierer fra 0,001 til 1 EU/mL. Først merke rør og Legg 900 μL av LAL-grade vann i hver retning. Tilsett 100 μL av 10 EU/mL solutionn å forberede kalibrering standard med konsentrasjonen av 1EU/mL. Gjenta føljetong 10 ganger fortynning beskrevet ovenfor for å forberede tre lavere kalibrering standarder. Kontroller at fire kalibrering standarder mellom 0,001 1 EU/mL er utarbeidet. Utarbeidelse av kvalitet kontrollene Forberede en 0,05 EU/mL kvalitetskontroll ved å kombinere 50 µL av 1 EU/mL CSE løsningen med 950 µL av LAL-grade vann.Merk: Se drøftingen for detaljer vedrørende kontroll forberedelse. Utarbeidelse av hemming/ekstrautstyret (IEC) kontroller Forberede IEC med konsentrasjon av 0,05 EU/mL ved å kombinere 25 µL av 1 EU/mL CSE løsningen og 475 µL av testen nanomaterial på en gitt fortynning.Merk: Se drøftingen for mer informasjon. Eksperimentelle prosedyren For at maskinen skal varme opp ved å slå den på ca 30 min på forhånd. Oppsett oppdagelsen bølgelengden til 660 nm som dette er hensiktsmessig for turbiditet LAL. Logg på ved å skrive inn brukernavn og passord. Åpne programvaren (Tabell for materiale) ved å klikke på ikonet på en dataskjerm. Velg samle inn data på programvare Hjem-skjermen. Angi test ID og data informasjon om inn i tilsvarende plass i kategorien Generelt på Hjem-skjermen. Klikk kategorien maskinvare Velg instrument fra en rullegardinmeny. Oppsett oppdagelsen bølgelengden til 660 nm som dette er passende for turbiditet LAL ved å velge metoden LAL turbiditet. Kontroller at et serienummer, system-ID og seriell portinformasjon vises på skjermen. Klikk på OK. Klikk OK en gang til for å bekrefte. Angi prøve-ID i samme rekkefølge prøven er testet. Bruk standardknappene til å angi negativ kontroll, standard kurve og test prøver. Forberede doble rør for hver prøve og legge til 200 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) av negativ kontroll (vann), kalibrering standarder, kvalitetskontroll, IEC og test nanopartikler i forhåndsinnstilte merket BILLEDRØR. Legge til 50 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) av LAL reagensen i første test hetteglass, vortex det kort, og sett inn i test spor i instrumentet karusellen. Hvis 1:1 ratio, er volumet av LAL reagensen 100 µL. Gjenta denne fremgangsmåten beskrevet ovenfor for andre prøver. Prosessen prøver en om gangen.Merk: Se drøftingen for mer informasjon. 4. kromogent LAL Utarbeidelse av kalibrering standarder Bruke 900 µL LAL klasse vann og 100 µL av CSE, forberede så mange mellomliggende fortynninger som kreves for å aktivere utarbeidelse av en kalibrering standard med en konsentrasjon av 1 EU/mL. Bruke 900 µL LAL-grade vann og 100 µL av 1 EU/mL kalibrering standard, forberede andre kalibrering standard på en konsentrasjon av 0,1 EU/mL. Gjenta føljetong 10 ganger fortynning beskrevet ovenfor for å forberede to lavere kalibrering standarder. Kontroller at fire kalibrering standarder mellom 0,001 1 EU/mL er utarbeidet. Utarbeidelse av kvalitetskontroll. Forberede en 0,05 EU/mL kvalitetskontroll ved å kombinere 50 µL av 1 EU/mL CSE løsningen med 950 µL av LAL-grade vann.Merk: Se drøftingen for detaljer vedrørende kontroll forberedelse. Utarbeidelse av hemming/ekstrautstyret (IEC) kontroller Forberede 0,05 EU/mL ved å kombinere 25 μL 1 EU/mL CSE løsningen med 475 μL test nanomaterial.Merk: Se drøftingen for mer informasjon. Eksperimentelle prosedyren For at maskinen skal varme opp ved å slå den på ca 30 min på forhånd. Oppsett oppdagelsen bølgelengden til 405 nm som dette er hensiktsmessig for turbiditet LAL. Åpne programvaren ved å klikke på ikonet på en dataskjerm. Logg på ved å skrive inn brukernavn og passord. Velg samle inn data på programvare Hjem-skjermen. Angi test ID og data informasjon i tilsvarende plass i kategorien Generelt på Hjem-skjermen. Klikk kategorien maskinvare Velg instrument fra en rullegardinmeny. Velg instrumentet. Kontroller at et serienummer, system-ID og seriell portinformasjon vises på skjermen. Klikk på OK. Klikk OK en gang til for å bekrefte. Angi prøve-ID i samme rekkefølge prøven er testet. Bruk standardknappene til å angi negativ kontroll, standard kurve og test prøver. Forberede doble rør for hver prøve og legge til 200 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) av negativ kontroll (vann), kalibrering standarder, kvalitetskontroll, IEC og test nanopartikler i forhåndsinnstilte merket BILLEDRØR. Legge til 50 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) av LAL reagensen i første test hetteglass, vortex det kort, og sett inn i test spor i instrumentet karusellen. Hvis 1:1 ratio, er volumet av LAL reagensen 100 µL. Gjenta denne fremgangsmåten beskrevet ovenfor for andre prøver. Prosessen prøver en om gangen. 5. gel-Clot LAL Merk: Denne analysen identifiserer tilstedeværelsen av endotoxins i utvalget basert på visuell observasjon og oppdagelsen av en blodpropp i reaksjon røret. Eksperimentell trinnene er beskrevet nedenfor. Bruk en benk ark til posten resultater. Denne benken ark er ikke obligatorisk, og andre måter å registrere analyseresultatene er også akseptable. Et eksempel på slike en benk ark tilbys i supplerende materiale for bekvemmeligheten av en leser. Lambda (l) er følsomheten av gel-blodpropp analysen og 0,03 EU/mL. Etiketten så mange reaksjon rør som nødvendig for å imøtekomme antall analysert test prøver. Se benk arket for detaljer om antall gjentak brukes i trinn 1, trinn 2 og trinn 3 i analysen. Aliquot 100 μL vann, kontroller eller test vareprøve per rør. Forberede CSE slik at den endelige konsentrasjonen tilsvarer 4λ. Kombinere 100 μL av standard nevnt ovenfor med 100 μL av vann eller test prøve å oppnå den endelige konsentrasjonen av CSE av 2λ. Gjenta tre ganger lambda og halv-lambda og kvart lambda. Kontroller at temperaturen i vannbad er 37 ° C. Tilsett 100 μL av lysate per reagensglasset, vortex kort og montere med alle rør i vannbad 1t. Invertere røret med en jevn bevegelse. Registrere resultatene ved hjelp av “+” (fast blodpropp) eller “-” (ingen blodpropp eller løse blodpropp) på benken ark. Fortsette med analyse etter USP BET 854; bruke benk arket som støtte materiale

Representative Results

Eksempel data generert etter testing denne formuleringen i LAL analyser er vist i tabell 1. Pegylert liposomal doksorubicin forstyrret kromogent LAL på fortynning 5. Men ble denne innblandingen overveldet av større fortynninger. Spisspotensial ble mellom 50 og 200% når denne formuleringen ble testet på fortynninger 50 og 500 turbiditet og kromogent LAL, samt på fortynning 5 i turbiditet LAL. Når den justeres ved fortynningsfaktoren, var resultatene samsvar mellom fo…

Discussion

Informasjonen i denne protokollen har blitt beskrevet før15,26 og bruker flere lovpålagte dokumenter publisert av US Food, Drug Administration (oss FDA eller FDA) og USA farmakopé (USP)4 , 5 , 6 , 27, og er også tilgjengelig på NCL nettsted20 i protokoller STE1.2 (turbiditet LAL), STE1.3 (gel-blodpropp LAL) …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Studien ble støttet av føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, kontrakt HHSN261200800001E. Innholdet i denne publikasjonen reflekterer ikke nødvendigvis synspunkter eller politikken av Department of Health and Human Services, eller nevner av varenavn, kommersielle produkter, eller organisasjoner endossering av den amerikanske regjeringen.

Materials

<strong>Turbidity LAL Assay</strong>
Sodium HydroxideSigmaS2770When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acidSigmaH9892When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL ReagentAssociates of Cape CodT0051This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin StandardAssociates of Cape CodE0005This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade waterAssociates of Cape CodWP0501This reagent can be used with any LAL format
Glucashield BufferAssociates of Cape CodGB051-25Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mmAssociates of Cape CodTK100These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mLRAININPPT25, PPT10Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mLEppendorf22600044Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mLEppendorf30089669Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettorEppendorf4982000020Other equivalent supplies can be used
Microcetrifugeany brandAny brand can be used
Refrigerator, 2-8 Cany brandAny brand can be used
Vortexany brandAny brand can be used
Freezer, -20 Cany brandAny brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex readerAssociates of Cape CodPKF96Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
<strong>Chromogenic LAL Assay</strong>
Pyrochrome LAL ReagentAssociates of Cape CodCG1500-5This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin StandardAssociates of Cape CodEC010This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium HydroxideSigmaS2770When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acidSigmaH9892When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade waterAssociates of Cape CodWP0501This reagent can be used with any LAL format
Glucashield BufferAssociates of Cape CodGB051-25Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mmAssociates of Cape CodTK100These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mlRAININPPT25, PPT10Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mLEppendorf22600044Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mLEppendorf30089669Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettorEppendorf4982000020Other equivalent supplies can be used
Microcetrifugeany brandAny brand can be used
Refrigerator, 2-8 Cany brandAny brand can be used
Vortexany brandAny brand can be used
Freezer, -20 Cany brandAny brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex readerAssociates of Cape CodPKF96Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
<strong>Gel-Clot LAL Assay</strong>
LAL ReagentAssociates of Cape CodG5003This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin StandardAssociates of Cape CodE0005This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium HydroxideSigmaS2770When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acidSigmaH9892When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade waterAssociates of Cape CodWP0501This reagent can be used with any LAL format
Glucashield BufferAssociates of Cape CodGB051-25Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mmAssociates of Cape CodTS050These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mLRAININPPT25, PPT10Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mLEppendorf22600044Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mLEppendorf30089669Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettorEppendorf4982000020Other equivalent supplies can be used
Microcetrifugeany brandAny brand can be used
Refrigerator, 2-8 Cany brandAny brand can be used
Vortexany brandAny brand can be used
Freezer, -20 Cany brandAny brand can be used
Water bath, 37 Cany brandAny brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. . Bacterial Endotoxins Test. , (2011).
  5. FDA, U. . Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).
  6. FDA, U. . Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. , 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL – a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. . NCL assay cascade Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015)
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. , (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33 (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)–the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. . Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).

Tags

Endotoxin DetectionLimulus Amoebocyte LysateLAL AssayNano-formulationsCalibration StandardsQuality ControlEndotoxin UnitDilution PreparationNano MedicinesSafety EvaluationTest SamplesInstrument SettingsStandard CurveNegative ControlTest Materials
Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image