Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

Påvisning af endotoksiner i industrielt fremstillet nanomateriale repræsenterer en af de store udfordringer inden for Nanomedicin. Vi præsenterer her, et casestudie, der beskriver rammerne består af tre forskellige LAL formater til at vurdere potentielle endotoxin forurening i nanopartikler.

Abstract

Når de findes i farmaceutiske produkter, en Gram-negative bakterielle cellevæg komponent endotoxin (ofte også kaldet LPS) kan forårsage betændelse, feber, hypo- eller hypertension, og i ekstreme tilfælde kan føre til væv og orgel skader, der kan blive fatal. Mængder af endotoxin i farmaceutiske produkter, derfor er strengt reguleret. Blandt de metoder, der er til rådighed for endotoxin påvisning og kvantificering, er Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay almindeligt anvendt over hele verden. Mens enhver farmaceutisk produkt, der kan forstyrre LAL assay, udgør nano-formuleringer en særlig udfordring på grund af deres kompleksitet. Formålet med dette dokument er at give en praktisk vejledning for forskere uerfarne i estimeringen af endotoksiner i nanomaterialer og nanopartikel-formuleret narkotika. Heri, diskuteres praktiske anbefalinger til at udføre tre LAL formater herunder turbiditet, kromogent og gel-blodprop assays. Disse assays kan bruges til at bestemme endotoxin forurening i nanoteknologi-baserede lægemidler, vacciner og adjuvanser.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En endotoxin er en byggesten af Gram-negative bakterielle cellevæg1,2. Det kan aktivere immunceller på meget lav (pikogram) koncentrationer1,2. Proinflammatoriske mæglere (cytokiner, leukotriener, eicosanoider, etc.) produceret af celler som reaktion på en endotoxin er ansvarlig for feber, hypotension, hypertension og mere alvorlige sundhedsmæssige problemer, herunder flere organsvigt 1 , 2 , 3. sværhedsgraden af immun-medieret bivirkninger udløst af endotoxin afhænger dens potens bestemmes af endotoxin sammensætning og struktur og måles i internationale endotoxin enheder (IUs eller EUs)3. Antallet af disse enheder pr. kg kropsvægt bruges til at indstille en tærskel pyrogen dosis af endotoxin. Denne dosis er 5 EU/kg for lægemidler administreres via alle ruter men ruten Intratekal. Lægemidler doseres pr kvadratmeter af kroppens overflade, intraokulært væsker, radioaktive lægemidler og produkter administreres via Intratekal rute har en forskellige pyrogen tærskeldosis, som er 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (hvor V er den volumenet af det produkt, der er beregnet til administration), 0,2 EU/kg, henholdsvis4. Flere detaljer om den pyrogen tærskeldosis for forskellige lægemidler og enheder leveres og diskuteret andetsteds4,5,6.

Dyr varierer meget i deres følsomhed over for endotoxin-medierede reaktioner. Mennesker, ikke-menneskelige primater og kaniner er blandt de mest ekstremt følsomme over for endotoksiner3arter. For at undgå endotoxin-medieret bivirkninger hos patienter og forebygge urigtige konklusioner af prækliniske toksicitet og effekt studier, er det nødvendigt at præcist at detektere og kvantificere endotoksiner i både kliniske og prækliniske grade formuleringer. Flere i øjeblikket tilgængelige metoder kan opnå denne opgave. En af dem er Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analysen, som er almindeligt anvendt over hele verden til skærmen biomedicinske produkter for den potentielle endotoxin forurening samt at opdage bakterieinfektioner7,8,9. Den lysate er fremstillet af amoebocytes, cellerne i blod fra horseshoe krabber Limulus Polyfem bosiddende i øst-kysten af det europæiske kontinent Nordamerika7. Interessant, der er et par forskellige arter af horseshoe krabber (Tachypleus gigas og Tachypleus tridentatus) i Asien10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) er brugt i flere asiatiske lande til påvisning af endotoxin svarende til hvordan LAL bruges i andre cuntries10. Lysates (LAL og TAL) indeholder en gruppe af proteiner, der ved aktivering giver protease aktivitet. En af disse proteiner, den såkaldte faktor C aktiveres ved kontakt med endotoxin. Aktiveret faktor C kløver Factor B, som til gengæld også bliver en protease og kløver et pro-koagulation enzym til at producere en blodpropper enzym. Resultatet af denne kæde af reaktioner er dannelsen af en gel, en stigning i stikprøven Turbiditet og i overværelse af et kromogent substrat, udseendet af en farvet produkt, der tjener som et fundament for gel-blodprop, turbiditet og kromogent assays, henholdsvis. Mens der er ingen obligatoriske LAL format, US Food and Drug Administration (FDA) forklarer i retningslinjer for baseret industrien dokument, at beslutningen om foretages i tilfælde af uoverensstemmelse i testresultater mellem forskellige LAL formater, på gel-blodprop assay5 .

Mange almindeligt anvendte laboratoriekemikalier (fx., EDTA) og kendte lægemiddel produkter (fx penicillin) forstyrrer LAL-undersøgelser,11. Indblanding identificeres normalt ved at vurdere inddrivelse af endotoxin standard aks på en kendt koncentration i en løsning, der indeholder testmateriale. Hvis spike opsving er mindre end 50% eller mere end 200%, så resultatet af LAL assay for er den givne prøvemateriale ugyldig på grund af hæmning eller ekstraudstyr, henholdsvis4. Nanoteknologi-baserede formuleringer er ofte komplekse og forstyrre LAL gennem en række mekanismer12,13,14. Mange tilgange er blevet beskrevet til at overvinde indblanding: prøve rekonstituering i specifikke buffere og overfladeaktive stoffer, protein inaktiveres ved opvarmning, ødelæggelse af lipid-baserede hule materialer ved opvarmning og supplere prøve med overskud divalent kationer5,12,13,14,15. Alternative metoder til situationer, hvor LAL indblanding ikke kan overvindes er også blevet beskrevet: ELISA, en HEK-TLR4 reporter celle line assay og massespektrometri16,17,18, 19.

Heri, er eksperimentelle procedurer for udførelse af gel-blodprop, turbiditet og kromogent LAL assays beskrevet. Disse analyser er også tilgængelige på nanoteknologi karakterisering Lab (NCL) hjemmeside20 i protokoller STE1.2 (turbiditet LAL), STE1.3 (gel-blodprop LAL) og STE1.4 (kromogent LAL). Det anbefales at foretage mindst to forskellige formater for at karakterisere den samme nano-formulering. Når resultaterne af Turbiditet og kromogent LAL er uenige, anses gel-blodprop resultater5. Når resultaterne af to LAL formater er uenige, gennemført yderligere undersøgelser, enten monocyt aktivering test (MAT) eller kanin pyrogen test (RPT) til at kontrollere LAL resultater er21. Det er vigtigt at bemærke, at hver metode bruges til registrering af endotoxin og sikkerhedsforsøg vurdering har fordele og begrænsninger21,22,23,24. Erkendelse af begrænsninger af den procedure, der anvendes til at karakterisere en given nanoteknologi formulering er afgørende for at opnå videnskabelig begrundelse for anvendelse af proceduren for optimal for at nano-formulering.

I denne undersøgelse, blev pegyleret liposomal doxorubicin brugt som en model nanopartikel formulering. Denne formulering er godkendt af det amerikanske FDA i 1995 og anvendes til behandling af kræft patienter på verdensplan25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse af nanopartikel prøver

  1. Forberede undersøgelse prøven i LAL grade vand.
  2. Hvis prøven pH-værdien er uden for området 6-8, Juster pH-værdien ved hjælp af pyrogen-fri natriumhydroxid eller saltsyre.
  3. Ved hjælp af LAL grade vand forberede flere fortyndinger af eksemplet undersøgelse. Sørg for, at den højeste fortynding ikke overskrider maksimale gyldig fortynding (MVD). Henvise til afsnittet diskussion for detaljer om MVD skøn.

2. forberedelse af reagenser fælles mellem LAL formater

  1. Fortynde koncentreret natriumhydroxidopløsning lager ved hjælp af pyrogen-fri LAL reagens vand til at forberede en arbejdsgruppe løsning ved en koncentration på 0,1 N.
  2. Fortynde koncentreret saltsyre lager ved hjælp af pyrogen-fri LAL reagens vand og forberede en brugsopløsning i en endelig koncentration på 0,1 N.
  3. Forberedelse af kontrol Standard Endotoxin (CSE)
    1. Rekonstruere CSE ifølge analysecertifikatet leveret af fabrikanten.
      Bemærk: Se afsnittet diskussion for vigtige noter vedrørende oplysningerne i certifikatet. Henvises til Tabel af materialer for detaljer vedrørende katalog nummer og anvendelsen af en bestemt CSE formulering i forskellige LAL formater.
  4. Forberedelse af LAL reagens
    1. Rekonstruere LAL reagens ifølge analysecertifikatet leveret af producenten.
      Bemærk: Se afsnittet diskussion for vigtige detaljer vedrørende LAL reagens. Henvises til Tabel af materialer for detaljer vedrørende katalog nummer og anvendelsen af en given LAL reagens formulering i forskellige LAL format.

3. turbiditet LAL Assay

  1. Forberedelse af Kalibreringsstandarder
    1. Med 900 µL af LAL klasse vand og 100 µL af CSE, fremstilles så mange mellemliggende fortyndinger som nødvendige for, at udarbejdelsen af en kalibreringsstandardens med et koncentrationsområde fra 0,001 til 1 EU/mL.
    2. Først etiketten rør og tilføje 900 μl af LAL-grade vand ind i hvert rør. Derefter tilsættes 100 μl af 10 EU/mL solutionn at forberede kalibrering standard med koncentrationen af 1EU/mL.
    3. Gentag den serielle 10-fold fortynding, som beskrevet ovenfor for at forberede tre lavere Kalibreringsstandarder. Kontroller, at fire Kalibreringsstandarder spænder fra 0,001 til 1 EU/mL er udarbejdet.
  2. Forberedelse af kvalitetskontrol
    1. Forberede en 0,05 EU/mL kvalitetskontrol ved at kombinere 50 µL af opløsningen 1 EU/mL CSE med 950 µL af LAL-grade vand.
      Bemærk: Se afsnittet diskussion for detaljer vedrørende kontrol forberedelse.
  3. Forberedelse af hæmning/ekstraudstyr (IEC) kontrol
    1. Forberede IEC med koncentration på 0,05 EU/mL ved at kombinere 25 µL af opløsningen 1 EU/mL CSE og 475 µL af prøven nanomateriale ved en given fortynding.
      Bemærk: Se afsnittet diskussion for yderligere detaljer.
  4. Eksperimentel procedure
    1. Tillad instrument til at varme op ved at dreje det på ca 30 min i forvejen. Set-up påvisning bølgelængde på 660 nm som det er passende for turbiditet LAL.
    2. Log på ved at skrive brugernavnet og adgangskoden.
    3. Åbn software (Table of Materials) ved at klikke på det tilsvarende ikon på en computerskærm.
    4. Vælg indsamle data på software-startskærmen. Postere den test-ID og data gruppe information i den tilsvarende plads i fanen Generelt på skærmen Hjem.
    5. Klik på fanen Hardware vælger apparattype fra en dropdown menu.
    6. Set-up påvisning bølgelængde på 660 nm som dette er relevant for turbiditet LAL af chosing LAL turbiditet metode.
    7. Kontrollere, at et serienummer, system-ID og serial portoplysninger vises på skærmen. Klik på OK. Klik på OK endnu en gang for at bekræfte.
    8. Indtast ID som prøven i den samme rækkefølge prøven er testet. Brug standardknapper til at angive den negative kontrol, kurve og test standardprøverne.
    9. Forberede dublerede rør til hver prøve og tilføje 200 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) af negativ kontrol (vand), Kalibreringsstandarder, kvalitetskontrol, IEC og test nanopartikler i forvejen afmærket glasrør.
    10. Tilføje 50 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) af LAL reagens til første test hætteglas, vortex det kortvarigt, og Indsæt i test slot i instrument karrusel. Hvis forholdet 1:1 er brugt, er mængden af LAL reagens 100 µL.
    11. Gentag fremgangsmåden ovenfor for andre prøver. Processen prøver én ad gangen.
      Bemærk: Henvise til diskussion sektionen for flere detaljer.

4. kromogent LAL

  1. Forberedelse af Kalibreringsstandarder
    1. Med 900 µL af LAL klasse vand og 100 µL af CSE, fremstilles så mange mellemliggende fortyndinger som nødvendige for, at udarbejdelsen af en kalibreringsstandardens med en koncentration på 1 EU/mL.
    2. Med 900 µL LAL-grade vand og 100 µL 1 EU/mL kalibreringsstandardens, forberede en anden kalibrering standard i en koncentration på 0,1 EU/mL.
    3. Gentag den serielle 10-fold fortynding, som beskrevet ovenfor for at forberede to lavere Kalibreringsstandarder. Kontroller, at fire Kalibreringsstandarder spænder fra 0,001 til 1 EU/mL er udarbejdet.
  2. Forberedelse af kvalitetskontrol.
    1. Forberede en 0,05 EU/mL kvalitetskontrol ved at kombinere 50 µL af opløsningen 1 EU/mL CSE med 950 µL af LAL-grade vand.
      Bemærk: Se afsnittet diskussion for detaljer vedrørende kontrol forberedelse.
  3. Forberedelse af hæmning/ekstraudstyr (IEC) kontrol
    1. Forberede 0,05 EU/mL ved at kombinere 25 μL af 1 EU/mL CSE løsningen med 475 μL af prøven nanomateriale.
      Bemærk: Se afsnittet diskussion for yderligere detaljer.
  4. Eksperimentel procedure
    1. Tillad instrument til at varme op ved at dreje det på ca 30 min i forvejen. Set-up påvisning bølgelængde på 405 nm som det er passende for turbiditet LAL.
    2. Åbn softwaren ved at klikke på det tilsvarende ikon på en computerskærm. Log på ved at skrive brugernavnet og adgangskoden.
    3. Vælg indsamle data på software-startskærmen. Angiv test ID og data gruppeoplysninger i tilsvarende plads i fanen Generelt på skærmen Hjem.
    4. Klik på fanen Hardware vælger apparattype fra en dropdown menu. Vælg instrumentet.
    5. Kontrollere, at et serienummer, system-ID og serial portoplysninger vises på skærmen. Klik på OK. Klik på OK endnu en gang for at bekræfte.
    6. Indtast ID som prøven i den samme rækkefølge prøven er testet. Brug standardknapper til at angive negativ kontrol, kurve og test standardprøverne.
    7. Forberede dublerede rør til hver prøve og tilføje 200 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) af negativ kontrol (vand), Kalibreringsstandarder, kvalitetskontrol, IEC og test nanopartikler i forvejen afmærket glasrør.
    8. Tilføje 50 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) af LAL reagens til første test hætteglas, vortex det kortvarigt, og Indsæt i test slot i instrument karrusel. Hvis forholdet 1:1 er brugt, er mængden af LAL reagens 100 µL.
    9. Gentag fremgangsmåden ovenfor for andre prøver. Processen prøver én ad gangen.

5. gel-blodprop LAL

Bemærk: Denne analysen identificerer forekomsten af endotoksiner i stikprøven baseret på visuel observation og registrering af en blodprop i reaktion tube. De eksperimenterende trin er beskrevet nedenfor. Bruge en bænk ark til at registrere resultaterne. Denne bænk ark er ikke obligatorisk, og andre måder at optagelse assay resultater er også acceptabel. Et eksempel på sådan en bænk ark er fastsat i supplerende materialer for bekvemmeligheden af en læser. Lambda (l) er følsomheden af gel-blodprop analysen og 0,03 EU/mL.

  1. Mærke så mange reaktion rør som skulle rumme antallet af analyserede klargjorte prøver. Henvise til bænken ark for at få oplysninger om antallet flergangsbestemmelser bruges i trin 1, trin 2 og trin 3 i analysen.
  2. Alikvot 100 μl vand, kontrol eller test stikprøven pr tube.
  3. Forberede CSE, således at den endelige koncentration er lig med 4λ.
  4. Kombinere 100 μL af standard nævnt ovenfor med 100 μl vand eller test prøve at opnå den endelige koncentration af CSE af 2λ. Gentag tre gange for at opnå lambda og halv-lambda og en fjerdedel lambda.
  5. Sørg for at temperaturen i vandbadet er 37 ° C.
  6. Tilsæt 100 μL af lysate pr. reagensglas, vortex kort og placere rack med alle rør i vandbad til 1 h.
  7. Vend røret med en jævn bevægelse.
  8. Manuelt at registrere resultater ved hjælp af "+" (fast blodprop) eller "-" (ingen blodprop eller løs blodprop) på arket bænk.
  9. Fortsættes analysen efter USP BET 854; bruge arket bænk som støttemateriale

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Eksempel på data genereret efter afprøvning denne formulering i LAL assays er vist i tabel 1. Pegyleret liposomal doxorubicin blandede sig med kromogent LAL ved fortynding 5. Men denne indgriben blev overvundet af større fortyndinger. Spike opsving var mellem 50 og 200%, da denne formulering blev testet på fortyndinger 50 og 500 i Turbiditet og kromogent LAL samt på fortynding 5 i turbiditet LAL. Når justeret med fortyndingsfaktoren, var resultaterne konsekvent mellem fortyndinger i begge assays. Endvidere, resultaterne var overensstemmelse mellem de tre assay formater.

Prøven Turbiditet LAL, EU/mg (spike opsving, %) Kromogent LAL, EU/mg, (spike opsving, %) Gel-blodprop LAL, EU/mg (test gyldig, ja eller nej)
Pegyleret liposomal doxorubicin (se tabel materialer)
Fortynding 5 0,01 (141) interferens < 0,75 (Y)
Fortynding 50 < 0.025 (187) 0.029 (82) < 1,5 (Y) *
Fortynding 500 < 0,25 (182) < 0,25 (86) < 3 (Y) **

Tabel 1: påvisning af endotoxin i pegyleret liposomal doxorubicin ved hjælp af LAL-undersøgelser vedrørende. Pegyleret liposomal doxorubicin blev testet ved hjælp af turbiditet, kromogent og gel-blodprop LAL-undersøgelser. Prøven indblanding blev estimeret ved hjælp af IECs. Spike opsving er vist i parentes. Værdier mellem 50 og 200% anses for acceptable ifølge USP BET 85 standard for endotoxin påvisning4. * og ** testresultater af denne prøve blev indhentet ved fortyndinger 100 og 200, henholdsvis. Gel-blodprop assay fortyndinger er forskellige fra dem, der anvendes i kromogent og turbiditet LAL fordi følsomhed og maksimale gyldig fortynding af denne analyse er lavere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Oplysningerne i denne protokol er blevet beskrevet før15,26 og bygger på flere lovgivningsmæssige dokumenter udgivet af US Food and Drug Administration (US FDA eller FDA) og Amerikas Forenede Stater farmakopé (USP)4 , 5 , 6 , 27, og er også tilgængelig på NCL hjemmeside20 i protokoller STE1.2 (turbiditet LAL), STE1.3 (gel-blodprop LAL) og STE1.4 (kromogent LAL).

Test-nanomaterialer tilberedes enten i LAL reagens vand eller sterilt, pyrogen-gratis PBS. PH i eksemplet undersøgelse er vigtig, fordi lav (< 6) og høj (> 8) pH vil forstyrre den optimale ydeevne af den lysate. Hvis pH-værdien af test-nanopartikel er uden for området 6-8, kan det justeres, ved hjælp af pyrogen-fri natriumhydroxid eller saltsyre. Når en sådan justering foretages, er det vigtigt at undgå, at prøven kontamineres fra mikroelektrode. Derfor, hvis du vil udføre denne procedure, en lille alikvot af prøven er fjernet i en separat tube og bruges til at måle pH-værdien.

Når prøven er udarbejdet i PBS eller en anden buffer, er tom bufferen også inkluderet i denne test. Koncentrationen af hver nanomateriale er specifik. Testen bruges til at anslå størrelsen af kontaminerende endotoxin pr. mg af det aktive farmaceutiske ingredienser (API). Imidlertid afhængigt af nano-formulering, koncentrationen kan også estimeres i mg af den samlede formulering eller et samlet element (fx., guld, sølv eller jern for guld, sølv og jernoxid nanopartikler, henholdsvis). Prøven er testet fra lager ved hjælp af flere fortyndinger ikke overstiger MVD. Alle fortyndinger af test-nanopartikler er udarbejdet ved hjælp af LAL-grade vand.

Tre parametre bruges til at beregne MVD. De er endotoxin limit (EL), prøve koncentration og assay følsomhed (λ)4. Brug følgende formel til at beregne endotoxin grænse (EL): EL = K/M, hvor K er en tærskel pyrogen dosis (fx., 5 EU/kg som omtalt i indledningen) og M er den maksimale dosis af test nanomateriale beregnet til administration pr. kilogram af kroppen vægt i en enkelt time4. Som omtalt ovenfor, estimering af EL for nanomaterialer bruges som radioaktivt lægemiddel eller medicinsk udstyr er afhængig af en pyrogen tærskeldosis eller formel, som er forskellige fra 5/M. Disse oplysninger er nævnt i indledningen og yderligere kunne revideres i USP og US FDA retningslinjer4,5,6. Den anbefalede endotoxin grænse for oftalmologiske løsninger og intraokulært enheder er fastsat i den amerikanske FDA retningslinje for disse produkter6. Når en dyremodel (fx., mus) blev brugt til at fastlægge dosis af nanoformulation, disse oplysninger bruges til at beregne den såkaldte menneskelige ækvivalent dosis (HED). HED beregnes ved at dividere den animalske dosis med en omregningsfaktor, som er specifikke for hver dyreart. For eksempel, er omregningsfaktoren 12.3, 6.2 og 3.1 for musen, rotte og kanin, henholdsvis27. Konvertering procedure og begrundelse for at anvende det er beskrevet i detaljer i de amerikanske FDA retningslinje27. Kræft therapeutics er ofte doseret pr. overflade krop areal, udtrykt i mg/m2. Man kan enten følge USP retningslinjen for at beregne EL for lægemidler doseres i milligram pr. kvadratmeter eller konvertere denne dosis til mg/kg interval. Dosis i mg/m2 kan justeres til dosis i mg/kg ved hjælp af en artsspecifik omregningsfaktor27. Et voksent menneske er 37 og angivet som Km at henvise til den masse konstant27. Km faktor har andele i kg/m2; Det er lig med kropsvægten i kg (kg) divideret med overfladeareal i kvadratmeter (m2)27. For eksempel, svarer en menneskelige dosis eller HED 74 mg/m2 til 2 mg/kg eller 74/37. For at bestemme MVD, bruge den følgende formel, som også er tilgængelige fra standarden, USP BET 85: MVD = (EL x prøve koncentration) / λ)4. I en hypotetisk situation, en nanopartikel prøve koncentration er 10 mg/mL og dens maksimale dosis i musen er 615 mg/kg. I dette tilfælde Danskhed er 615/12.3 = 50 mg/kg; EL for alle ruter undtagen Intratekal er 0,1 EU/mg (5 kg-EU-50 mg/kg) og MVD er 1.000 ((0,1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 EU/mL).

Ofte, når man skal evaluere endotoxin forurening i en forskning grade nanomateriale, er dosis oplysninger ikke tilgængelige. Der er ingen harmoniserede procedure for skøn MVD og EL for disse materialer. Dette casestudie udfører testen direkte fra lager (almindeligt koncentrationen af denne løsning er 1 mg/mL) og på flere fortyndinger, normalt 5-, 50, 500- og 5.000-folder. Når dosis, indgiftsmåde, prøve koncentration og infusionen tid for den givne test nanomateriale ændring, ændre EL og MVD også. Derfor skal man vurdere oplysninger og udføre forkalkulationen af EL og MVD i forbindelse med andre parametre i forbindelse med beløb, tid, tilsigtede indgiftsmåde og koncentrationen af en given formulering.

Det er vigtigt at bemærke, at nummeret katalog og produktspecifikationer (fx., potens, beløb pr. hætteglas) i på CSE er forskellige for forskellige LAL formater. CSE bruges i turbiditet LAL kan også bruges i en gel-blodprop LAL. Men CSE for et kromogent LAL er specifikke for dette assay format. Vejledningen nedenfor er generelle og gælder for den tilpassede søgemaskine bruges i alle assay formater. Den tilpassede søgemaskine er en E. coli LPS (LPS) leveres som et frysetørret pulver. Denne standard er certificeret af fabrikanten mod en Reference Standard Endotoxin (RSE) med en kendt styrke. Indholdet af hætteglasset indeholdende CSE skal rekonstitueres med ~3.2 - 5,0 mL af pyrogen-fri LAL reagens vand. Ud over forskellen mellem CSE bruges til forskellige assay formater, er mængden af rekonstitution også specifikt for hvert parti af denne standard. Derfor skal man beregne den endelige koncentration af CSE stamopløsning for hvert parti af standard. Beregningen udføres baseret på styrken af standarden og det beløb, der er indeholdt i hvert hætteglas. Analysecertifikatet specifikke for hvert parti af endotoxin standard indeholder oplysninger om potens og beløb pr. hætteglas. Skal man nøje vortex standarden for 30-60 sekunder, både under rekonstitution og under brug. Det anbefales også at udføre rekonstituering med 5-10 min. afregning gange og over en 30-60 min tidsramme at sikre, at alle frysetørret materiale går i opløsning. Før du bruger i analysen, reagensglasset stock CSE til stuetemperatur. Efter rekonstituering, CSE materiel kan være nedkølet til opbevaring og er stabil i fire uger.

Svarende til den tilpassede søgemaskine, LAL reagens er også specifikt for hvert format. Vejledningen nedenfor er generelle og gælder for alle LAL assay formater. LAL reagens er fastsat som et frysetørret pulver. Producentens anbefalinger følges for at rekonstruere hvert hætteglas. Enten LAL grade vand eller buffer hæmme beta-glucaner kan bruges. Bufferen hæmme beta-glucaner foretrækkes i denne case-study, fordi det giver mulighed for undtagelse indblanding fra beta-glucaner. Denne falsk-positive indblanding er meget almindeligt i nanomaterialer, fordi cellulose-acetat filtre er almindeligt anvendt under nanomateriale syntese og tjene som en kilde til glucan forurening15. De fleste hætteglas vil kræve rekonstitution til et endelige mængden af 5 mL. Baseret på over 10 år af forfatternes erfaring med denne analyse, er det blevet bemærket at medtagelsen af denne buffer sinker reaktionen og kan kræve, at øge den maksimale gang i instrument-indstillinger til at tillade den laveste kalibrator på en koncentration på 0,001 EU/mL til at udvikle.

For at sikre nøjagtige fortynding under udarbejdelsen af standarder, anbefales det at bruge 10-fold fortynding trin. Seriel 10-fold fortyndinger kan fremstilles ved spiking 100 µL af bestanden eller en standard med højere koncentration i 900 µL af pyrogen-gratis vand. Da koncentrationen af CSE bestanden er som regel høj (~ 1.000 EU/mL), forberedelse af mellemliggende fortyndinger med koncentrationer 100 og 10 EU/mL anbefales før forberede assay kalibrator med en koncentration på 1 EU/mL. To forhold mellem prøve og lysate er beskrevet i denne protokol. Selv om begge nøgletal er almindeligt anvendt, er kurve linearitet acceptabel, men ikke ideel når der bruges forholdet 4:1 og buffer hæmme beta-glucaner (Se Tabel af materialer).

De samme regler gælder som beskrevet ovenfor vedrørende kalibrering standardpraeparat også for forberedelsen af kvalitetskontrol (QC). Disse kontrolelementer bruges til at kontrollere, at analysen fungerer korrekt. Det er udarbejdet af spiking CSE kendt mængde i vandet pyrogen-fri. Koncentrationen af QC er normalt valgt i midten af rækken assay. Rækken af turbiditet LAL assay er 0,001 til 1 EU/mL. Derfor bruges en QC i en koncentration på 0,05 EU/mL. Andre koncentrationer inden analysen kan også bruges i forberedelsen af kvalitetskontrollen.

Kontrolelementet hæmning enhancement (IEC) er også kendt som positive produktkontrol (PPC). Det er udarbejdet af spiking en kendt koncentration af CSE i prøven. Koncentration af IEC (PPC) er normalt valgt i midten af rækken assay. Rækken af turbiditet LAL assay er 0,001 til 1 EU/mL. Derfor bruges IEC i en koncentration på 0,05 EU/mL. For at forberede denne IEC skal man kombinere 50 µL af opløsningen 1 EU/mL CSE med 950 µL af prøven-nanopartikler. IEC er forberedt for hver fortynding af en test-nanomateriale. For eksempel, hvis en nano-formulering er testet på tre fortyndinger (1:50, 1: 500 og 1:5, 000), må man forberede tre IECs, en for hver af disse fortyndinger. Andre koncentrationer inden analysen kan også bruges til at forberede IEC prøven. Dette objekt bruges til at forstå gyldigheden af testresultaterne for den givne nano-formulering. Ifølge USP er test-resultaterne gyldig, hvis spike genopretningen af IEC (PPC) er mellem 50 og 200%4. Spike opsving er mindre end 50% betyder at test-nanomateriale hæmmer endotoxin påvisning og derfor testen resultere undervurdering endotoxin forurening og er ugyldigt. Spike opsving over 200% tyder på, at test-materiale øger assay resultatet eller indeholder et for højt niveau af kontaminerende endotoksinet. For ekstraudstyr er assay resultatet også unøjagtige. Eksempler på sådanne interferenser og nogle måder til at overvinde dem har været beskrevet tidligere12,15.

Når du udfører Turbiditet og kromogent assays, anbefales det at bruge en repeater pipette til at tilføje LAL reagens til alle prøver. Den gennemsnitlige instrument Operationstid er 7200 sekunder. Reaktionen kan dog være hurtigere eller langsommere med visse masser af den lysate. I tilfælde, når reaktionen er langsom, kan man brug at ændre indstillingerne for instrument til 9600s eller længere. Denne ændring vil gøre det muligt for de laveste kalibrator at udvikle.

Pegyleret liposomal doxorubicin er en formulering der indeholder en aktive farmaceutiske ingredienser (API) i en koncentration på 2 mg/mL. Det bruges i klinikken som en dosis på 50 mg/m2. For at konvertere denne dosis til mg/kg interval, er det divideret med faktor 3727. Dosis af pegyleret liposomal doxorubicin i mg/kg, derfor 1,35. For at beregne EL, 5 (tærskel pyrogen dosis i EU/kg) divideret med 1,35 (Doxil dosis i mg/kg) og opnå 3,7 EU/mg4. Dette tal betyder, at pegyleret liposomal doxorubicin i dosis på 1,35 mg/kg kan være sikkert administreret enkelt timen hvis endotoxin i formuleringen ikke overstige 3,7 EU/mg, hvor mg refererer til API.

Dernæst bruge disse oplysninger til at beregne MVD for LAL assays. Følsomhed (lambda) af turbiditet, kromogent og gel-blodprop assays præsenteret i denne undersøgelse er 0,001, 0,001 og 0,03 EU/mL, henholdsvis. MVD er derfor 7,407 for Turbiditet og kromogent assays ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 EU/mL), og 247 til gel-blodprop assay ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 EU/mL).

Doxorubicin har en bred absorbans spektrum, der overlapper med assay boelgelaengden den kromogent LAL28,29. Desuden, de fleste Liposom formuleringer er grumset og vises mælket. Denne iboende turbiditet er den meget almindelig årsag til interferens i Liposomer med turbiditet assay. I forbindelse med pegyleret liposomal doxorubicin, blev interferens på grund af turbiditet overvundet af fortynding, fem som dokumenteres af spike opsving værdier mellem 50 og 200% (tabel 1). Men på den samme fortynding doxorubicin koncentration var stadig høj nok til at forstyrre den kromogent LAL (tabel 1). To efterfølgende fortyndinger (50 og 500) bidrog til at overvinde pegyleret liposomal doxorubicin interferens med kromogent LAL. Da gel-blodprop assay er uafhængig af Turbiditet og prøvefarve, og niveauet af endotoxin i formuleringen ligger inden for området gel-blodprop, pegyleret liposomal doxorubicin ikke forstyrre gel-blodprop assay på alle testede fortyndinger. I denne case study, blev flere fortyndinger af pegyleret liposomal doxorubicin brugt til disse assays. Fortyndinger 5, 50 og 500 for Turbiditet og kromogent samt 50, 100 og 200 til gel-blodprop assay blev valgt fordi de er inden for MVD. MVD af gel-blodprop assay er lavere end Turbiditet og kromogent LALs, fordi følsomheden af denne analyse er også lavere. Hvis formuleringen blandet sig med LAL ved fortynding 500 i Turbiditet og kromogent assays, kunne analyse på højere fortyndinger (fx, 5.000, 6.000, 7.000 eller 7,407) udføres. Da af endotoxin fremstillet ved fortynding 50 i gel-blodprop analysen var under EL, blev analyse af denne formulering på lavere fortyndinger ikke udført. Men i andre tilfælde, afprøvning kunne fortsættes på fortyndinger 20, 10, 5 eller 2 til at identificere den laveste ikke blande fortynding og forstå om niveauet af endotoxin i formuleringen er under EL.

Det er vigtigt at nævne, at det for gel-blodprop assay er afgørende for at slukke funktionen vand omsætning i vandbad til varigheden af denne analyse eller bruge et vandbad uden en sådan mulighed, fordi vandflow skader størkne og kan påvirke nøjagtigheden af g El-blodprop LAL assay. Det er ikke altid muligt at overvinde nanopartikel interferens med LAL assays ved at øge prøve fortyndinger. Strategier og nogle metoder til at overvinde forskellige former for indblanding og eksempler på nanopartikler almindeligt repræsenterer et problem for LAL assays er blevet drøftet af andre grupper og os andre steder12,13,14 ,15,30,31. Den analyse, der præsenteres i dette håndskrift er baseret på en model formulering. Erfaring med andre nanoformulations kan være forskellige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev støttet af føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt HHSN261200800001E. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis synspunkter eller politikker af Department of Health og Human Services, og heller ikke nævner af firmanavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36, (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11, (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4, (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. Bacterial Endotoxins Test. (2011).
  5. FDA, U. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. (2012).
  6. FDA, U. Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44, (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19, (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409, (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220, (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5, (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9, (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. NCL. NCL assay cascade. Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015).
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4, (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9, (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33, (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160, (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31, (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9, (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11, (9-10), 1157-1175 (2017).
Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter