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Bioengineering

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

Erkennung von Endotoxinen in Nanomaterialien stellt eine der großen Herausforderungen im Bereich der Nanomedizin. Hier präsentieren wir Ihnen eine Fallstudie, die beschreibt den Rahmen, bestehend aus drei verschiedenen LAL-Formaten, mögliche Endotoxin-Kontamination in Nanopartikel zu schätzen.

Abstract

Wenn Sie in pharmazeutischen Produkten, eine gramnegative bakterielle Zellwand Komponente Endotoxin (oft auch als Lipopolysaccharid) kann dazu führen, dass Entzündungen, Fieber, Hypo- oder Hypertonie, und, in extremen Fällen kann zu führen Gewebe und Organ-Schäden, die möglicherweise werden Sie tödlich. Die Beträge von Endotoxin in pharmazeutischen Produkten sind daher streng geregelt. Unter den Methoden für die Endotoxin-Erkennung und Quantifizierung ist der Test Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) weltweit verbreitet. Während der LAL-Test Arzneimittel stören kann, stellen Nano-Formulierungen aufgrund ihrer Komplexität eine besondere Herausforderung dar. Dieses Papier soll eine praktische Anleitung zum Forscher unerfahrenen bei der Abschätzung der Endotoxine in Nanomaterialien und Nanopartikel formuliert Drogen zu bieten. Hier werden praktische Empfehlungen für die Durchführung von drei LAL-Formate einschließlich Trübung, chromogenen und Gel-Clot Assays diskutiert. Diese Tests können zur Endotoxin-Kontamination in Nanotechnologie-basierte Medikamente, Impfstoffe und Adjuvantien herangezogen werden.

Introduction

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Ein Endotoxin ist ein Baustein der gramnegativen bakteriellen Zellwand1,2. Es kann aktivieren Immunzellen auf sehr niedrige (Picogram) Konzentrationen1,2. Die proinflammatorischen Mediatoren (Zytokine, Leukotrienen, Eikosanoide, etc.) produziert von den Zellen als Reaktion auf ein Endotoxin sind verantwortlich für Fieber, Hypotonie, Hypertonie und schweren gesundheitlichen Problemen einschließlich Multiorganversagen 1 , 2 , 3. immunvermittelte Nebenwirkungen ausgelöst durch das Endotoxin Schweregrad auf seine Potenz durch die Endotoxin-Zusammensetzung und Struktur bestimmt und in internationalen Endotoxin Units (IUs oder EUs)3gemessen. Die Anzahl dieser Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht wird verwendet, um eine pyrogene Schwellendosis von Endotoxin festgelegt. Diese Dosis ist 5 EU/kg für Arzneimittel über alle Routen aber die intrathekale Route verabreicht. Pro Quadratmeter Körperoberfläche, intraokulare Flüssigkeiten, radioaktive Arzneimittel und Produkte verabreicht über intrathekale Route dosiert Medikamente haben eine unterschiedliche pyrogene Schwellendosis, die 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (wo V ist die Volumen des Produktes für die Verwaltung), und 0,2 EU/kg, bzw.4. Weitere Details über die pyrogene Schwellendosis für verschiedene Medikamente und Geräte werden zur Verfügung gestellt und4,5,6an anderer Stelle erläutert.

Tiere sind sehr unterschiedlich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin-vermittelten Reaktionen. Menschen, nicht-menschlichen Primaten und Kaninchen sind unter den meisten extrem empfindlich auf Endotoxine3Arten. Endotoxin-vermittelte Nebenwirkungen bei Patienten zu vermeiden und zu verhindern, dass falsche Schlussfolgerungen der präklinischen Toxizität und Wirksamkeitsstudien, ist es wichtig, genau zu erkennen und zu quantifizieren, Endotoxine in beiden klinischen und präklinischen Grade Formulierungen. Einige derzeit verfügbare Methoden können diese Aufgabe erreichen. Eine davon ist die Probe, Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), die häufig, weltweit zu Bildschirm biomedizinische Produkte für die mögliche Endotoxin Verunreinigung sowie verwendet wird zu bakteriellen Infektionen7,8,9zu erkennen. Die lysate aus Amöbozyten bereit ist, die Zellen im Blut von Pfeilschwanzkrebse Limulus Polyphemus präsentieren mit Wohnsitz in der Ostküste des Kontinents Nordamerika7. Interessanterweise gibt es ein paar verschiedene Arten von Pfeilschwanzkrebse (Tachypleus Gigas und Tachypleus Tridentatus) in Asien10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) wird in mehreren asiatischen Ländern verwendet, für den Nachweis von Endotoxin ähnlich wie die LAL in anderen Cuntries10verwendet wird. Die Lysaten (LAL und TAL) enthalten eine Gruppe von Proteinen, die bei Aktivierung Protease-Aktivität zu verleihen. Eines dieser Proteine, die so genannte Faktor C wird bei Kontakt mit Endotoxin aktiviert. Aktivierten Faktor C spaltet Faktor B, die wiederum auch wird eine Protease und bindet sich ein Pro-gerinnende Enzym zu einer Blutgerinnung Enzym herzustellen. Das Ergebnis dieser Kette von Reaktionen ist die Bildung eines Gels, eine Erhöhung der in der Probe Trübung und in Anwesenheit von einem chromogenen Substrat, das Erscheinungsbild der ein farbiges Produkt, das als Grundlage für Gel-Clot, Trübung und chromogenen Tests dienen, bzw.. Zwar gibt es keine verbindlichen LAL-Format, die US Food and Drug Administration (FDA) erklärt in der Anleitung für Papier, Industrie, daß im Falle von Abweichungen in den Testergebnissen zwischen verschiedenen LAL-Formaten, die Entscheidung getroffen wird anhand der Gel-Clot-Assay5 .

Viele gängigen Laborchemikalien (zB., EDTA) und bekannte Droge Produkte (z. B. Penicillin) LAL stören assays11. Der Eingriff wird in der Regel durch Beurteilung der Erholung von der Endotoxin standard versetzt in einer bekannten Konzentration in einer Lösung, die das Testmaterial identifiziert. Wenn die Spitze Erholung weniger als 50 % oder mehr als 200 %, dann das Ergebnis der LAL assay für ist die gegebenen Testmaterial durch Hemmung oder Verstärkung, bzw.4ungültig. Nanotechnologie-basierte Formulierungen sind oft komplex und stören die LAL durch eine Vielzahl von Mechanismen12,13,14. Viele Ansätze sind beschrieben worden, um die Störungen zu überwinden: Probe Rekonstitution in speziellen Puffer und Tensiden, Protein-Inaktivierung durch Erhitzen, Vernichtung von Lipid-basierte hohl Material durch Erhitzen und Ergänzung der Probe mit Selbstbeteiligung zweiwertigen kationen5,12,13,14,15. Alternative Methoden für Situationen, in denen LAL Störungen überwunden werden kann sind auch beschrieben worden: ELISA, ein HEK-TLR4 Reporter Cell line Assay und Massenspektrometrie16,17,18, 19.

Experimentelle Verfahren für die Durchführung von Gel-Clot, Trübung und chromogenen LAL-Assays sind hier beschrieben. Diese Tests sind auch auf die Nanotechnologie Charakterisierung Lab (NCL) Webseite20 in Protokollen STE1.2 (Trübung LAL), STE1.3 (Gel-Clot LAL) und STE1.4 (chromogene LAL). Es wird empfohlen, mindestens zwei verschiedene Formate zur Charakterisierung der gleichen Nano-Formulierung durchzuführen. Wenn Ergebnisse der Trübung und chromogenen LAL nicht einverstanden sind, gelten die Gel-Clot Ergebnisse5. Wenn die Ergebnisse von zwei LAL Formaten nicht einverstanden sind, durchgeführt21zusätzliche Studien mit Monocyte Aktivierung Test (MAT) oder Kaninchen Pyrogentest (RPT), um LAL zu überprüfen sind. Es ist wichtig zu beachten, dass jede Methode Endotoxin-Erkennung und Pyrogenität Bewertung Vorteile und Einschränkungen21,22,23,24 hat. Grenzen des Verfahrens verwendet, um eine gegebene Nanotechnologie Formulierung charakterisieren zu erkennen ist wichtig, wissenschaftliche Rechtfertigung für die Anwendung des Verfahrens für die Nano-Formulierung optimal erhalten.

In dieser Studie wurde pegylierte liposomale Doxorubicin als Modell Nanopartikel Formulierung verwendet. Diese Formulierung wurde 1995 von der US-Zulassungsbehörde FDA genehmigt und zur Behandlung von Krebs-Patienten weltweit25.

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Protocol

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1. Vorbereitung der Nanopartikel-Proben

  1. Die Studie Probe in LAL Grade Wasser vorbereiten.
  2. Wenn der pH-Wert der Probe außerhalb des Bereichs von 6-8 ist, passen Sie den pH-Wert mit pyrogenfreie-freie Natronlauge oder Salzsäure an.
  3. Mit LAL Grade Wasser bereiten mehrere Verdünnungen der Studie Probe. Stellen Sie sicher, dass die höchsten Verdünnung maximal gültigen Verdünnung (MVD) nicht überschreitet. Siehe Abschnitt "Diskussion" Einzelheiten zum MVD Schätzung.

2. Vorbereitung der Reagenzien gemeinsamen zwischen LAL-Formate

  1. Verdünnen Sie konzentrierter Natronlauge Lager mit pyrogenfreie-freie LAL Reagenz Wasser, um eine funktionierende Lösung mit einer Konzentration von 0,1 N. vorbereiten
  2. Verdünnen Sie konzentrierter Salzsäure Lager mit pyrogenfreie LAL Reagenz Wasser zu und bereiten Sie eine funktionierende Lösung auf eine Endkonzentration von 0,1 N.
  3. Vorbereitung von Control Standard Endotoxin (CSE)
    1. Bereiten Sie die CSE gemäß den vom Hersteller mitgelieferten Analysezertifikat.
      Hinweis: Siehe Abschnitt Diskussion für wichtige Hinweise zu den Angaben in der Bescheinigung. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Details der Katalognummer und Anwendung einer bestimmten CSE-Formulierung in verschiedenen Formaten der LAL.
  4. Vorbereitung der LAL-Reagenz
    1. Bereiten Sie das LAL-Reagenz laut der Bescheinigung der Analyse des Herstellers.
      Hinweis: Siehe Abschnitt Diskussion für wichtige Details bezüglich LAL Reagenz Vorbereitung. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Details der Katalognummer und Anwendung einer bestimmten LAL Reagenz Formulierung in anderen LAL-Format.

3. Trübung LAL-Test

  1. Vorbereitung der Kalibrierstandards
    1. Mit 900 µL LAL Grad Wasser und 100 µL der CSE, bereiten Sie so viele fortgeschrittene Verdünnungen wie notwendig, um die Vorbereitung einer Kalibrierung mit einem Konzentrationsbereich von 0,001 bis 1 EU/mL standard ermöglichen.
    2. Zuerst beschriften Sie Rohre und fügen Sie 900 μl LAL-Grade Wasser in jedes Rohr. Fügen Sie dann 100 μL 10 EU/mL Solutionn Kalibrierung Standard mit Konzentration von 1EU/mL vorzubereiten.
    3. Wiederholen Sie die serielle 10-divisibel Verdünnung, wie oben beschrieben, drei unteren Kalibrierstandards vorzubereiten. Vergewissern Sie sich, dass vier Kalibrierstandards von 0,001 bis 1 EU/mL vorbereitet worden sind.
  2. Vorbereitung der Qualitätskontrollen
    1. Bereiten Sie eine 0,05 EU/mL Qualitätskontrolle durch die Kombination von 50 µL der Lösung 1 EU/mL CSE mit 950 µL LAL-Grade Wasser.
      Hinweis: Siehe Abschnitt "Diskussion" für Details zur Vorbereitung der Kontrolle.
  3. Vorbereitung der Hemmung/Verbesserung (IEC) Kontrollen
    1. Bereiten Sie IEC mit Konzentration von 0,05 EU/mL durch die Kombination von 25 µL 1 EU/mL CSE-Lösung und 475 µL Test Nanomaterials in einer bestimmten Verdünnung.
      Hinweis: Siehe Abschnitt "Diskussion" für weitere Details.
  4. Versuchsdurchführung
    1. Lassen Sie das Instrument zum Aufwärmen durch Rechtsdrehen auf ungefähr 30 Minuten im Voraus. Aufbau der Detektion Wellenlänge 660 nm als dies eignet sich für die Trübung LAL.
    2. Durch die Eingabe von Benutzername und Passwort anmelden.
    3. Öffnen Sie die Software (Table of Materials), indem Sie auf das entsprechende Symbol auf einem Computerbildschirm.
    4. Wählen Sie auf dem Startbildschirm Software Daten zu sammeln . Geben Sie die Informationen zur Test-ID und Daten in den entsprechenden Raum in der Registerkarte " Allgemein " auf dem home-Bildschirm.
    5. Klicken Sie auf die Registerkarte " Hardware " wählen Sie den Gerätetyp aus ein Dropdown-Menü.
    6. Aufbau der Detektion Wellenlänge 660 nm ist geeignet für die Trübung LAL durch die Wahl die LAL Trübung Methode.
    7. Stellen Sie sicher, dass eine Seriennummer, System-ID und seriellen Port-Informationen auf dem Bildschirm angezeigt werden. Klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf "OK" ein weiteres Mal um zu bestätigen.
    8. Geben Sie die Proben-ID in der gleichen Reihenfolge, die die Probe getestet wird. Verwenden Sie Standardschaltflächen zur Eingabe der Negativkontrolle, Kurve und Test Standardproben.
    9. Bereiten Sie doppelte Rohre für jede Probe und fügen Sie 200 µL (Test im Verhältnis 4:1) oder 100 µL (Test-Verhältnis 1:1) negativ-Kontrolle (Wasser), Kalibrierstandards, Qualitätskontrolle, IEC und Test Nanopartikel in Pre beschrifteten Glasröhrchen.
    10. Erste Küvette, Wirbel, die es kurz und Einfügen in Test in das Instrument Karussell Schlitz fügen Sie 50 µL (Test im Verhältnis 4:1) oder 100 µL (Test-Verhältnis 1:1) LAL Reagenz hinzu. Wenn das Verhältnis 1:1 verwendet wird, ist das Volumen des LAL Reagenz 100 µL.
    11. Wiederholen Sie den Vorgang für andere Proben oben beschrieben. Prozesses Proben einzeln nacheinander.
      Hinweis: Siehe Abschnitt "Diskussion" für weitere Details.

(4) chromogenen LAL

  1. Vorbereitung der Kalibrierstandards
    1. Mit 900 µL LAL Grad Wasser und 100 µL der CSE, bereiten Sie so viele fortgeschrittene Verdünnungen wie notwendig, um die Vorbereitung einer Kalibrierung standard mit einer Konzentration von 1 EU/mL zu ermöglichen.
    2. Mit 900 µL LAL-Grade Wasser und 100 µL 1 EU/mL Kalibrierstandards, bereiten Sie einen zweiten Kalibrierung Standard in einer Konzentration von 0,1 EU/mL.
    3. Wiederholen Sie die serielle 10-divisibel Verdünnung, wie oben beschrieben, zwei unteren Kalibrierstandards vorzubereiten. Vergewissern Sie sich, dass vier Kalibrierstandards von 0,001 bis 1 EU/mL vorbereitet worden sind.
  2. Vorbereitung der Qualitätskontrollen.
    1. Bereiten Sie eine 0,05 EU/mL Qualitätskontrolle durch die Kombination von 50 µL der Lösung 1 EU/mL CSE mit 950 µL LAL-Grade Wasser.
      Hinweis: Siehe Abschnitt "Diskussion" für Details zur Vorbereitung der Kontrolle.
  3. Vorbereitung der Hemmung/Verbesserung (IEC) Kontrollen
    1. Bereiten Sie 0,05 EU/mL durch die Kombination von 25 μL der 1 EU/mL CSE-Lösung mit 475 μL Test Nanomaterials.
      Hinweis: Siehe Abschnitt "Diskussion" für weitere Details.
  4. Versuchsdurchführung
    1. Lassen Sie das Instrument zum Aufwärmen durch Rechtsdrehen auf ungefähr 30 Minuten im Voraus. Aufbau der Detektion Wellenlänge auf 405 nm als dies eignet sich für die Trübung LAL.
    2. Öffnen Sie die Software, indem Sie auf das entsprechende Symbol auf einem Computerbildschirm. Durch die Eingabe von Benutzername und Passwort anmelden.
    3. Wählen Sie auf dem Startbildschirm Software Daten zu sammeln . Geben Sie Test-ID und Daten-Gruppe in den entsprechenden Raum in der Registerkarte " Allgemein " auf dem home-Bildschirm.
    4. Klicken Sie auf die Registerkarte " Hardware " wählen Sie den Gerätetyp aus ein Dropdown-Menü. Wählen Sie das Instrument.
    5. Stellen Sie sicher, dass eine Seriennummer, System-ID und seriellen Port-Informationen auf dem Bildschirm angezeigt werden. Klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf "OK" ein weiteres Mal um zu bestätigen.
    6. Geben Sie die Proben-ID in der gleichen Reihenfolge, die die Probe getestet wird. Standardschaltflächen zur Negativkontrolle, geben verwenden standard-Kurve und Test-Samples.
    7. Bereiten Sie doppelte Rohre für jede Probe und fügen Sie 200 µL (Test im Verhältnis 4:1) oder 100 µL (Test-Verhältnis 1:1) negativ-Kontrolle (Wasser), Kalibrierstandards, Qualitätskontrolle, IEC und Test Nanopartikel in Pre beschrifteten Glasröhrchen.
    8. Erste Küvette, Wirbel, die es kurz und Einfügen in Test in das Instrument Karussell Schlitz fügen Sie 50 µL (Test im Verhältnis 4:1) oder 100 µL (Test-Verhältnis 1:1) LAL Reagenz hinzu. Wenn das Verhältnis 1:1 verwendet wird, ist das Volumen des LAL Reagenz 100 µL.
    9. Wiederholen Sie den Vorgang für andere Proben oben beschrieben. Prozesses Proben einzeln nacheinander.

(5) Gel-Clot LAL

Hinweis: Dieser Test erkennt das Vorhandensein von Endotoxinen in die Stichprobe anhand der visuellen Beobachtung und Erkennung eines Gerinnsels in das Reaktionsgefäß. Die experimentellen Schritte sind nachfolgend beschrieben. Benutzen Sie ein Bank-Blatt, um die Ergebnisse festzuhalten. Dieses Blatt der Bank ist nicht zwingend, und andere Möglichkeiten der Aufnahme der Untersuchungsergebnisse sind auch akzeptabel. Ein Beispiel für solch ein Blatt der Bank erfolgt in ergänzende Materialien für die Bequemlichkeit eines Lesers. Lambda (l) ist die Empfindlichkeit des Gel-Clot-Assays und 0,03 EU/mL.

  1. Beschriften Sie soviele Reaktionsgefäßen wie notwendig, um die Anzahl der analysierten Proben unterzubringen. Beziehen sich auf die Bank-Blatt für Details über die Anzahl der Wiederholungen, die in Schritt 1, Schritt 2 und Schritt 3 des Assays verwendet.
  2. Aliquoten 100 μl Wasser, Steuerelemente oder Test Probe pro Röhre.
  3. Bereiten Sie CSE vor, so dass die Endkonzentration 4λ entspricht.
  4. Kombinieren Sie 100 μL der Norm genannten mit 100 μl Wasser oder Test Probe die Endkonzentration von CSE 2λ zu erreichen. Wiederholen Sie drei weitere Male, Lambda und halb-Lambda und Lambda-ein Viertel zu erreichen.
  5. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur im Wasserbad 37 ° C.
  6. Fügen Sie 100 μl der lysate pro Reagenzglas, Wirbel kurz hinzu und platzieren Sie die Zahnstange mit den Rohren in das Wasserbad für 1 h.
  7. Invertieren Sie das Rohr mit einer fließenden Bewegung.
  8. Manuell ein Rekordergebnis mit "+" (festen Gerinnsel) oder "-" (keine Gerinnsel oder losen Blutgerinnsel) auf dem Blatt der Bank.
  9. Fahren Sie mit der Analyse nach USP Wette 854; verwenden Sie das Blatt der Bank als Trägermaterial

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Representative Results

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Das Beispiel von Daten nach der Prüfung dieser Formulierung in LAL-Tests ist in Tabelle 1dargestellt. Pegyliertem liposomalen Doxorubicin mischte sich mit chromogenen LAL bei Verdünnung 5. Jedoch wurde diese Störungen durch höhere Verdünnungen überwinden. Spike Erholung war zwischen 50 und 200 %, wenn diese Formulierung bei Verdünnungen 50 und 500 in Trübung und chromogenen LAL sowie bei Verdünnung 5 Trübung LAL getestet wurde. Wenn durch den Verdünnungsfaktor angepasst, entsprachen die Ergebnisse zwischen Verdünnungen in beiden Tests. Darüber hinaus waren die Ergebnisse konsistent zwischen den drei Test-Formaten.

Probe Trübung LAL, EU/mg (spike Recovery, %) Chromogene LAL, EU/mg (spike Recovery, %) Gel-Clot LAL, EU/mg (Test gültig, ja oder Nein)
Pegyliertem liposomalen Doxorubicin (siehe die Tabelle Materialien)
Verdünnung 5 0.01 (141) Störungen < 0,75 (Y)
Verdünnung 50 < 0,025 (187) 0.029 (82) < 1,5 (Y) *
Verdünnung 500 < 0,25 (182) < 0,25 (86) < 3 (Y) **

Tabelle 1: Nachweis von Endotoxin im pegylierte liposomale Doxorubicin mit LAL assays. Pegyliertem liposomalen Doxorubicin wurde getestet mit Trübung, chromogenen und Gel-Clot LAL assays. Probe-Störungen wurde anhand der bereits geschätzt. Spike-Wiederherstellung wird in Klammern angezeigt. Werte zwischen 50 und 200 % sind nach der USP Wette 85 standard für Endotoxin Nachweis4akzeptabel. * und ** die Testergebnisse dieses Beispiels wurden bei Verdünnungen 100 und 200, bzw. erhalten. Die Gel-Clot-Assay-Verdünnungen unterscheiden sich von denen in chromogenen verwendet und Trübung LAL weil Empfindlichkeit und maximale gültige Verdünnung des Assays niedriger sind.

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Discussion

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Die Informationen in diesem Protokoll ist beschrieben worden, vor15,26 und stützt sich auf mehrere regulatorischer Dokumente, herausgegeben von der US Food and Drug Administration (FDA oder FDA) und Vereinigte Staaten Arzneibuch (USP)4 , 5 , 6 , 27, und ist auch auf den NCL Webseite20 Protokolle STE1.2 (Trübung LAL), STE1.3 (Gel-Clot LAL) und STE1.4 (chromogene LAL).

Test-Nanomaterialien werden entweder in LAL Reagenz Wasser oder sterile, pyrogenfreie-freie PBS vorbereitet. Der pH-Wert der Probe Studie ist wichtig, da Low (< 6) und hohen (> 8) pH-Wert die optimale Leistung der lysate beeinträchtigt. Wenn der pH-Wert des Test-Nanopartikel außerhalb des Bereichs von 6-8 ist, kann es mit pyrogenfreie-freie Natronlauge oder Salzsäure eingestellt werden. Wenn eine solche Anpassung durchgeführt wird, ist es wichtig zur Vermeidung von Kontaminationen der Probe von Mikroelektrode. Um dieses Verfahren ausführen zu können, ist daher eine kleine aliquoten der Probe entfernt in einem separaten Rohr und verwendet, um den pH-Wert zu messen.

Wenn die Probe in PBS oder einem anderen Puffer vorbereitet ist, ist die Leere Puffer auch in diesem Test enthalten. Fallspezifische ist die Konzentration der einzelnen Nanomaterial. Der Test wird verwendet, um die Kontamination von Endotoxin pro Milligramm Wirkstoff (API) abzuschätzen. Jedoch abhängig von der Art der Nano-Formulierung, die Konzentration kann auch geschätzt werden in mg die Gesamtformulierung oder das gesamte Element (zB., gold, Silber oder Eisen für Gold, Silber und Eisenoxid-Nanopartikeln, beziehungsweise). Die Probe wird aus dem Bestand mit verschiedenen Verdünnungen nicht überschreiten die MVD getestet. Alle Verdünnungen der Test-Nanopartikel werden mit LAL-Grade Wasser zubereitet.

Drei Parameter werden verwendet, um die MVD zu berechnen. Sie sind die Endotoxin-Grenze (EL), die Probenkonzentration und Assay Empfindlichkeit (λ)4. Verwenden Sie die folgende Formel, um Endotoxin-Grenze (EL) zu berechnen: EL = K/M, wo K eine Schwellendosis pyrogenfreie ist (zB., 5 EU/kg wie in der Einleitung erwähnt) und M ist die maximale Dosis von der Test-Nanomaterialien zur Verwaltung pro Kilogramm des Körpers Gewicht in einer einzigen Stunde4. Wie oben besprochen, die Schätzung der EL für Nanomaterialien als Radiopharmakon verwendet oder als Medizinprodukt stützt sich auf eine Schwellendosis pyrogene oder Formel, die unterscheidet sich von 5/M. Diese Angaben sind in der Einleitung erwähnt und könnte in der USP und US-Zulassungsbehörde FDA Richtlinien4,5,6weiter überprüft werden. Die empfohlene Endotoxin-Grenze für ophthalmologische Lösungen und intraokularen Geräte ist in der US-Zulassungsbehörde FDA-Richtlinie für diese Produkte6zur Verfügung gestellt. Wenn ein Tiermodell (zB., Maus) wurde verwendet, um die Dosis der Nanoformulation zu etablieren, diese Informationen werden verwendet, um die so genannten menschlichen Äquivalentdosis (HED) zu schätzen. Die HED errechnet sich durch Division der tierischen Dosis mit einem Umrechnungsfaktor die ist spezifisch für jede Tierart. Beispielsweise ist der Umrechnungsfaktor 12,3, 6.2 und 3.1 für die Maus, Ratte und Kaninchen, bzw.27. Der Konvertierungsvorgang und Begründung für die Verwendung werden im Detail in der US-Zulassungsbehörde FDA Guideline27beschrieben. Krebstherapie sind oft dosiert pro Oberfläche Körperbereich, ausgedrückt in mg/m2. Eine verfolgen die USP-Leitlinie zum Berechnen der EL für Drogen dosiert in Milligramm pro Quadratmeter oder konvertieren Sie diese Dosis in mg/kg-Bereich. Die Dosis in mg/m2 kann die Dosis in mg/kg über eine artspezifische Umrechnungsfaktor27angepasst werden. Für einen erwachsenen Menschen ist es als Km bezieht sich auf die Masse konstant27und 37. Der km-Faktor hat Einheiten von kg/m2; Es ist gleich das Körpergewicht in Kilogramm (kg) dividiert durch die Fläche in Quadratmetern (m2)27. Beispielsweise entspricht eine menschliche Dosis oder HED 74 mg/m2 , 2 mg/kg oder 74/37. Verwenden Sie die folgende Formel, die auch von der USP Wette 85-Standard zur Verfügung steht, um festzustellen, MVD: MVD = (EL x Probenkonzentration) / λ)4. In einem hypothetischen Szenario ein Nanopartikel Probenkonzentration ist 10 mg/mL und seine maximale Dosis in der Maus ist 615 mg/kg. In diesem Fall ist die HED 615/12.3 = 50 mg/kg; EL für alle Strecken außer intrathekale ist 0,1 EU/mg (5 EU/kg/50 mg/kg) und MVD ist 1.000 ((0,1 EU/mg X 10 mg/mL)/0.001 EU/mL).

Oft, wenn man braucht, Endotoxin-Kontamination in Forschung Grade Nanomaterial zu bewerten, ist die Dosis-Informationen nicht verfügbar. Es gibt kein harmonisiertes Verfahren zur Schätzung der MVD und EL für diese Materialien. Diese Fallstudie führt den Test direkt ab Lager (häufig die Konzentration dieser Lösung ist 1 mg/mL) und mehrere Verdünnungen, in der Regel 5, 50, 500 und 5.000-Falten. Wenn die Dosis, die Art der Verabreichung, die Probenkonzentration und die Infusion für die bestimmten Test Nanomaterial Änderung Zeit, ändern die EL und MVD auch. Man muss daher die Informationen einzuschätzen und Schätzung der EL und MVD im Zusammenhang mit anderen Parametern im Zusammenhang mit der Menge, Zeit, beabsichtigte Art der Verabreichung und die Konzentration der gegebenen Formulierung zu erfüllen.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Katalognummer und die Produktspezifikationen (zB., Potenz, beläuft sich pro Fläschchen) die CSE sind unterschiedlich für verschiedene LAL-Formate. Die CSE verwendet der Trübung, die auch in einem Gel-Clot LAL LAL verwendbar sind. Die CSE für eine chromogene LAL ist jedoch spezifisch für dieses Assay-Format. Die Anweisungen unten sind allgemein und für die CSE in allen Test-Formaten verwendet. Die CSE ist ein E. Coli Lipopolysaccharid (LPS) als lyophilisierte Pulver geliefert. Diese Norm ist durch den Hersteller gegen eine Referenz Standard Endotoxin (RSE) mit einer bekannten Potenz zertifiziert. Der Inhalt der Durchstechflasche mit CSE sollte mit ~3.2 - 5,0 mL pyrogenfreie-freie LAL Reagenz Wasser rekonstituiert werden. Neben den Unterschied zwischen CSE für verschiedene Assay Formate verwendet ist das Volumen der Rekonstitution auch spezifisch für jede Menge dieser Norm. Man muss daher die Endkonzentration von CSE-Stammlösung für jede Charge des Standards zu berechnen. Die Berechnung erfolgt basierend auf die Potenz des Standards und der Betrag in jedes Fläschchen enthalten. Die Bescheinigung über die Analyse, die spezifisch für jede Charge von Endotoxin standard enthält die Informationen über die Potenz und Menge pro Fläschchen. Man muss konsequent Wirbel den Standard für 30-60 Sekunden, während der Rekonstitution und während der Nutzung. Es wird auch empfohlen, führen Sie die Wiederherstellung mit 5-10 min Mal absetzen und über ein 30-60 min Zeitrahmen um sicherzustellen, dass alle Material lyophilisiert geht in Lösung. Vor der Verwendung in der Probe, equilibrate die Aktie CSE auf Raumtemperatur. Nach der Rekonstitution der CSE-Lager kann für die Lagerung gekühlt werden und ist für vier Wochen stabil.

Ähnlich wie der CSE ist das LAL-Reagenz auch spezifisch für jedes Format. Die Anweisungen unten sind allgemein und für alle Formate der LAL-Test. Das LAL-Reagenz ist als lyophilisierte Pulver zur Verfügung gestellt. Den Empfehlungen des Herstellers folgen um jedes Fläschchen wieder zusammenzusetzen. LAL Grade Wasser oder hemmende Beta-Glucane Puffer kann verwendet werden. Der Puffer hemmende Beta-Glucane wird in dieser Fallstudie bevorzugt, weil es erlaubt, die Einmischung von Beta-Glucane auszuschließen. Diese falsch-Positive Interferenz ist sehr häufig bei Nanomaterialien, weil Celluloseacetat Filter häufig während der Nanomaterialien Synthese verwendet werden und als Quelle von Glucan Kontamination15 dienen. Die meisten Flaschen benötigen Rekonstitution zu einem Endvolumen von 5 mL. Basierend auf über 10 Jahre Erfahrung der Autoren mit dieser Assay, es wurde bemerkt, dass die Aufnahme dieses Puffers die Reaktion verlangsamt und Erhöhung der maximalen Beginn-Zeit in den Geräteeinstellungen erlauben die niedrigsten Kalibrators am erfordern eine Konzentration von 0,001 EU/mL zu entwickeln.

Um genaue Verdünnung bei der Ausarbeitung von Standards zu gewährleisten, empfiehlt es sich, 10-divisibel Verdünnung Schritte verwenden. 10-divisibel Verdünnungsreihen können durch einen 100 µL der Aktie oder einen Standard mit höherer Konzentration in 900 µL pyrogenfreie-freies Wasser zubereitet werden. Da die Konzentration der CSE-Aktien in der Regel hoch (~ 1.000 EU/mL), Vorbereitung der zwischen-Verdünnungen mit Konzentrationen 100 und 10 EU/mL empfohlen wird, vor der Vorbereitung des Assay-Kalibrators mit einer Konzentration von 1 EU/mL. Zwei Verhältnisse zwischen der Probe und lysate werden in diesem Protokoll beschrieben. Obwohl beide Quoten häufig verwendet werden, ist die Kurve Linearität akzeptabel, aber nicht ideal, wenn das Verhältnis 4:1 und der Puffer hemmende Beta-Glucane (siehe die Tabelle der Materialien) verwendet werden.

Die gleichen Regeln gelten wie oben beschrieben bei der Kalibrierung standard Vorbereitung auch für die Vorbereitung der Qualitätskontrolle (QC). Diese Steuerelemente werden verwendet, um sicherzustellen, dass der Test ordnungsgemäß funktioniert. Es ist von Spick die bekannte Menge von CSE ins pyrogenfreie-freies Wasser vorbereitet. Die Konzentration von QC wird in der Regel in der Mitte der Assay-Bereichs gewählt. Die Reichweite von der Trübung LAL-Test beträgt 0,001 bis 1 EU/mL. Daher ist ein QC in einer Konzentration von 0,05 EU/mL verwendet. Andere Konzentrationen im Bereich Assay können auch bei der Vorbereitung der Qualitätskontrolle verwendet werden.

Die Hemmung Erweiterung Steuerung (IEC) ist auch bekannt als positiven Produktkontrolle (PPC). Es wird durch eine bekannte Konzentration von CSE in die zu untersuchende Probe Spick vorbereitet. Die Konzentration der IEC (PPC) wird in der Regel in der Mitte der Assay-Bereichs gewählt. Die Reichweite von der Trübung LAL-Test beträgt 0,001 bis 1 EU/mL. Daher ist die IEC in einer Konzentration von 0,05 EU/mL verwendet. Zur Vorbereitung dieser IEC muss man 50 µL der Lösung 1 EU/mL CSE mit 950 µL Test-Nanopartikel kombinieren. Die IEC ist jeder Verdünnung eines Test-Nanomaterials vorbereitet. Zum Beispiel wenn eine Nano-Formulierung bei drei Verdünnungen (01:50, 1: 500 und 1:5 000) getestet wird, muss man drei bereits, eine für jeden der diese Verdünnungen vorzubereiten. Andere Konzentrationen im Bereich Assay können auch verwendet werden, die IEC-Probe vorbereiten. Dieses Steuerelement wird verwendet, um die Gültigkeit der Testergebnisse für die gegebenen Nano-Formulierung zu verstehen. Nach USP sind die Testergebnisse gültig, wenn die Spitze Erholung der IEC (PPC) zwischen 50 und 200 %4. Spike Recovery von weniger als 50 % bedeutet, dass das Test-Nanomaterial Endotoxin-Erkennung und damit den Test hemmt Unterschätzungen Endotoxin Verschmutzung zur Folge und ist ungültig. Spike Recovery über 200 % legt nahe, dass das Testmaterial das Test-Ergebnis verbessert oder ein zu hohes Maß an kontaminierenden Endotoxin enthält. Im Falle der Erweiterung ist das Test-Ergebnis auch ungenau. Beispiele für solche Störungen und einige Möglichkeiten für die Überwindung von ihnen wurden beschrieben früheren12,15.

Wenn Sie Trübung und chromogenen Tests durchführen, empfiehlt es sich, eine Repeater-Pipette verwenden alle Proben das LAL-Reagenz hinzu. Die durchschnittliche Instrument Betriebszeit beträgt 7200 Sekunden. Die Reaktion kann jedoch schneller oder langsamer mit bestimmten viel der lysate. In Fällen wenn die Reaktion langsam ist, müssen eine Geräteeinstellungen zu ändern, zu 9600s oder länger. Diese Änderung ermöglicht die niedrigsten Kalibrators zu entwickeln.

Pegyliertem liposomalen Doxorubicin ist eine Formulierung, die eine aktive pharmazeutische Wirkstoffe (API) in einer Konzentration von 2 mg/mL enthalten. Es dient als eine Dosis von 50 mg/m2in der Klinik. Um diese Dosis in mg/kg-Bereich zu konvertieren, wird es durch Faktor 3727geteilt. Die Dosis von pegyliertem liposomalen Doxorubicin in mg/kg, ist also 1,35. Zum Berechnen der EL 5 (die pyrogenfreie Schwellendosis in EU/kg) gliedert sich von 1,35 (die Dosis von Doxil in mg/kg) und 3,7 EU/mg4erhalten. Diese Zahl bedeutet, dass pegylierte liposomale Doxorubicin bei der Dosis von 1,35 mg/kg pro Stunde sicher verabreicht werden kann, wenn Endotoxin in der Formulierung nicht mehr 3,7 EU/mg als, wo mg bezieht sich auf die API.

Als Nächstes verwenden Sie diese Informationen, um die MVD für LAL Assays zu berechnen. Die Empfindlichkeit (Lambda) von der Trübung, chromogenen und Gel-Clot-Assays, die in dieser Studie vorgestellt beträgt 0,001, 0,001 bzw. 0,03 EU/mL. MVD ist daher 7.407 für Trübung und chromogenen Assays ((5 EU/kg 2 mg/mL)/0.001 EU/mL) und 247 für die Gel-Clot-Assay ((5 EU/kg 2 mg/mL)/0.03 EU/mL).

Doxorubicin hat ein breites Absorptionsspektrum, das mit Assay Wellenlänge des chromogenen LAL28,29überschneidet. Darüber hinaus die meisten Liposomen Formulierungen sind trübe und milchig erscheinen. Diese inhärente Trübung ist die sehr häufige Ursache für die Einmischung der Liposomen mit Trübung Assay. Im Falle von pegyliertem liposomalen Doxorubicin wurde die Störungen durch die Trübung durch Verdünnung fünf ausweislich der Spike-Erholung-Werte zwischen 50 und 200 % (Tabelle 1) überwinden. Allerdings war an der gleichen Verdünnung Doxorubicin Konzentration immer noch hoch genug, um mit chromogenen LAL (Tabelle 1) stören. Zwei spätere Verdünnungen (50 und 500), pegyliertem liposomalen Doxorubicin Interferenzen mit chromogenen LAL zu überwinden half. Da die Gel-Clot-Assay unabhängig von Trübung und Sample-Farbe ist, und das Niveau von Endotoxin in der Formulierung im Bereich Gel-Clot ist, hat das pegylierte liposomale Doxorubicin nicht mit dem Gel-Clot-Assay auf allen getestete Verdünnungen beeinträchtigt. In dieser Fallstudie wurden mehrere Verdünnungen von pegyliertem liposomalen Doxorubicin für diese Assays verwendet. Die Verdünnungen 5, 50 und 500 für Trübung und chromogenen sowie 50, 100 und 200 für die Gel-Clot-Assay wurden ausgewählt, weil sie innerhalb der MVD sind. Die MVD den Gel-Clot-Assay ist niedriger als die der Trübung und chromogenen LALs, da die Empfindlichkeit des Assays auch niedriger ist. Wenn die Formulierung mit der LAL bei Verdünnung 500 in Trübung und chromogenen Assays gestört, konnte die Analyse bei höheren Verdünnungen (z. B. 5.000, 6.000, 7.000 oder 7.407) durchgeführt werden. Da die von Endotoxin erhalten bei Verdünnung 50 in der Gel-Clot-Assay unter EL war, war die Analyse dieser Formulierung bei niedrigeren Verdünnungen nicht durchgeführt. Jedoch in anderen Fällen die Prüfung konnte fortgesetzt werden Verdünnungen 20, 10, 5 oder 2 Ermittlung die niedrigsten nicht stören Verdünnung und erkennen, ob die Ebene von Endotoxin in der Formulierung unter der EL.

Es ist wichtig zu erwähnen, dass für die Gel-Clot-Assay es wichtig ist, deaktivieren Sie die Wasser-Zirkulation-Funktion im Wasserbad für die Dauer des Assays oder ein Wasserbad ohne diese Option zu verwenden, da Wasser-Strömung das Gerinnsel schädigt und die Genauigkeit des g beeinträchtigen El-Clot-LAL-Test. Es ist nicht immer möglich, Nanopartikel Interferenzen mit LAL Assays zu überwinden durch die Erhöhung der Probe Verdünnungen. Strategien und einige Ansätze zur Überwindung der verschiedenen Arten von Störungen und Beispiele von Nanopartikeln, die häufig ein Problem darstellt, für LAL-Assays wurden an anderer Stelle erläutert von anderen Gruppen und uns12,13,14 ,15,30,31. Die Analyse in diesem Manuskript basiert auf einem Modell Formulierung. Die Erfahrung mit anderen Nanoformulierungen kann unterschiedlich sein.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Studie wurde unterstützt durch Bundesmittel aus dem National Cancer Institute, National Institutes of Health, vertraglich HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health And Human Services, noch erwähnt von Handelsnamen, kommerzielle Produkte oder Organisationen die Billigung der US-Regierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

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References

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Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays
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Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

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