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Bioengineering

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

Rilevamento di endotossine in nanomateriali ingegnerizzati rappresenta una delle grandi sfide nel campo della nanomedicina. Qui, presentiamo un caso di studio che descrive il quadro composto da tre diversi formati LAL per stimare il potenziale contaminazione di endotossina in nanoparticelle.

Abstract

Quando sono presenti in prodotti farmaceutici, un'endotossina di componente la parete cellulare batterica gram-negativi (spesso anche chiamato lipopolisaccaride) può causare infiammazione, febbre, IPO - o ipertensione e, in casi estremi, può portare a danni del tessuto e dell'organo che può diventare fatale. Gli importi dell'endotossina in prodotti farmaceutici, pertanto, sono strettamente regolamentati. Tra i metodi disponibili per il rilevamento di endotossina e quantificazione, il dosaggio di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) è comunemente usato in tutto il mondo. Mentre qualsiasi prodotto farmaceutico può interferire con il dosaggio LAL, nano-formulazioni rappresentano una sfida particolare per la loro complessità. Lo scopo di questa carta è quello di fornire una guida pratica ai ricercatori inesperti nella stima endotossine nei nanomateriali ingegnerizzati e formulato in nanoparticelle di farmaci. Nel presente documento, consigli pratici per l'esecuzione di tre formati LAL tra cui torbidità, cromogenico e gel-clot saggi sono discussi. Queste analisi possono essere utilizzate per determinare la contaminazione da endotossine adiuvanti, vaccini e farmaci basati sulle nanotecnologie.

Introduction

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Un'endotossina è un blocco di costruzione della parete cellulare batterica gram-negativi1,2. Può attivare le cellule immunitarie a molto bassa (picogrammo) concentrazioni1,2. I mediatori proinfiammatori (eicosanoidi, leucotrieni, citochine, ecc.) prodotti dalle cellule in risposta a un'endotossina sono responsabili di febbre, ipotensione, ipertensione e problemi di salute più gravi tra cui guasto multiplo dell'organo 1 , 2 , 3. la gravità di immune-mediata effetti collaterali innescati l'endotossina dipende dalla sua potenza determinata dalla struttura e composizione dell'endotossina e misurato in unità internazionali dell'endotossina (IUs o EUs)3. Il numero di queste unità per chilogrammo di peso corporeo viene utilizzato per impostare una soglia dose pirogeno dell'endotossina. Questa dose è di che 5 EU/kg per i prodotti di farmaco somministrato per via tutte le rotte ma la via intratecale. Farmaci dosati per metro quadrato di superficie corporea, liquidi intraoculari, radiofarmaci e prodotti amministrato via intratecale hanno una dose di pirogeno soglia diversa, ovvero 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (dove V è la volume del prodotto destinato alla somministrazione) e 0,2 EU/kg, rispettivamente4. Più particolari circa la dose soglia pirogeno per vari prodotti farmaceutici e dispositivi sono forniti e discussi altrove4,5,6.

Animali variano ampiamente nella loro sensibilità alle reazioni dell'endotossina-mediata. Gli esseri umani, primati non umani e i conigli sono tra le specie più estremamente sensibili alle endotossine3. Per evitare l'endotossina-mediata effetti collaterali nei pazienti ed evitare conclusioni inesatte di tossicità preclinica e studi di efficacia, è essenziale rilevare e quantificare le endotossine in entrambe le formulazioni grado clinico e preclinico accuratamente. Diversi metodi attualmente disponibili possono realizzare questo compito. Uno di loro è il dosaggio di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), che è comunemente usato in tutto il mondo a schermo prodotti biomedicali per la potenziale contaminazione di endotossina pure per rilevare infezioni batteriche7,8,9. Il lisato viene preparato da amoebocytes, le cellule presenti nel sangue dei granchi a ferro di cavallo del Limulus polyphemus che risiedono nella sponda orientale del continente Nord America7. Interessante, ci sono alcune specie di granchi a ferro di cavallo (Tachypleus gigas e Tachypleus tridentatus) in Asia10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) è utilizzato in diversi paesi asiatici per la rilevazione dell'endotossina simile a come il Leone è usato in altri Pinti10. I lisati (LAL e TAL) contengono un gruppo di proteine che, al momento dell'attivazione, conferiscono l'attività della proteasi. Una di queste proteine, il cosiddetto fattore C viene attivata in caso di contatto con l'endotossina. C attivata fattore fende il fattore B, che a sua volta anche diventa una proteasi e si unirà un enzima pro-coagulazione per la produzione di un enzima coagulazione. Il risultato di questa catena di reazioni è la formazione di un gel, un aumento della torbidità del campione e, in presenza di un substrato cromogenico, l'aspetto di un prodotto colorato, che servono come base per gel-clot, torbidità e le analisi cromogeniche, rispettivamente. Mentre non esiste un formato obbligatorio di LAL, la US Food and Drug Administration (FDA) spiega la guida per a documento di industria, che in caso di discrepanza nei risultati del test tra diversi formati LAL, la decisione è presa basato sul dosaggio di gel-clot5 .

Molti prodotti chimici di laboratorio comunemente usati (ad es., EDTA) e farmaci noti prodotti (ad es., penicillina) interferire con LAL test11. L'interferenza viene di solito identificato valutando il recupero dell'endotossina standard a spillo a una concentrazione nota in una soluzione contenente il materiale di prova. Se il recupero dei picchi è inferiore al 50% o più del 200%, quindi il risultato del LAL test per il materiale di prova specificato non è valido a causa della inibizione o miglioramento, rispettivamente4. Formulazioni a base di nanotecnologia sono spesso complesse e interferiscano con la LAL attraverso una varietà di meccanismi12,13,14. Sono stati descritti molti approcci per superare l'interferenza: ricostituzione di campione in buffer specifici e tensioattivi, inattivazione della proteina da riscaldamento, distruzione di materiali cavi basata sui lipidi riscaldamento e integrando il campione con eccesso cationi bivalenti5,12,13,14,15. Inoltre sono stati descritti metodi alternativi per situazioni in cui l'interferenza di LAL non può essere superato: ELISA, una cella di reporter HEK-TLR4 linea dosaggio e spettrometria di massa16,17,18, 19.

Vengono descritte procedure sperimentali per lo svolgimento di gel-clot, torbidità e cromogenico LAL saggi. Queste analisi sono anche disponibili sul sito Web laboratorio di caratterizzazione di nanotecnologia (NCL)20 nei protocolli STE1.2 (torbidità LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) e STE1.4 (cromogenico LAL). Si consiglia di effettuare almeno due diversi formati per caratterizzare la stessa formulazione di nano. Quando risultati della torbidità e cromogenico LAL in disaccordo, i risultati di gel-coagulo sono considerati5. Quando in disaccordo risultati due formati di LAL, ulteriori studi utilizzando prova di attivazione di monociti (MAT) o test di coniglio pirogeni (RPT) per verificare LAL risultati sono condotti21. È importante notare che ogni metodo utilizzato per il rilevamento di endotossina e valutazione pirogenicità ha vantaggi e limitazioni21,22,23,24. Riconoscere i limiti della procedura utilizzata per caratterizzare una formulazione di nanotecnologia dato è essenziale per ottenere la giustificazione scientifica per l'uso della procedura ottima per quel nano-formulazione.

In questo studio, doxorubicina liposomiale pegilata è stato usato come una formulazione di nanoparticelle di modello. Questa formulazione è stata approvata dalla FDA nel 1995 e utilizzata per il trattamento di pazienti di cancro in tutto il mondo25.

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Protocol

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1. preparazione dei campioni di nanoparticelle

  1. Preparare il campione di studio in LAL acqua di grado.
  2. Se il pH del campione è fuori dell'intervallo di 6-8, regolare il pH utilizzando apirogena di idrossido di sodio o acido cloridrico.
  3. LAL l'utilizzo di acqua di qualità per preparare diverse diluizioni del campione di studio. Assicurarsi che la diluizione più alta non superi la massima diluizione valida (MVD). Fare riferimento alla sezione "discussione" per informazioni dettagliate sulla stima di MVD.

2. preparazione dei reagenti comuni tra formati di LAL

  1. Stock di idrossido di sodio concentrato diluito con acqua di reagente LAL apirogena per preparare una soluzione di lavoro ad una concentrazione di 0,1 N.
  2. Diluire l'acido cloridrico concentrato stock utilizzando acqua di reagente LAL apirogena e preparare una soluzione di lavoro ad una concentrazione finale di 0,1 N.
  3. Preparazione dell'endotossina Standard di controllo (CSE)
    1. Ricostituire il CSE in base al certificato di analisi fornito dal produttore.
      Nota: Fare riferimento alla sezione discussione per note importanti per quanto riguarda le informazioni contenute nel certificato. Fare riferimento alla Tabella materiali per i dettagli per quanto riguarda il numero di catalogo e l'applicazione di una determinata formulazione CSE in diversi formati LAL.
  4. Preparazione del reagente LAL
    1. Ricostituire il reagente LAL secondo il certificato di analisi fornito dal produttore.
      Nota: Fare riferimento alla sezione "discussione" per dettagli importanti per quanto riguarda la preparazione del reagente LAL. Fare riferimento alla Tabella materiali per i dettagli per quanto riguarda il numero di catalogo e l'applicazione di una formulazione di reagente LAL data in formato diverso di LAL.

3. torbidità LAL test

  1. Preparazione di standard di calibrazione
    1. Con 900 µ l di acqua di grado LAL e 100 µ l di CSE, preparare diluizioni intermedie come molti come necessario per consentire la preparazione di una calibrazione standard con una gamma di concentrazione da 0.001 a 1 EU/mL.
    2. In primo luogo Etichettare provette e aggiungere 900 μL di acqua LAL-grado in ciascuna provetta. Quindi aggiungere 100 μL di 10 EU/mL solutionn a preparare standard di calibrazione con concentrazione di 1EU/mL.
    3. Ripetere la diluizione seriale 10 volte come descritto in precedenza per preparare tre standard di calibrazione più basso. Verificare che gli standard di calibrazione quattro che vanno da 0.001 a 1 EU/mL sono stati preparati.
  2. Preparazione dei controlli qualità
    1. Preparare un controllo di qualità di EU/mL 0,05 unendo 50 µ l della 1 soluzione EU/mL CSE con 950 µ l di acqua di LAL-grado.
      Nota: Fare riferimento alla sezione "discussione" per i dettagli per quanto riguarda la preparazione dei controlli.
  3. Preparazione dei controlli di inibizione/Enhancement (IEC)
    1. Preparare IEC con concentrazione di 0,05 EU/mL unendo 25 µ l della 1 soluzione EU/mL CSE e 475 µ l del nanomateriale prova un determinato fattore di diluizione.
      Nota: Fare riferimento alla sezione di discussione per ulteriori dettagli.
  4. Procedura sperimentale
    1. Consentire allo strumento scaldare ruotando su circa 30 min di anticipo. Set-up della lunghezza d'onda di rilevamento a 660 nm come questo è appropriato per la torbidità LAL.
    2. Accedi digitando il nome utente e la password.
    3. Aprire il software (Tabella materiali) cliccando sull'icona corrispondente sullo schermo del computer.
    4. Selezionare raccogliere dati sulla schermata iniziale del software. Immettere le informazioni di gruppo ID e dati di prova nello spazio corrispondente nella scheda generale sulla schermata iniziale.
    5. Scegliere la scheda Hardware scegliere il tipo di strumento da un menu a discesa.
    6. Set-up della lunghezza d'onda di rilevamento a 660 nm come questo è appropriato per la torbidità LAL scegliendo il metodo di torbidità LAL.
    7. Verificare che un numero di serie, ID sistema e informazioni di porta seriale vengono visualizzati sullo schermo. Fare clic su OK. Fare clic su OK ancora una volta per confermare.
    8. Immettere l'ID campione nello stesso ordine che dell'esempio viene testato. Utilizzare i pulsanti predefiniti per inserire il controllo negativo, campioni di test e di curva standard.
    9. Preparare le provette duplicati per ogni campione e aggiungere 200 µ l (prova rapporto 4:1) o 100 µ l (1:1 di rapporto di prova) di controllo negativo (acqua), gli standard di calibrazione, controllo qualità, IEC e test di nanoparticelle in tubi di vetro pre-etichettata.
    10. Aggiungere 50 µ l (prova rapporto 4:1) o 100 µ l (1:1 di rapporto di prova) di reagente LAL prima fiala per test, vortice e brevemente e inserto in test slot nel carosello dello strumento. Se viene utilizzato il rapporto 1:1, il volume del reagente LAL è 100 µ l.
    11. Ripetere la procedura sopra descritta per altri campioni. Processo di campioni uno alla volta.
      Nota: Fare riferimento alla sezione di discussione per maggiori dettagli.

4. cromogenico LAL

  1. Preparazione di standard di calibrazione
    1. Con 900 µ l di acqua di grado LAL e 100 µ l di CSE, preparare diluizioni intermedie come molti come necessario per consentire la preparazione di un standard di calibrazione con una concentrazione di 1 EU/mL.
    2. Utilizzando acqua di LAL-grado 900 µ l e 100 µ l 1 EU/mL standard di calibrazione, preparare un secondo standard di calibrazione ad una concentrazione di 0,1 EU/mL.
    3. Ripetere la diluizione seriale 10 volte come descritto in precedenza per preparare due inferiore standard di calibrazione. Verificare che gli standard di calibrazione quattro che vanno da 0.001 a 1 EU/mL sono stati preparati.
  2. Preparazione dei controlli di qualità.
    1. Preparare un controllo di qualità di EU/mL 0,05 unendo 50 µ l della 1 soluzione EU/mL CSE con 950 µ l di acqua di LAL-grado.
      Nota: Fare riferimento alla sezione "discussione" per i dettagli per quanto riguarda la preparazione dei controlli.
  3. Preparazione dei controlli di inibizione/Enhancement (IEC)
    1. Preparare 0,05 EU/mL unendo 25 μL della soluzione di CSE EU/mL 1 con 475 μL di nanomateriale prova.
      Nota: Fare riferimento alla sezione di discussione per ulteriori dettagli.
  4. Procedura sperimentale
    1. Consentire allo strumento scaldare ruotando su circa 30 min di anticipo. Set-up della lunghezza d'onda di rilevamento a 405 nm come questo è appropriato per la torbidità LAL.
    2. Aprire il software cliccando sull'icona corrispondente sullo schermo del computer. Accedi digitando il nome utente e la password.
    3. Selezionare raccogliere dati sulla schermata iniziale del software. Immettere informazioni sul gruppo di test ID e i dati nello spazio corrispondente nella scheda generale sulla schermata iniziale.
    4. Scegliere la scheda Hardware scegliere il tipo di strumento da un menu a discesa. Scegli lo strumento.
    5. Verificare che un numero di serie, ID sistema e informazioni di porta seriale vengono visualizzati sullo schermo. Fare clic su OK. Fare clic su OK ancora una volta per confermare.
    6. Immettere l'ID campione nello stesso ordine che dell'esempio viene testato. Utilizzare i pulsanti predefiniti per immettere il controllo negativo, campioni di test e di curva standard.
    7. Preparare le provette duplicati per ogni campione e aggiungere 200 µ l (prova rapporto 4:1) o 100 µ l (1:1 di rapporto di prova) di controllo negativo (acqua), gli standard di calibrazione, controllo qualità, IEC e test di nanoparticelle in tubi di vetro pre-etichettata.
    8. Aggiungere 50 µ l (prova rapporto 4:1) o 100 µ l (1:1 di rapporto di prova) di reagente LAL prima fiala per test, vortice e brevemente e inserto in test slot nel carosello dello strumento. Se viene utilizzato il rapporto 1:1, il volume del reagente LAL è 100 µ l.
    9. Ripetere la procedura sopra descritta per altri campioni. Processo di campioni uno alla volta.

5. gel-Clot LAL

Nota: Questo test identifica la presenza di endotossine nel campione basato sull'osservazione visiva e la rilevazione di un coagulo nel tubo di reazione. La procedura sperimentale è descritti di seguito. Utilizzare un foglio di panca per registrare i risultati. Questo foglio di panca non è obbligatorio, e altri modi di registrare i risultati del saggio sono anche accettabili. Un esempio di un foglio di panchina è fornito in materiali supplementari per la comodità di un lettore. Lambda (l) è la sensibilità del dosaggio gel-clot e 0,03 EU/mL.

  1. Etichettare le provette di reazione come molti come necessario per contenere il numero di campioni analizzati. Consultare la scheda di banco per informazioni dettagliate sul numero di repliche utilizzato nel passaggio 1, fase 2 e fase 3 del dosaggio.
  2. Aliquotare 100 μL di campione di acqua, controlli o test per tubo.
  3. Tale che la concentrazione finale è uguale a 4 λ, preparare CSE.
  4. Combinare 100 μL dello standard di cui sopra con 100 μL di campione di acqua o test per ottenere la concentrazione finale di CSE di 2λ. Ripetere tre volte per raggiungere lambda e metà-lambda e un quarto lambda.
  5. Assicurarsi che la temperatura del bagnomaria è 37 ° C.
  6. Aggiungere 100 μL di lisato per provetta, vortex brevemente e dispongono la cremagliera con tutti i tubi nel bagno di acqua per 1 h.
  7. Capovolgere la provetta con un movimento regolare.
  8. Manualmente per registrare risultati utilizzando "+" (ditta coagulo) o "-" (Nessun coagulo o coagulo sciolto) sul foglio panchina.
  9. Procedere con l'analisi secondo l' USP puntata 854; utilizzare il foglio di panchina come materiale di supporto

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Representative Results

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L'esempio di dati generati dopo aver testato questa formulazione in LAL test è mostrato in tabella 1. Doxorubicina liposomiale pegilata interferito con LAL cromogenico alla diluizione 5. Tuttavia, questa interferenza è stata superata per diluizioni superiori. Recupero dei picchi è stato compreso tra 50 e 200% quando questa formulazione è stata provata a diluizioni 50 e 500 nella torbidità e cromogenico LAL, così come alla diluizione 5 torbidità LAL. Quando regolato per il fattore di diluizione, i risultati sono stati coerenti tra le diluizioni in entrambe le analisi. Inoltre, i risultati erano coerenti tra i formati di tre analisi.

Esempio di test Torbidità LAL, EU/mg (spike recupero, %) Cromogenico LAL, EU/mg, (spike recupero, %) Gel-clot LAL, EU/mg (prova valida, sì o No)
Doxorubicina liposomiale pegilata (Vedi la tabella materiali)
Diluizione 5 0,01 (141) interferenze < 0.75 (Y)
Diluizione 50 < 0,025 (187) 0,029 (82) < 1.5 (Y) *
Diluizione 500 < 0,25 (182) < 0,25 (86) < 3 (Y) * *

Tabella 1: rilevamento dell'endotossina in pegilato doxorubicin liposomico utilizzando LAL test. Pegilato doxorubicin liposomico è stato testato utilizzando torbidità, cromogenico e gel-clot LAL test. Interferenza di campione è stata stimata utilizzando IECs. Recupero dei picchi è indicato tra parentesi. Valori compresi tra 50 e 200% sono considerati accettabili secondo la USP puntata 85 standard per endotossina rilevazione4. * e * * i risultati dei test di questo esempio sono stati ottenuti a diluizioni 100 e 200, rispettivamente. Le diluizioni del saggio di gel-coagulo sono diverse da quelli utilizzati in cromogenico e torbidità LAL perché sensibilità e massima diluizione valida di questo test sono più bassi.

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Discussion

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Le informazioni fornite in questo protocollo sono stato descritto prima15,26 e si basa su diversi documenti normativi pubblicati da la US Food and Drug Administration (FDA o FDA) e farmacopea statunitense (USP)4 , 5 , 6 , 27ed è anche disponibile sul sito Web NCL20 nei protocolli STE1.2 (torbidità LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) e STE1.4 (cromogenico LAL).

Prova-nanomateriali sono preparati in acqua reagente LAL o PBS sterile, apirogena. Il pH del campione di studio è importante perché bassa (< 6) e alta (> 8) pH interferisce con le prestazioni ottimali del lisato. Se il pH della prova-nanoparticella è fuori dell'intervallo di 6-8, può essere regolata utilizzando apirogena di idrossido di sodio o acido cloridrico. Quando viene eseguita tale adeguamento, è fondamentale per evitare la contaminazione del campione da microelettrodo. Pertanto, per eseguire questa procedura, una piccola aliquota del campione è rimossa in un tubo separato e utilizzata per misurare il pH.

Quando il campione è preparato in PBS o un altro buffer, il buffer vuoto è inclusa anche in questo test. La concentrazione di ogni nanomateriale è specifico. Il test è utilizzato per stimare la quantità di contaminanti dell'endotossina per milligrammo dell'ingrediente farmaceutico attivo (API). Tuttavia, a seconda del tipo di nano-formulazione, la concentrazione può essere stimata anche in mg della formulazione totale o totale elemento (ad es., oro, argento o di ferro per oro, argento e nanoparticelle di ossido di ferro, rispettivamente). Il campione viene testato dal magazzino utilizzando diverse diluizioni non supera il MVD. Tutte le diluizioni di prova-nanoparticelle sono preparate usando acqua LAL-grado.

Tre parametri sono usati per calcolare la MVD. Essi sono il limite di endotossina (EL), la concentrazione del campione e l'analisi di sensibilità (λ)4. Utilizzare la seguente formula per calcolare il limite di endotossina (EL): EL = K/M, dove K è una dose di pirogeni soglia (ad es., 5 EU/kg come discusso nell'introduzione) e M è la dose massima del nanomateriale di prova destinato ad essere somministrati per chilogrammo di corpo peso in una sola ora4. Come discusso in precedenza, la stima della EL per i nanomateriali utilizzati come radiofarmaco o come dispositivo medico si basa su una dose di pirogeno soglia o formula, che è diverso da 5/M. Questi dettagli sono citati nell'introduzione e potrebbero essere ulteriormente rivista in USP e US FDA linee guida4,5,6. Il limite consigliato endotossina per soluzioni oftalmiche e dispositivi intraoculare è fornito nelle linee guida del FDA per questi prodotti6. Quando un modello animale (ad es., mouse) è stato utilizzato per stabilire la dose di nanoformulation, queste informazioni vengono utilizzate per stimare la dose equivalente umana cosiddetta (HED). La HED è calcolato dividendo la dose animale per un fattore di conversione, che è specifico per ogni specie animale. Ad esempio, il fattore di conversione è 12,3, 6.2 e 3.1 per il mouse, ratto e coniglio, rispettivamente27. La procedura di conversione e la spiegazione razionale per il suo utilizzo sono descritti in dettaglio nell' orientamento US FDA27. Terapeutica del cancro sono spesso dosato per area di superficie corporea espressa in mg/m2. Uno può seguire la Guida di riferimento USP per calcolare EL per farmaci dosati in milligrammi per metro quadrato o convertire questa dose in mg/kg intervallo. La dose in mg/m2 può essere regolata per la dose in mg/kg se si utilizza un fattore di conversione specie-27. Per un uomo adulto, è indicato come Km per riferirsi alla massa costante27e 37. Il fattore km ha unità di kg/m2; è uguale per il peso corporeo in chilogrammi (kg) divisi per l'area della superficie in metri quadrati (m2)27. Ad esempio, una dose umana o HED di 74 mg/m2 corrisponde a 2 mg/kg o 74/37. Per determinare la MVD, utilizzare la seguente formula, che è anche disponibile dallo standard USP puntata 85: MVD = (EL x concentrazione del campione) / λ)4. In un ipotetico scenario, una concentrazione di campione delle nanoparticelle è 10 mg/mL e la dose massima nel topo è 615 mg/kg. In questo caso la HED è 615/12,3 = 50 mg/kg; EL per tutte le rotte eccetto intrathecal è 0,1 EU/mg (5 EU/kg/50 mg/kg) e MVD è 1.000 ((0,1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 EU/mL).

Spesso, quando uno ha bisogno valutare la contaminazione di endotossina in un nanomateriale grado di ricerca, le informazioni di dose non sono disponibile. Non esiste una procedura armonizzata per come stimare il MVD ed EL per questi materiali. Questo studio finalizzato esegue il test direttamente dal magazzino (comunemente la concentrazione di questa soluzione è 1 mg/mL) e alle diverse diluizioni, solitamente 5, 50, 500 - e 5.000-pieghe. Quando la dose, via di somministrazione, la concentrazione del campione e l'infusione il tempo per il cambiamento di nanomateriale determinato test, l'EL e MVD anche cambiare. Pertanto, si deve valutare le informazioni ed eseguire la stima della EL e MVD nel contesto di altri parametri relativi alla quantità, tempo, previsto via di somministrazione e concentrazione della formulazione determinata.

È importante notare che il numero di catalogo e le specifiche di prodotto (ad es., potenza, ammonta per flaconcino) del CSE sono diversi per i diversi formati di LAL. Motore di ricerca personalizzato utilizzato in torbidità che Lal può essere utilizzato anche in un gel-clot LAL. Tuttavia, il motore di ricerca personalizzato per un LAL cromogenico è specifico per questo formato di dosaggio. Le istruzioni riportate di seguito sono generali e applicabile al CSE utilizzato in tutti i formati di dosaggio. Il CSE è un lipopolysaccharide di Escherichia coli (LPS) fornito come una polvere liofilizzata. Questo standard è certificato dal produttore contro un'endotossina Standard di riferimento (RSE) con una potenza di nota. Il contenuto del flaconcino contenente CSE deve essere ricostituito con ~3.2 - 5,0 mL di acqua di reagente LAL apirogeno. Oltre alla differenza tra CSE utilizzata per analisi differenti formati, il volume di ricostituzione anche è specifico per ogni lotto di questo standard. Pertanto, si deve calcolare la concentrazione finale della soluzione madre CSE per ogni lotto dello standard. Il calcolo viene eseguito basata sulla potenza della norma e la quantità contenuta in ogni flaconcino. Il certificato di analisi specifico per ogni lotto di endotossina standard contiene le informazioni circa la potenza e la quantità per flaconcino. Uno deve rigorosamente vortice lo standard per 30-60 secondi, sia durante la ricostituzione e durante l'uso. Si consiglia inoltre di eseguire la ricostituzione con 5-10 min sedimentazione volte e sopra un 30-60 min lasso di tempo per garantire che tutti liofilizzato materiale va in soluzione. Prima di utilizzare nell'analisi, equilibrare il brodo CSE a temperatura ambiente. Dopo la ricostituzione, il CSE può essere refrigerato per la conservazione ed è stabile per quattro settimane.

Simile al CSE, il reagente LAL è specifico per ogni formato. Le istruzioni riportate di seguito sono generali e applicabile a tutti i formati di dosaggio LAL. Il reagente LAL è fornito come polvere liofilizzata. Per ricostituire ogni flaconcino siano seguite le raccomandazioni del produttore. LAL grado acqua o inibendo beta-glucani di buffer può essere utilizzato. Il buffer d'inibizione beta-glucani è preferito in questo caso-studio, perché permette di escludere l'interferenza dal beta-glucani. Questa interferenza di falsi positivi è molto comune nei nanomateriali perché filtri di acetato di cellulosa sono comunemente usati durante la sintesi di nanomateriale e servono come una fonte di contaminazione di glucano15. La maggior parte delle fiale richiederà la ricostituzione ad un volume finale di 5 mL. Basato su oltre 10 anni di esperienza degli autori con questo test, è stato notato che l'inclusione di questo buffer rallenta la reazione e può richiedere aumentando il tempo di insorgenza massima nelle impostazioni dello strumento per consentire il calibratore più basso presso un concentrazione di 0,001 EU/mL a sviluppare.

Per assicurare l'accurata diluizione durante l'elaborazione di norme, si consiglia di utilizzare 10 volte passaggi di diluizione. 10 volte diluizioni possono essere preparati da chiodando 100 µ l di brodo o standard con maggiore concentrazione nei 900 µ l di acqua apirogena. Poiché la concentrazione dello stock CSE è solitamente alta (~ 1.000 EU/mL), preparazione delle diluizioni intermedie con concentrazioni 100 e 10 EU/mL è consigliato prima di preparare il calibratore di dosaggio con una concentrazione di 1 EU/mL. Due rapporti tra campione e lisato sono descritti nel presente protocollo. Anche se entrambi i rapporti sono comunemente usati, la linearità della curva è accettabile, ma non è l'ideale quando il rapporto 4:1 e il buffer di inibizione beta-glucani (Vedi la Tabella materiali) vengono utilizzati.

Le stesse regole come descritto in precedenza per quanto riguarda la preparazione di standard di calibrazione si applicano anche alla preparazione di controlli di qualità (QC). Questi controlli vengono utilizzati per verificare che il test funzioni correttamente. È preparato da chiodare la quantità nota di CSE in acqua apirogena. La concentrazione di QC è di solito scelto al centro dell'intervallo di dosaggio. Il range di dosaggio LAL la torbidità è 0,001 a 1 EU/mL. Di conseguenza, viene utilizzato un QC ad una concentrazione di 0,05 EU/mL. Altre concentrazioni all'interno dell'intervallo di dosaggio è utilizzabile anche nella preparazione del controllo qualità.

Il controllo di valorizzazione di inibizione (IEC) è anche noto come controllo positivo prodotto (PPC). È preparato aggiungendo una concentrazione nota di CSE nel campione in esame. La concentrazione di IEC (PPC) è di solito scelto al centro dell'intervallo di dosaggio. Il range di dosaggio LAL la torbidità è 0,001 a 1 EU/mL. Di conseguenza, viene utilizzato l'IEC ad una concentrazione di 0,05 EU/mL. Per preparare questa IEC bisogna combinare 50 µ l della 1 soluzione EU/mL CSE con 950 µ l di prova-nanoparticelle. La IEC è preparato per ogni diluizione di un test-nanomateriale. Ad esempio, se una nano-formulazione è testata a tre diluizioni (01:50, 1: 500 e 1:5, 000), bisogna preparare tre IECs, uno per ciascuna di queste diluizioni. Altre concentrazioni all'interno dell'intervallo di dosaggio è utilizzabile anche per preparare il campione IEC. Questo controllo viene utilizzato per comprendere la validità dei risultati del test per la nano-formulazione determinato. Secondo l'USP, i risultati del test sono validi se il recupero dei picchi di IEC (PPC) è compreso tra 50 e 200%4. Spike recupero inferiore al 50% significa che il test-nanomateriale inibisce endotossina rilevamento e, di conseguenza, il test provocare contaminazione endotossina sottovaluta e non è valido. Recupero dei picchi oltre il 200% suggerisce che il materiale di prova migliora il risultato di analisi o contiene un livello troppo alto dell'endotossina contaminante. Nel caso di potenziamento, il risultato del test è anche impreciso. Esempi di tali interferenze e alcuni modi per superarli sono state descritte precedenti12,15.

Quando si eseguono dosaggi cromogenici e torbidità, è consigliabile utilizzare una pipetta a ripetizione per aggiungere il reagente LAL a tutti i campioni. Il tempo di funzionamento medio strumento è 7200 secondi. Tuttavia, la reazione può essere più veloce o più lento con alcuni lotti del lisato. Nei casi, quando la reazione è lenta, uno necessario modificare le impostazioni dello strumento a 9600s o più. Questo cambiamento permetterà il calibratore più basso di sviluppare.

Doxorubicina liposomiale pegilata è una formulazione che contiene il principio attivo farmaceutico (API) ad una concentrazione di 2 mg/mL. Esso viene utilizzato in clinica come una dose di 50 mg/m2. Per convertire questa dose gamma mg/kg, è diviso da fattore 3727. La dose di doxorubicina liposomiale pegilata in mg/kg, di conseguenza, è 1,35. Per calcolare EL, 5 (la dose soglia pirogeni in UE/kg) è divisa da 1,35 (la dose di Doxil in mg/kg) e ottenere 3,7 EU/mg4. Questo numero significa che doxorubicina liposomiale pegilata alla dose di 1,35 mg/kg può essere somministrato in sicurezza ogni singola ora se endotossina nella formulazione non superi i 3,7 EU/mg, dove mg fa riferimento all'API.

Successivamente, è possibile utilizzare queste informazioni per calcolare la MVD per LAL test. La sensibilità (lambda) della torbidità, cromogenico e saggi di gel-clot presentati in questo studio è 0,001, 0,001 e 0,03 EU/mL, rispettivamente. Pertanto, MVD è 7.407 per torbidità e dosaggi di cromogenici ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 EU/mL) e 247 per il dosaggio di gel-clot ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 EU/mL).

Doxorubicina ha uno spettro di assorbanza ampio che si sovrappone con lunghezza d'onda di dosaggio della LAL cromogenico28,29. Inoltre, la maggior parte delle formulazioni di liposomi sono torbide e appaiono latte. Questo torbidità inerente è il motivo molto comune per l'interferenza di liposomi con dosaggio di torbidità. Nel caso di doxorubicina liposomiale pegilata, l'interferenza a causa della torbidità è stato superato da diluizione cinque come testimoniano i valori di recupero a spillo tra 50 e 200% (tabella 1). Tuttavia, presso la stessa doxorubicina di diluizione concentrazione era ancora abbastanza alto per interferire con la LAL cromogenico (tabella 1). Due diluizioni successive (50 e 500) ha aiutato a superare le interferenze doxorubicina liposomiale pegilata con LAL cromogenico. Poiché il dosaggio di gel-clot è indipendente di torbidità e colore campione, e il livello dell'endotossina nella formulazione è all'interno della gamma di gel-clot, la doxorubicina liposomiale pegilata non ha interferito con il dosaggio di gel-clot diluizioni a tutti testati. In questo caso, diverse diluizioni di doxorubicina liposomiale pegilata sono state utilizzate per queste analisi. Le diluizioni 5, 50 e 500 per torbidità e cromogenico così come 50, 100 e 200 per il dosaggio di gel-coagulo sono stati scelti perché sono all'interno di MVD. Il MVD del dosaggio gel-clot è inferiore a quello della torbidità e cromogenico LALs perché la sensibilità di questo test è anche inferiore. Se la formulazione interferito con la LAL a diluizione 500 in dosaggi cromogenici e torbidità, potrebbe essere eseguita l'analisi alle diluizioni superiori (ad es., 5.000, 6.000, 7.000 o 7.407). Dal momento che il livello dell'endotossina ottenuto a diluizione 50 nel gel-coagulo era sotto il EL, l'analisi di questa formulazione a diluizioni inferiori non è stata eseguita. Tuttavia, in altri casi, il test potrebbe essere continuato a diluizioni 20, 10, 5 o 2 per identificare il più basso non interferendo diluizione e capire se il livello dell'endotossina nella formulazione è sotto la EL.

È importante ricordare che per il dosaggio di gel-clot è essenziale per disattivare la funzione di circolazione dell'acqua nel bagno d'acqua per tutta la durata di questo test o utilizzare una vasca di acqua senza tale opzione perché il flusso d'acqua danneggia il coagulo e può influenzare l'accuratezza della g dosaggio LAL El-coagulo. Non è sempre possibile superare le interferenze delle nanoparticelle con dosaggi LAL aumentando le diluizioni del campione. Strategie e alcuni approcci per superare vari tipi di interferenza ed esempi di nanoparticelle comunemente che rappresenta un problema per LAL saggi sono stati discussi da altri gruppi e noi altrove12,13,14 ,15,30,31. L'analisi presentata in questo manoscritto è basato su una formulazione del modello. L'esperienza con altri nanoformulazioni potrebbe essere diverso.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Lo studio è stato sostenuto da fondi federali dal National Cancer Institute, National Institutes of Health, sotto contratto HHSN261200800001E. Il contenuto di questa pubblicazione non riflettono necessariamente le opinioni o le politiche del dipartimento di salute e servizi umani, né fa menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali, o organizzazioni implicano l'approvazione dal governo statunitense.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

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References

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Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)
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Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

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