Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

الكشف عن اندوتوكسينس في المواد النانوية المهندسة يمثل أحد التحديات الكبرى في مجال لطب النانوي. نقدم هنا، دراسة حالة يصف إطار يتألف من ثلاثة أشكال لل مختلفة لتقدير احتمال تلوث الذيفان في جسيمات نانوية.

Abstract

عندما تكون موجودة في المنتجات الصيدلانية، الذيفان مكون جدار الخلية البكتيريا سلبية الغرام (يسمى غالباً أيضا lipopolysaccharide) يمكن أن يسبب التهاب وحمى وقصور-أو ارتفاع ضغط الدم، وفي الحالات القصوى، يمكن أن يؤدي إلى تلف الجهاز والأنسجة التي قد تصبح قاتلة. ولذلك، كميات الذيفان في المنتجات الصيدلانية، دقة تخضع. بين الطرق المتاحة لكشف الذيفان والتقدير الكمي، ويشيع استخدام الإنزيم ليمولوس أموبوسيتي ليستي (ال) في جميع أنحاء العالم. بينما أي منتج الأدوية يمكن أن تتداخل مع المقايسة لل، نانو-تركيبات تمثل تحديا خاصا بسبب تعقيدها. والغرض من هذه الورقة تقديم دليل عملي للباحثين عديمي الخبرة في تقدير اندوتوكسينس في هندسة المواد النانوية وصاغت نانوحبيبات المخدرات. وتناقش هذه الوثيقة، توصيات عملية لأداء ثلاث صيغ لل بما في ذلك التكدر، اللونية وفحوصات تجلط هلام. يمكن استخدام هذه الاختبارات لتحديد التلوث الذيفان في المنتجات المستندة إلى تقنية النانو العقاقير واللقاحات والمواد المساعدة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الذيفان لبنة من جدار الخلية البكتيريا سلبية الغرام1،2. يمكن تنشيط الخلايا المناعية في جداً منخفضة (حلول) تركيزات1،2. الوسطاء proinflammatory (السيتوكينات، اليوكوترين، ايكوسانويدس، إلخ) التي تنتجها الخلايا في الاستجابة إلى الذيفان المسؤولة عن الحمى وانخفاض ضغط الدم، وارتفاع ضغط الدم، وأشد المشاكل الصحية بما في ذلك فشل الجهاز متعددة 1 , 2 , 3-شدة المناعي بوساطة الآثار الجانبية الناجمة عن الذيفان يعتمد على فاعلية ما يحدده تكوين الذيفان وهيكل ويقاس في الذيفان الدولية وحدات (IUs أو أوروبا)3. عدد هذه الوحدات للكيلوغرام الواحد من وزن الجسم يستخدم لتعيين عتبة ﻻنبعاثات جرعة الذيفان. هذه الجرعة من الاتحاد الأوروبي 5/كغ للمنتجات الدوائية التي تديرها عبر جميع الطرق لكن الطريق إينتراثيكال. الأدوية مداوي كل متر مربع من سطح الجسم والسوائل اللاصقة والمواد المشعة والمنتجات التي تدار عن طريق توجيه intrathecal لها جرعة •انبوب عتبة مختلفة، وهو 100 الاتحاد الأوروبي/م2، 0.2 مليلتر الاتحاد الأوروبي، الاتحاد الأوروبي 175/V (حيث الخامس حجم المنتج المقصود للإدارة)، والاتحاد الأوروبي 0.2/كغ على التوالي4. مزيد من التفاصيل حول الجرعة ﻻنبعاثات عتبة لمختلف المنتجات الدوائية والأجهزة ومناقشتها في مكان آخر4،،من56.

الحيوانات تختلف على نطاق واسع في حساسيتها لردود الفعل بوساطة الذيفان. البشر والرئيسيات غير البشرية والأرانب من بين الأنواع الأكثر بالغة الحساسية إلى اندوتوكسينس3. لتجنب الآثار الجانبية بوساطة الذيفان في المرضى ومنع استنتاجات غير دقيقة للسمية الإكلينيكية والدراسات فعالية، من الضروري لدقة كشف وتحديد endotoxins في صياغات الصف السريرية وقبل السريرية على حد سواء. العديد من الأساليب المتاحة حاليا ويمكن تحقيق هذه المهمة. واحد منهم هو الإنزيم ليمولوس أموبوسيتي ليستي (ال)، الذي يستخدم عادة في جميع أنحاء العالم للمنتجات الطبية الحيوية الشاشة للتلوث الذيفان المحتملة، فضلا عن الكشف عن الإصابات البكتيرية7،،من89. مستعدة من أموبوسيتيس، والخلايا الموجودة في دم سرطان حدوة الحصان ليمولوس بوليفيموس يقيمون في الساحل الشرقي لقارة أمريكا الشمالية7. من المثير للاهتمام، وهناك عدد قليل من أنواع مختلفة من سرطان حدوة الحصان (تاتشيبليوس gigas و تريدينتاتوس تاتشيبليوس) في آسيا10. ليستي أموبوسيتي تاتشيبليوس (تل) يستخدم في العديد من البلدان الآسيوية للكشف عن الذيفان مماثلة لكيفية استخدام ال في أخرى [كونتريس10. ليساتيس (لل وتل) تحتوي على مجموعة من البروتينات التي تمنح النشاط حوزتي عند التنشيط. يتم تنشيط واحدة من هذه البروتينات، وعامل ما يسمى ج عند الاتصال مع الذيفان. تنشيط "عامل ج" كليفس "عامل ب"، الذي بدوره أيضا يصبح حوزتي وكليفس إنزيم تخثر الموالية لإنتاج إنزيم تخثر. ونتيجة لهذا السلسلة من ردود الفعل هو تكوين هلام، زيادة في تعكر عينة، وحضور الركازة اللونية، مظهر المنتج الملونة، التي تكون بمثابة أساس لجل-كلوت والتعكر وفحوصات اللونية، على التوالي. بينما لا يوجد أي شكل لل إلزامية، يشرح "لنا الغذاء" والدواء (FDA) في التوجيه بشأن الوثيقة الصناعة، أنه في حالة الاختلاف في نتائج الاختبار بين صيغ مختلفة لل، هو اتخاذ القرار استناداً إلى المقايسة هلام-كلوت5 .

كثير يشيع استخدام المواد الكيميائية المختبرية (على سبيل المثال-، يدتا) وفحوصات المخدرات المعروفة المنتجات (مثل البنسلين) تتداخل مع ال11. عادة ما يتم تعريفه التدخل بتقييم انتعاش الذيفان الموحدة ارتفعت بتركيز معلوم في محلول يحتوي على مادة الاختبار. إذا كان الانتعاش سبايك أقل من 50% أو أكثر من 200%، ثم نتيجة لل الاعتداء لمواد الاختبار المعطى غير صحيح بسبب تثبيط أو تعزيزها، على التوالي4. صيغ على أساس تكنولوجيا النانو غالباً ما تكون معقدة وتتداخل مع ال من خلال مجموعة متنوعة من الآليات12،،من1314. وقد وصف العديد من النهج للتغلب على التدخل: إعادة تشكيل عينة في مخازن محددة والتوتر السطحي، المنظمة البروتين بالتدفئة، تدمير القاعدة الدهنية المواد جوفاء بالتدفئة والمكمل للعينة مع فائض الكاتيونات ديفالينت5،12،13،،من1415. كما وقد وصف أساليب بديلة لحالات عندما لا يمكن التغلب على التدخل لل: أليسا, خط خلية مراسل HEK TLR4 المقايسة، والطيف الكتلي16،،من1718، 19.

هنا، يتم وصف الإجراءات التجريبية لإجراء هلام-كلوت والتعكر واللونية لل فحوصات. هذه الاختبارات متاحة أيضا على موقع مختبر توصيف تكنولوجيا النانو (نكل)20 في البروتوكولات STE1.2 (التعكر لل)، STE1.3 (لل جل-كلوت) و STE1.4 (لل اللونية). من المستحسن القيام بشكلين مختلفين على الأقل لوصف نفس النانو-الصيغة. عندما اختلف نتائج التعكر وال اللونية، تعتبر النتائج تجلط جل5. عندما اختلف نتائج صيغتين لل، أجرى إضافية النتائج التي توصلت إليها الدراسات باستخدام اختبار التنشيط الوحيدات (حصيرة) أو اختبار مولد أرنب (RPT) للتحقق من ال21. من المهم أن نلاحظ أن كل أسلوب يستخدم للكشف عن الذيفان وتقييم بيروجينيسيتي له مزايا وقيود21،22،،من2324. إذ تسلم بالقيود المفروضة على الإجراءات المستخدمة لوصف صيغة معينة تقنية النانو ضروري للحصول على مبرر علمي للاستخدام الإجراء الأمثل لذلك النانو-الصياغة.

في هذه الدراسة، استخدمت ميتوتريكسات الاسمافرون سي كصيغة نانوحبيبات نموذجي. هذه الصيغة تم وافق "لنا إدارة الأغذية والعقاقير" في عام 1995 وتستخدم لعلاج مرضى السرطان في جميع أنحاء العالم25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-إعداد العينات نانوحبيبات

  1. إعداد عينة الدراسة في ال المياه الصف.
  2. إذا كان الرقم الهيدروجيني عينة خارج نطاق 6-8، ضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم خالية من مولد أو حمض الهيدروكلوريك.
  3. استخدام ال الصف المياه يعد تخفيف العديد من عينة الدراسة. تأكد من أن إضعاف أعلى لا تتجاوز الحد الأقصى تمييع صالحة (MVD). الرجوع إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل حول تقدير MVD.

2-إعداد الكواشف المشتركة بين صيغ ال

  1. الأسهم مخفف من هيدروكسيد الصوديوم تركيز استخدام خالية من مولد ال كاشف المياه لإعداد حل عامل بتركيز 0.1 n.
  2. تمييع الأسهم حمض الهيدروكلوريك تركيز استخدام خالية من مولد ال كاشف المياه وتعد حلاً عامل نهائي بتركيز 0.1 n.
  3. إعداد الذيفان التحكم القياسية (CSE)
    1. إعادة تشكيل CSE وفقا لشهادة التحليل تم توفيره بواسطة الشركة المصنعة.
      ملاحظة: تشير إلى قسم مناقشة الملاحظات الهامة فيما يتعلق بالمعلومات الواردة في الشهادة. الرجوع إلى الجدول للمواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بعدد النشرة المصورة وتطبيق صيغة CSE المعطى في تنسيقات مختلفة لل.
  4. إعداد الكاشف لل
    1. إعادة تشكيل الكاشف لل وفقا لشهادة التحليل التي توفرها الشركة المصنعة.
      ملاحظة: راجع قسم مناقشة تفاصيل هامة تتعلق بإعداد كاشف لل. الرجوع إلى الجدول للمواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بعدد النشرة المصورة وتطبيق صيغة ال كاشف معين في تنسيق مختلف لل.

3-التعكر المقايسة لل

  1. إعداد معايير المعايرة
    1. استخدام ميليلتر 900 لل الصف المياه و 100 ميليلتر من CSE، إعداد العديد من تخفيف المتوسطة حسب الحاجة لتمكين إعداد معايرة قياسية بتركيز يتراوح من 0.001 إلى الاتحاد الأوروبي 1/مل.
    2. أولاً تسمية أنابيب وإضافة 900 ميكروليتر من المياه الصالحة لل في كل أنبوب. قم بإضافة 100 ميكروليتر من سولوتيون الاتحاد الأوروبي/مل 10 إعداد المعايرة القياسية مع تركيز 1EU/mL.
    3. كرر تمييع الوقت المسلسل كما هو موضح أعلاه لإعداد ثلاثة معايير المعايرة أقل. تحقق من أن أربعة معايير معايرة تتراوح بين 0.001 إلى الاتحاد الأوروبي 1/mL قد أعدت.
  2. إعداد عناصر تحكم الجودة
    1. إعداد عنصر تحكم جودة الاتحاد الأوروبي/mL 0.05 بالجمع بين 50 ميليلتر من الحل CSE الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 ميليلتر 950 من المياه الصالحة لل.
      ملاحظة: تشير إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل بشأن إعداد عنصر التحكم.
  3. إعداد الضوابط تثبيط/تعزيز (IEC)
    1. تعد اللجنة الانتخابية المستقلة مع تركيز 0.05 الاتحاد الأوروبي/mL بضم 25 ميليلتر من الحل CSE الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 و 475 ميليلتر من نانوماتيريال الاختبار في إضعاف معين.
      ملاحظة: راجع قسم المناقشة للحصول على تفاصيل إضافية.
  4. الإجراء التجريبي
    1. تسمح أداة الاحماء بتحويلها على ما يقرب من 30 دقيقة في وقت مبكر. الإعداد الكشف عن الطول الموجي إلى 660 نيوتن متر كهذا المناسب التعكر لل.
    2. تسجيل الدخول بكتابة اسم المستخدم وكلمة المرور.
    3. افتح البرنامج (جدول المواد) بواسطة النقر فوق الرمز المطابق على شاشة كمبيوتر.
    4. حدد تجميع البيانات في شاشة البرنامج الرئيسية. أدخل معلومات مجموعة اختبار البيانات ومعرف في المساحة المقابلة في علامة التبويب عام على الشاشة الرئيسية.
    5. انقر فوق علامة التبويب الأجهزة اختيار نوع الصك من قائمة منسدلة.
    6. الإعداد الكشف عن الطول الموجي إلى 660 شمال البحر الأبيض المتوسط حيث أن هذا مناسب التعكر لل التي تنحاز الأسلوب التعكر لل.
    7. تحقق من أن الرقم التسلسلي ومعرف النظام ومعلومات المنفذ التسلسلي تظهر على الشاشة. انقر فوق "موافق". انقر فوق موافق مرة أخرى للتأكيد.
    8. أدخل معرف العينة بنفس الترتيب التي يتم اختبار العينة. استخدم الأزرار الافتراضية لإدخال المراقبة السلبية، القياسية منحنى واختبار العينات.
    9. إعداد أنابيب المكررة لكل عينة وإضافة 200 ميليلتر (اختبار نسبة 4:1) أو 100 ميليلتر (اختبار نسبة 1:1) لمراقبة سلبية (المياه)، معايير المعايرة، مراقبة الجودة، وجسيمات نانوية اللجنة الانتخابية المستقلة، واختبار في أنابيب زجاجية المسمى مسبقاً.
    10. إضافة 50 ميليلتر (اختبار نسبة 4:1) أو 100 ميليلتر (اختبار نسبة 1:1) من ال كاشف لأول اختبار قنينة، دوامة أنه بإيجاز، وإدراج في اختبار فتحه في دائري الصك. إذا تم استخدام نسبة 1:1، هو حجم الكاشف لل 100 ميليلتر.
    11. كرر الإجراء الموضح أعلاه لعينات أخرى. عملية عينات في وقت واحد.
      ملاحظة: تشير إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل.

4-اللونية لل

  1. إعداد معايير المعايرة
    1. استخدام ميليلتر 900 لل الصف المياه و 100 ميليلتر من CSE، إعداد العديد من تخفيف المتوسطة حسب الحاجة لتمكين إعداد معايرة قياسية مع تركيز الاتحاد الأوروبي 1/مل.
    2. استخدام المياه الصالحة لل ميليلتر 900 و 100 ميليلتر لمعايرة الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 القياسية، يعد معياراً معايرة ثانية بتركيز 0.1 الاتحاد الأوروبي/مليلتر.
    3. كرر تمييع الوقت المسلسل كما هو موضح أعلاه لإعداد معايير المعايرة أقل اثنين. تحقق من أن أربعة معايير معايرة تتراوح بين 0.001 إلى الاتحاد الأوروبي 1/mL قد أعدت.
  2. إعداد ضوابط الجودة.
    1. إعداد عنصر تحكم جودة الاتحاد الأوروبي/mL 0.05 بالجمع بين 50 ميليلتر من الحل CSE الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 ميليلتر 950 من المياه الصالحة لل.
      ملاحظة: تشير إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل بشأن إعداد عنصر التحكم.
  3. إعداد الضوابط تثبيط/تعزيز (IEC)
    1. يعد الاتحاد الأوروبي مليلتر 0.05 بالجمع بين 25 ميكروليتر من الحل CSE الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 ميكروليتر 475 من اختبار نانوماتيريال.
      ملاحظة: راجع قسم المناقشة للحصول على تفاصيل إضافية.
  4. الإجراء التجريبي
    1. تسمح أداة الاحماء بتحويلها على ما يقرب من 30 دقيقة في وقت مبكر. الإعداد الكشف عن الطول الموجي إلى 405 نانومتر كهذا المناسب التعكر لل.
    2. افتح البرنامج بالنقر على أيقونة المقابلة على شاشة كمبيوتر. تسجيل الدخول بكتابة اسم المستخدم وكلمة المرور.
    3. حدد تجميع البيانات في شاشة البرنامج الرئيسية. أدخل معلومات المجموعة معرف وبيانات الاختبار إلى الفضاء المقابلة في علامة التبويب عام على الشاشة الرئيسية.
    4. انقر فوق علامة التبويب الأجهزة اختيار نوع الصك من قائمة منسدلة. اختيار الصك.
    5. تحقق من أن الرقم التسلسلي ومعرف النظام ومعلومات المنفذ التسلسلي تظهر على الشاشة. انقر فوق "موافق". انقر فوق موافق مرة أخرى للتأكيد.
    6. أدخل معرف العينة بنفس الترتيب التي يتم اختبار العينة. استخدم الأزرار الافتراضية لإدخال المراقبة السلبية، القياسية منحنى واختبار العينات.
    7. إعداد أنابيب المكررة لكل عينة وإضافة 200 ميليلتر (اختبار نسبة 4:1) أو 100 ميليلتر (اختبار نسبة 1:1) لمراقبة سلبية (المياه)، معايير المعايرة، مراقبة الجودة، وجسيمات نانوية اللجنة الانتخابية المستقلة، واختبار في أنابيب زجاجية المسمى مسبقاً.
    8. إضافة 50 ميليلتر (اختبار نسبة 4:1) أو 100 ميليلتر (اختبار نسبة 1:1) من ال كاشف لأول اختبار قنينة، دوامة أنه بإيجاز، وإدراج في اختبار فتحه في دائري الصك. إذا تم استخدام نسبة 1:1، هو حجم الكاشف لل 100 ميليلتر.
    9. كرر الإجراء الموضح أعلاه لعينات أخرى. عملية عينات في وقت واحد.

5-جل-كلوت لل

ملاحظة: يحدد هذا الفحص وجود endotoxins في العينة على أساس الملاحظة البصرية والكشف عن تجلط في أنبوب رد فعل. فيما يلي الخطوات التجريبية. استخدام ورقة البدلاء لتسجيل النتائج. هذه الورقة مقاعد البدلاء ليس إلزامياً، وطرق أخرى لتسجيل نتائج الفحص مقبولة أيضا. ويرد مثال على ورقة البدلاء في المواد التكميلية لراحة القارئ. لامدا (l) حساسية المقايسة جل جلطة وهو 0.03 الاتحاد الأوروبي/مل.

  1. قم بتسمية العديد من رد فعل الأنابيب اللازمة لاستيعاب عدد عينات الاختبار تم تحليلها. الرجوع إلى ورقة البدلاء للحصول على تفاصيل حول عدد replicates المستخدمة في الخطوة 1 والخطوة 2 والخطوة 3 للمقايسة.
  2. الكوة 100 ميكروليتر من عينة المياه أو عناصر التحكم أو اختبار كل أنبوب.
  3. يعد محرك البحث أن تركيز نهائي يساوي 4λ.
  4. الجمع بين 100 ميكروليتر من المعايير المذكورة أعلاه مع 100 ميكروليتر من عينة المياه أو اختبار لتحقيق التركيز النهائي لمحرك البحث 2λ. كرر ثلاث مرات أكثر لتحقيق أمداً ونصف-أمداً وربع لامدا.
  5. تأكد من أن درجة الحرارة في حوض ماء 37 درجة مئوية.
  6. إضافة 100 ميكروليتر من في أنبوبة الاختبار، دوامة بإيجاز ووضع على الرف مع جميع الأنابيب في حمام الماء ح 1.
  7. عكس الأنبوب مع حركة ناعمة.
  8. نتائج السجل يدوياً باستخدام "+" (شركة جلطة) أو "" (لا جلطة أو جلطة فضفاضة) على ورقة مقاعد البدلاء.
  9. المضي قدما في التحليل وفقا لجامعة جنوب المحيط الهادئ الرهان 854؛ واستخدام ورقة البدلاء كمواد الدعم

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

على سبيل المثال البيانات التي تم إنشاؤها بعد اختبار هذه الصيغة في فحوصات ال يرد في الجدول 1. وتدخلت ميتوتريكسات الاسمافرون سي ال اللونية في تمييع 5. ومع ذلك، تم التغلب على هذا التدخل بتخفيف أكبر. كان الانتعاش ارتفاع يتراوح بين 50 و 200 في المائة عندما تم اختبار هذه الصيغة في تخفيف 50 و 500 في التعكر وال اللونية، فضلا عن إضعاف 5 في التعكر لل. عند تعديل معامل التخفيف، وكانت النتائج متسقة بين تخفيف في كلا فحوصات. وعلاوة على ذلك، كانت النتائج متسقة بين الأشكال الثلاثة المقايسة.

عينة الاختبار تعكر لل الاتحاد الأوروبي/mg (سبايك الانتعاش، %) ال اللونية، والاتحاد الأوروبي/ملغ، (سبايك الانتعاش، %) هلام-كلوت لل الاتحاد الأوروبي/mg (اختبار صالحة، نعم أو لا)
سي الاسمافرون ميتوتريكسات (انظر الجدول للمواد)
تمييع 5 0.01 (141) التدخل < 0.75 (Y)
تمييع 50 < 0.025 (187) 0.029 (82) < 1.5 (Y) *
تمييع 500 < 0.25 (182) < 0.25 (86) < 3 (Y) * *

الجدول 1: الكشف عن الذيفان في فحوصات الاسمافرون ميتوتريكسات باستخدام ال سي. فحوصات ميتوتريكسات الاسمافرون تم اختباره باستخدام التعكر، اللونية وهلام-كلوت لل سي. وقدرت تدخل العينة باستخدام IECs. ويرد سبايك الانتعاش في أقواس. القيم بين 50 و 200 في المائة تعتبر مقبولة وفقا 85 الرهان USP القياسية ل كشف الذيفان4. * و * * تم التوصل إلى النتائج اختبار هذه العينة في تخفيف 100 و 200، على التوالي. تخفيف المقايسة تجلط هلام تختلف عن تلك المستخدمة في اللونية والتعكر ال نظراً لحساسية وتمييع صالحة كحد أقصى لهذا الفحص أقل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

المعلومات الواردة في هذا البروتوكول قد وصفت قبل15،26 وتعتمد على العديد من الوثائق التنظيمية التي نشرتها لنا الغذاء والدواء (إدارة الأغذية والعقاقير الأمريكية أو إدارة الأغذية والعقاقير) ودستور الأدوية الأمريكية (USP)4 , 5 , 6 , 27، وهي متاحة أيضا على الموقع نكل20 في البروتوكولات STE1.2 (التعكر لل)، STE1.3 (لل جل-كلوت) و STE1.4 (لل اللونية).

وتعد المواد النانوية الاختبار أما في ال كاشف المياه أو برنامج تلفزيوني عقيمة وخالية من مولد. درجة حموضة عينة الدراسة مهم لأنه منخفض (< 6) ودرجة الحموضة العالية (> 8) سوف تتداخل مع الأداء الأمثل. إذا كان الرقم الهيدروجيني للاختبار-نانوحبيبات خارج نطاق 6-8، يمكن تعديلها باستخدام هيدروكسيد الصوديوم خالية من مولد أو حمض الهيدروكلوريك. عندما يتم إجراء مثل هذا التعديل، حيوي لتجنب تلوث عينة من ميكروليكترودي. ولذلك، إزالة في أنبوب منفصل لتنفيذ هذا الإجراء، قاسمة صغيرة من العينة والمستخدمة لقياس درجة الحموضة.

أيضا عندما تكون مستعدة العينة في برنامج تلفزيوني أو المخزن المؤقت آخر، يتم تضمين المخزن المؤقت فارغاً في هذا الاختبار. تركيز نانوماتيريال كل قضية على حدة. الاختبار يستخدم لتقدير الكمية من تلويث الذيفان كل مليغرام من العناصر النشطة الصيدلانية (API). ومع ذلك، تبعاً لنوع نانو-صياغة، التركيز يمكن أيضا تقدير في مغ من صياغة مجموع أو مجموع العنصر (على سبيل المثال.، والذهب والفضة أو الحديد للذهب والفضة، وجسيمات نانوية أكسيد الحديد، على التوالي). يتم اختبار العينة من المخزون استخدام تخفيف عدة لا تتجاوز في MVD. وتعد تخفيف كل من الاختبار-جسيمات نانوية استخدام المياه الصالحة لل.

المعلمات الثلاث المستخدمة لحساب MVD. وهم الحد الذيفان (ش) وتركيز العينة و تحليل الحساسية (λ)4. استخدم الصيغة التالية لحساب حد الذيفان (ش): ش = ك/م، حيث ك جرعة مولد عتبة (مثلاً.، 5 الاتحاد الأوروبي/كغ كما ورد في المقدمة) و M هو أقصى جرعة نانوماتيريال اختبار مخصصة لإدارة كل كيلوغرام من الجسم الوزن في ساعة واحدة4. كما نوقش أعلاه، تقدير ش للمواد النانوية المستخدمة صيدلانية أو كجهاز طبي يعتمد على جرعة •انبوب عتبة أو الصيغة، وهي تختلف عن 5/م. هذه التفاصيل المذكورة في المقدمة ويمكن أن يعاد النظر كذلك في جامعة جنوب المحيط الهادئ، وإدارة الأغذية والعقاقير الأمريكية المبادئ التوجيهية4،،من56. الحد الموصى به الذيفان لحلول البصريات والأجهزة داخل مقلة العين هو المنصوص عليه في المبدأ التوجيهي "إدارة الأغذية والعقاقير الأمريكية" هذه المنتجات6. عند وضع نموذج الحيوان (مثلاً.، الماوس) كان يستخدم لإنشاء جرعة نانوفورموليشن، وتستخدم هذه المعلومات لتقدير الجرعة المكافئة البشرية ما يسمى (هد). ويحسب هد بتقسيم الجرعة الحيوان بمعامل التحويل، ومحددة لكل نوع من الأنواع الحيوانية. على سبيل المثال، هو عامل التحويل 12.3 6.2 و 3.1 للماوس، الجرذان والأرانب، على التوالي27. ويرد بالتفصيل في المبدأ التوجيهي "إدارة الأغذية والعقاقير الأمريكية"27إجراء التحويل، والأساس المنطقي لاستخدام ذلك. غالباً ما يتم مداوي علاجات السرطان كل مساحة الجسم السطحية المعرب عنها في مغ/م2. واحد يمكن اتباع المبدأ التوجيهي جامعة جنوب المحيط الهادئ لحساب ش للمخدرات مداوي في ملغم/متر مربع أو تحويل هذه الجرعة إلى نطاق مغ/كغ. يمكن ضبط الجرعة في مغ/م2 للجرعة في استخدام معامل التحويل إبلاغها27مغ/كغ. للإنسان الكبار، المشار إليه ك كم الإشارة إلى كتلة ثابتة27و 37. وقد عامل كم وحدات كجم/م2؛ أنها مساوية لوزن الجسم بالكيلوغرام (كغم) مقسوماً على مساحة متر مربع (م2)27. على سبيل المثال، الجرعة البشرية أو هد 74 ملغ/م2 يقابل 2 مغ/كغ أو 74/37. لتحديد MVD، استخدم الصيغة التالية، الذي يتوفر أيضا من معيار 85 الرهان USP: MVD = (ش × تركيز العينة)/λ)4. في سيناريو افتراضي، تركيز عينة نانوحبيبات 10 ملغ/مل وفي الجرعة القصوى في الماوس 615 مغ/كغ. وفي هذه الحالة هد 615/12.3 = 50 مغ/كغ؛ ش لجميع الطرق باستثناء intrathecal هو 0.1 الاتحاد الأوروبي/mg (5 الاتحاد الأوروبي/كجم/50 مغ/كغ) و MVD هو 1000 ((0.1 الاتحاد الأوروبي/mg x 10 mg/mL)/0.001 الاتحاد الأوروبي/mL).

في كثير من الأحيان، عندما يحتاج المرء تقييم التلوث الذيفان في نانوماتيريال الصف بحث، جرعة لا تتوفر المعلومات. لا يوجد أي إجراء منسق لكيفية تقدير MVD وايل لهذه المواد. هذه الدراسة الإفرادية يؤدي الاختبار مباشرة من المخزون (عادة تركيز هذا الحل 1 ملغ/مل) وتخفيف عدة وعادة ما تكون 5-، 50-، 500--و 5,000-طيات. عند الجرعة ومسار الإدارة وتركيز العينة والضخ الوقت لتغيير نانوماتيريال اختبار معين، ش و MVD أيضا تغيير. ولذلك، يتعين على المرء أن تقييم المعلومات، وإجراء تقدير ش و MVD في سياق المعلمات الأخرى المتصلة بالمبلغ، ومسار إدارة الوقت، والمقصود والتركيز لوضع معين.

من المهم أن نلاحظ أن عدد الكتالوجات ومواصفات المنتج (مثلاً.، رجولية، ويبلغ كل قنينة) CSE هي مختلفة بالنسبة للتنسيقات المختلفة لل. CSE المستخدمة في التعكر لل يمكن أن تستخدم أيضا في لل جل جلطة. CSE لل اللونية غير محددة بهذا الشكل المقايسة. التعليمات الواردة أدناه عامة وتنطبق على محرك البحث المستخدمة في جميع الأشكال المقايسة. CSE ليبوبوليساكتشاريدي كولاي (لبس) المقدمة كمسحوق المجففة بالتبريد. هذا المعيار مصادق عليها من قبل الشركة المصنعة ضد مرجع قياسي الذيفان (RSE) مع فاعلية معروفة. ينبغي أن يعاد تشكيل محتويات القنينة التي تحتوي على محرك البحث مع ~3.2--5.0 مل خالية من مولد ال كاشف المياه. بالإضافة إلى الفرق بين محرك البحث المستخدمة لتحليل مختلف الأشكال، أيضا حجم إعادة تشكيل محددة لكل الكثير من هذا المعيار. ولذلك، يتعين على المرء أن حساب تركيز الحل CSE الأسهم لكل الكثير من المعيار النهائي. يتم تنفيذ العملية الحسابية استناداً إلى فاعلية المعيار والمبلغ الوارد في كل قنينة. شهادة التحليل المحددة لكل الكثير من الذيفان قياسي يحتوي على معلومات حول فاعلية ومبلغ كل قنينة. يتعين على المرء أن صارم من دوامة القياسية لمدة 30-60 ثانية، سواء من خلال إعادة تشكيل أو أثناء الاستخدام. من المستحسن أيضا القيام بإعادة استخدام 5-10 دقيقة تسوية مرات وخلال 30-60 دقيقة الإطار الزمني التأكد من أن جميع المجففة بالتبريد المواد يذهب إلى الحل. قبل استخدام في المقايسة، حجته الأسهم CSE بدرجة حرارة الغرفة. بعد إعادة تشكيل، يمكن أن تكون مبردة لتخزين المخزون CSE وهو مستقر لمدة أربعة أسابيع.

شبيه محرك البحث، الكاشف لل أيضا محددة لكل شكل. التعليمات الواردة أدناه عامة وتنطبق على جميع الأشكال المقايسة لل. وتقدم الكاشف لل كمسحوق المجففة بالتبريد. وتتبع توصيات الشركة المصنعة لإعادة تشكيل كل قنينة. ويمكن استخدام المياه لل الصف أو المخزن المؤقت لتثبيط بيتا glucans. المخزن المؤقت الذي يحول دون glucans بيتا هو المفضل في هذه الدراسة الإفرادية لأنه يسمح باستبعاد التدخل glucans بيتا. هذا التدخل إيجابية كاذبة شائع جداً في المواد متناهية الصغر لأن مرشحات خلات السليولوز تستخدم عادة خلال توليف نانوماتيريال وتكون بمثابة مصدر ل تلوث غلوكان15. قارورة معظم سيتطلب إعادة تشكيل حجم 5 مل نهائي. استناداً إلى ما يزيد على 10 سنوات من الخبرة أصحاب مع هذا التحليل، وقد لوحظ أن إدراج هذا المخزن المؤقت يبطئ رد الفعل، وقد تتطلب زيادة فترة ظهور الحد الأقصى في إعدادات أداة للسماح لمعايرة أدنى في تركيز الاتحاد الأوروبي/mL 0.001 تطوير.

لضمان تخفيف دقيقة أثناء إعداد المعايير، من المستحسن استخدام الوقت تمييع الخطوات. يمكن إعداد تخفيف إذ المسلسل التشويك ميليلتر 100 من الأسهم أو معيار مع تركيز أعلى إلى 900 ميليلتر من الماء خالية من مولد. نظراً لأن تركيز المخزون CSE عادة عالية (~ 1,000 الاتحاد الأوروبي/mL)، التحضير لتخفيف الوسيطة مع تركيزات 100 و 10 مل/الاتحاد الأوروبي يوصي قبل إعداد معايرة الإنزيم مع تركيز الاتحاد الأوروبي 1/مل. اثنين من نسب بين عينة الاختبار وليساتي موصوفة في هذا البروتوكول. على الرغم من أن كلا نسب تستخدم عادة، الخطي منحنى مقبولة ولكن ليست مثالية عند استخدام نسبة 4:1 والمخزن المؤقت الذي يحول دون glucans بيتا (انظر الجدول للمواد).

كما تنطبق نفس القواعد كما هو موضح أعلاه فيما يتعلق بإعداد قياسية المعايرة في التحضير لعمليات مراقبة الجودة (مراقبة الجودة). وتستخدم عناصر التحكم هذه للتحقق من أن الإنزيم يعمل بشكل صحيح. قد أعدت النتوءات مقدار CSE المعروفة في المياه خالية من مولد. عادة ما يتم اختيار تركيز مراقبة الجودة في منتصف نطاق المقايسة. نطاق التحليل ال التعكر هو 0.001 إلى 1 الاتحاد الأوروبي/مل. ولذلك، يستخدم مراقبة الجودة بتركيز 0.05 الاتحاد الأوروبي/مل. يمكن أيضا استخدام التركيزات الأخرى داخل نطاق الفحص تحضيرا لمراقبة الجودة.

عنصر تحكم زيادة تثبيط (IEC) كما معروف مراقبة المنتجات الإيجابية (قدرة شرائية). قد أعدت النتوءات تركيز معلوم من CSE في عينة الاختبار. عادة ما يتم اختيار التركيز "اللجنة الانتخابية المستقلة" (قدرة شرائية) في منتصف نطاق المقايسة. نطاق التحليل ال التعكر هو 0.001 إلى 1 الاتحاد الأوروبي/مل. لذلك، يتم استخدام اللجنة الانتخابية المستقلة بتركيز 0.05 الاتحاد الأوروبي/مل. لإعداد هذه اللجنة الانتخابية المستقلة يحتاج المرء للجمع بين 50 ميليلتر من الحل CSE الاتحاد الأوروبي/ملليلتر 1 ميليلتر 950 من الاختبار-نانوحبيبات. اللجنة الانتخابية المستقلة مستعدة لإضعاف كل الاختبار-نانوماتيريال. على سبيل المثال، إذا كان يتم اختبار صيغة نانو في تخفيف ثلاث (01:50، 1: 500 و 1:5، 000)، أحد لديه إعداد IECs ثلاثة، واحد لكل من تخفيف هذه. يمكن أيضا استخدام التركيزات الأخرى داخل نطاق الفحص لإعداد نموذج اللجنة الانتخابية المستقلة. يتم استخدام عنصر التحكم هذا لفهم صحة نتائج الاختبار للنانو-صياغة معينة. جامعة جنوب المحيط الهادئ، ووفقا لنتائج الاختبار صالحة إذا كان الانتعاش سبايك من "اللجنة الانتخابية المستقلة" (قدرة شرائية) بين 50 و 200%4. سبايك الاسترداد أقل من 50% يعني أن الاختبار-نانوماتيريال يحول دون كشف الذيفان، ولذلك فالاختبار يؤدي إلى تلوث الذيفان الصعودية وغير صالحة. سبايك الانتعاش أكثر من 200 في المائة يشير إلى أن الاختبار-المواد التي تعزز نتيجة الفحص أو يحتوي على مستوى عال جداً من الذيفان تلويث. في حالة تعزيز، أيضا نتيجة الفحص غير دقيق. أمثلة لهذا التدخل وبعض الطرق للتغلب عليها قد وصف سابق12،15.

عند أداء التعكر وفحوصات اللونية، من المستحسن استخدام ماصة مكرر لإضافة الكاشف ال لجميع العينات. وقت العملية صك متوسط 7200 ثانية. ومع ذلك، يمكن أن يكون رد فعل أسرع أو أبطأ مع بعض الكثير من ليساتي. وفي الحالات عندما يكون رد الفعل البطيء، أحد قد تحتاج إلى تغيير إعدادات أداة ل 9600s أو لفترة أطول. وسيسمح هذا التغيير معايرة أدنى تطوير.

سي الاسمافرون ميتوتريكسات صيغة تحتوي على مكون نشط صيدلانية (API) بتركيز 2 ملغ/مل. فهو يستخدم في العيادة كجرعة من 50 ملغ/م2. لتحويل هذه الجرعة إلى نطاق مغ/كغ، وهي مقسمة حسب عامل 3727. ولذلك، هي جرعة ميتوتريكسات سي الاسمافرون في مغ/كغ، 1.35. لحساب ش، ينقسم 1.35 (جرعة دوكسيل في مغ/كغ) 5 (الجرعة مولد عتبة في الاتحاد الأوروبي/كغ) والحصول على 3.7 مغ/الاتحاد الأوروبي4. ويعني هذا الرقم أن سي ميتوتريكسات الاسمافرون في الجرعة من 1.35 مغ/كغ يمكن إدارته بأمان كل ساعة واحدة إذا الذيفان في الصياغة لا يتجاوز 3.7 الاتحاد الأوروبي/ملغ، حيث يشير مجم ل API.

وبعد ذلك، استخدم هذه المعلومات لحساب MVD لفحوصات لل. الحساسية (لامدا) من التعكر، اللونية وفحوصات تجلط جل المعروضة في هذه الدراسة هو 0.001 0.001 والاتحاد الأوروبي 0.03/مل، على التوالي. ولذلك، هو MVD 7,407 التعكر وفحوصات اللونية (5 (الاتحاد الأوروبي/كغ x 2 mg/mL)/0.001 الاتحاد الأوروبي/mL)، و 247 للمقايسة تجلط هلام ((5 الاتحاد الأوروبي/كغ x 2 mg/mL)/0.03 الاتحاد الأوروبي/mL).

وقد ميتوتريكسات طيف امتصاص واسع النطاق الذي يتداخل مع المقايسة الطول الموجي ل ال اللونية28,29. وعلاوة على ذلك، معظم الحويصلية الصياغات عكره وتظهر درب التبانة. هذا التعكر الأصيل هو سبب شائع جداً لتدخل الدهنية مع المقايسة التعكر. في حالة ميتوتريكسات الاسمافرون سي، تم التغلب على التدخل بسبب التعكر بتمييع خمسة كما يتضح من قيم الاسترداد سبايك بين 50 و 200 في المائة (الجدول 1). ومع ذلك، كان تركيز في ميتوتريكسات إضعاف نفس ما زالت مرتفعة بما يكفي للتدخل مع ال اللونية (الجدول 1). تخفيف اللاحقة اثنين (50 و 500) ساعد على التغلب على التدخل ميتوتريكسات الاسمافرون سي ال اللونية. منذ المقايسة هلام-كلوت المستقلة التعكر واللون عينة، ومستوى الذيفان في الصياغة يقع ضمن نطاق هلام-كلوت، ميتوتريكسات الاسمافرون سي لا تتداخل مع المقايسة تجلط جل تخفيف اختبارها في جميع. في هذه الدراسة، استخدمت تخفيف العديد من ميتوتريكسات الاسمافرون سي لهذه الاختبارات. تم اختيار تخفيف 5 و 50 و 500 التعكر واللونية، فضلا عن 50، 100 و 200 للمقايسة هلام-كلوت لأنهم داخل MVD. MVD للمقايسة تجلط جل أقل من التعكر ولالس اللونية نظراً لحساسية هذا الفحص أيضا أقل. إذا كان وضع تدخلت مع ال في تمييع 500 في التعكر وفحوصات اللونية، يمكن إجراء التحليل في تخفيف أعلى (مثلاً، 5000، 6,000، 7,000 أو 7,407). ولما كان مستوى الذيفان التي حصلوا عليها في تمييع 50 في مقايسة تجلط جل أدناه ش، لم يتم تنفيذ تحليل هذه الصيغة في تخفيف أقل. ومع ذلك، في حالات أخرى، اختبار يمكن الاستمرار في تخفيف 20، 10، 5 أو 2 لتحديد أدنى عدم التدخل في تمييع وفهم ما إذا كان مستوى الذيفان في الصياغة أدناه ش.

من المهم أن نذكر أن من الضروري للمقايسة هلام-تجلط إيقاف تشغيل وظيفة دوران المياه في حمام الماء لمدة هذا الفحص أو استخدام حمام مائي دون خيار من هذا القبيل بسبب تدفق المياه يضر الجلطة وقد يؤثر على دقة g ش-تجلط ال المقايسة. ليس دائماً يمكن التغلب على التدخل نانوحبيبات مع فحوصات لل بزيادة تخفيف العينة. الاستراتيجيات وبعض الأساليب للتغلب على أنواع مختلفة من التدخل، وأمثلة من جسيمات نانوية عادة تمثل مشكلة لفحوصات ال كانت تناقش المجموعات الأخرى ولنا في مكان آخر12،13،14 15، ،،من3031. يستند التحليل المقدم في هذه المخطوطة إلى صيغة نموذجية. قد تكون تجربة أخرى نانوفورموليشنز مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الدراسة تدعمها الأموال الفيدرالية من المعهد الوطني للسرطان، "المعاهد الوطنية للصحة"، وبموجب العقد HHSN261200800001E. محتوى هذا المنشور لا تعكس بالضرورة وجهات نظر أو سياسات لوزارة الصحة والخدمات الإنسانية، ولا أذكر الأسماء التجارية، والمنتجات التجارية، أو المنظمات يعني موافقة "الحكومة الأمريكية".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36, (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11, (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4, (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. Bacterial Endotoxins Test. (2011).
  5. FDA, U. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. (2012).
  6. FDA, U. Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44, (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19, (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409, (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220, (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5, (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9, (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. NCL. NCL assay cascade. Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015).
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4, (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9, (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33, (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160, (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31, (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9, (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11, (9-10), 1157-1175 (2017).
كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter