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Bioengineering

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

ナノのエンドトキシンの検出は、ナノメディシン分野の難問の 1 つを表します。ナノ粒子の潜在的なエンドトキシン汚染を推定する 3 種類のラール フォーマットで構成されるフレームワークを説明する事例を紹介します。

Abstract

グラム陰性細菌の細胞壁コンポーネント内毒素 (リポ多糖とも呼ばれます) は、炎症、発熱、低刺激や高血圧を引き起こすことができ、極端な場合、可能性があります組織・臓器の損傷につながることができます医薬品に存在、する場合致命的になります。したがって、医薬品中のエンドトキシン量は規制厳しく。エンドトキシンの検出と定量に使用できる方法の中でカブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金、世界中に使用されます。一方、医薬品は、ラール アッセイに干渉できる、ナノ処方はその複雑さのための特定の挑戦を表しています。本稿の目的は、ナノ、ナノ粒子配合薬で大原の推定に経験の浅い研究者に実用的なガイドを提供することです。ここで、濁度、発色性を含む 3 つのラール形式やゲル血栓アッセイを行うため実用的な推奨事項を説明します。これらのアッセイは、ナノテクノロジーに基づく医薬品、ワクチン、アジュバントのエンドトキシン汚染を決定する使用できます。

Introduction

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エンドトキシンは、グラム陰性細菌の細胞壁1,2の建物ブロックです。それは非常に免疫細胞をアクティブにすることができます (picogram) 濃度1,2を低します。発熱、低血圧、高血圧、多臓器不全を含むより深刻な健康上の問題のため、エンドトキシンに応答細胞によって生成される炎症性メディエーター (サイトカイン、ロイコトリエン、エイコサノイド等)は、します。1,2,3.、免疫介在性の副作用のエンドトキシンによって引き起こされる重大度エンドトキシンの組成と構造によって決定され、国際エンドトキシン単位 (IUs または EUs)3単位、その効力に依存します。体重の 1 キログラムあたりこれらの単位数を使用して、しきい値発熱性エンドトキシン投与量を設定します。この線量は、医薬品 5 EU/kg 投与による髄腔内のルートがすべてのルートです。髄腔内投与によるルートの製品、放射性医薬品、眼内液ボディ表面の平方メートル当たり投与薬がある 100 EU/m2、0.2 EU/mL、175 EU/V は、異なるしきい値の発熱量 (V は、管理するためのもの製品の容積)、および 0.2 EU/kg、それぞれ4。さまざまな医薬品やデバイス、発熱性しきい値線量の詳細については提供され、他の場所で説明した4,5,6

動物は、エンドトキシン反応への感度が大きく異なります。人間、非ひと霊長類、ウサギ、大原3に最も敏感の種。患者におけるエンドトキシンを介した副作用を回避し、非臨床毒性評価と有効性の研究の不正確な結論を防ぐため、正確に検出し、両方の臨床および前臨床グレードの製剤でエンドトキシンを定量化することが不可欠です。現在利用可能ないくつかのメソッドは、このタスクを実現できます。それらの 1 つは、カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金、広く世界中潜在的なエンドトキシン汚染だけでなく細菌感染症7,8,9を検出するため画面バイオメディカル製品に使われています。ライセートは amoebocytes から作製した、カブトガニカブトガニ ポリュフェモスの血液に存在するセル7北アメリカ大陸の東海岸に存在します。興味深いことに、いくつかの異なる種のカブトガニがある (日本のマガキカブトガニ)アジア10で。日本リムラス ライセート (TAL) は、アジア数カ国でその他に関する史的10で、ラルを使用する方法と同様のエンドトキシンの検出に使用されます。(タル ・ ラル) 溶解液には、活性化プロテアーゼ活性を付与する蛋白質のグループが含まれています。これらの蛋白質、いわゆる係数 C の 1 つは、エンドトキシンとの接触時にアクティブになります。活性化因子 C 切断係数 B は、順番にも、プロテアーゼとなり凝固酵素を生産するプロ凝固酵素を裂きます。この反応の連鎖の結果はサンプル濁度と、発色基質ゲル血栓、濁度、および発色アッセイのための基盤として、色の製品の外観の存在下で増加、ゲルの形成それぞれ。米国食品医薬品局 (FDA) のガイダンスで説明必須のラール形式はありません、ゲル血栓分析5 に基づいて業界ドキュメント、ラルの異なるフォーマット間のテストの結果に相違がある場合決定が行われます.

一般的に使用される多くの研究所化学薬品 (e.g。、EDTA) 製品 (例えば、ペニシリン) がラールを妨げる知られていた薬剤の試金の11と。干渉は、通常試験材料を含む溶液に濃度既知のスパイク エンドトキシン標準のリカバリを評価することによって識別されます。スパイクの回復が 50% 未満、または 200% 以上、ラルの結果分析の場合特定のテスト材料が阻害や促進、それぞれ4のため正しくありません。ナノテクノロジーに基づく製剤は、しばしば複雑、メカニズム12,13,14のさまざまなラルを妨げます。干渉を克服するために多くの方法を記載されている: サンプル溶解特定のバッファーと界面活性剤で加熱し、加熱し、過剰なサンプルを補うことによって脂質中空材の破壊タンパク質不活性化二価陽イオン5,12,13,14,15。ラル干渉を克服することができない場合の代替方法も記載されている: ELISA、HEK TLR4 レポーター細胞ライン試金および質量16,17,18, 19

ここで、ゲル血栓、濁度、および発色のラール アッセイを実施の実験プロシージャを示します。これらの試金はプロトコル STE1.2 (濁度ラル)、STE1.3 (ゲル血栓ラル) ナノテクノロジー キャラクタリゼーション ラボ (NCL) ウェブサイト20利用頂けますと STE1.4 (発色ラル)。同じナノ処方を特徴付けるために少なくとも 2 つの異なる形式を実施することをお勧めします。濁度と発色のラルの結果に反対、ゲル血栓結果は5が考慮されます。ラルの 2 つの形式の結果が一致しない場合ラルを確認する単球活性化テスト (マット) またはウサギ発熱性物質試験 (RPT) を用いた研究の結果、その他は21を実施しました。エンドトキシン検出の各メソッドを使用し、pyrogenicity 評価、利点と制限21,22,23,24に注意することが重要です。指定されたナノテクノロジーの定式化を特徴付けるために使用プロシージャの制限を認識しそのナノ定式化に最適のプロシージャの使用のための科学的根拠を得るために不可欠です。

本研究では、ペグ化リポソーム封入ドキソルビシンはモデル ナノ粒子製剤として使用されました。この定式化を 1995 年に米国 FDA に承認されており、癌患者世界25の治療に使用します。

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Protocol

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1. ナノ粒子サンプルの準備

  1. ラルの研究サンプルのグレードの水を準備します。
  2. サンプルの pH は、6-8 の範囲外は、パイロジェン フリー水酸化ナトリウムや塩酸を用いて pH を調整します。
  3. ラルを使用してグレード水は研究サンプルのいくつかの希釈液を準備します。最高の希釈が最大有効希釈 (MVD) を超えていないことを確認します。MVD 推定の詳細についての議論を参照してください。

2. 試薬ラル フォーマット間共通の準備

  1. 0.1 n. の濃度で作業ソリューションを準備する LAL 試薬水のパイロジェン フリーを使用して希釈濃水酸化ナトリウム素材
  2. LAL 試薬水のパイロジェン フリーを使用して濃塩酸株式を希釈し、0.1 n. の最終的な集中で実用的なソリューションを準備
  3. コントロールの標準的なエンドトキシン (CSE) の準備
    1. メーカーによって供給された分析の証明書によると CSE を再構成します。
      注: は、証明書で提供される情報に関する重要な注意事項の説明を参照してください。材料表カタログ番号とラルの異なる形式で特定の CSE の定式化のアプリケーションの詳細についてを参照してください。
  4. LAL 試薬の調製
    1. 製造元によって提供される分析の証明書によると LAL 試薬を再構成します。
      注: は LAL 試薬調製に関する重要な詳細についての議論を参照してください。材料表カタログ番号とラルの別の形式で与えられた LAL 試薬製剤の応用の詳細についてを参照してください。

3. 濁度ラル アッセイ

  1. 標準試料の作製
    1. ラル グレード水量 900 μ L と CSE の 100 μ L を使用すると、0.001 から 1 EU/ml の濃度範囲の標準校正の準備を有効にするために必要な多くの中間希釈を準備します。
    2. 最初のラベルのチューブ、各チューブにラル グレード水量 900 μ L を追加します。1EU/mL の濃度の校正標準を準備する 10 の EU/mL solutionn の 100 μ L を追加します。
    3. 3 つの低いキャリブレーション基準を準備する上記のように連続 10 倍希釈を繰り返します。至る 0.001 EU/mL の 1 4 つの校正基準が用意されていることを確認します。
  2. 品質管理の準備
    1. ラル グレード水 950 μ L で 1 EU/mL CSE 溶液 50 μ L を組み合わせることにより 0.05 EU/mL 品質管理を準備します。
      注: は、コントロールの準備の詳細について議論を参照してください。
  3. コントロールの抑制/強化 (IEC) の準備
    1. 1 EU/mL CSE ソリューションを 25 μ l 添加し、指定された希釈テスト ナノマテリアルの 475 μ L を組み合わせることにより 0.05 EU/mL の濃度と IEC を準備します。
      メモ: 追加の詳細についての説明を参照します。
  4. 実験手順
    1. 事前に約 30 分のそれを回すことによってウォーム アップする楽器を許可します。セットアップ検出波長 660 にこの nm は、ラール濁度の適切な。
    2. ユーザー名とパスワードを入力してサインインします。
    3. コンピューターの画面上の対応するアイコンをクリックしてソフトウェア (材料のテーブル) を開きます。
    4. ソフトウェア ホーム画面にデータを収集を選択します。ホーム画面で[全般] タブでの対応する領域にテスト ID とデータのグループ情報を入力します。
    5. ハードウェアタブをクリックしてドロップ ダウン メニューから計測器のタイプを選択します。
    6. 設定、検出波長 660 nm、適した chosing によって混濁ラル ラル混濁法。
    7. シリアル番号、システム ID とシリアル ポートに関する情報が画面に表示されることを確認します。[Ok]をクリックします。確認するもう一度OKをクリックします。
    8. サンプルをテストする順序と同じ順序でサンプル ID を入力します。既定のボタンを使用すると、ネガティブ コントロール、標準曲線とテスト サンプルを入力します。
    9. 各サンプルの重複するチューブを用意し、あらかじめラベル付きのガラス管に 200 μ L (テスト比 4:1) またはネガティブ コントロール (水)、校正規格、品質管理、テストは IEC およびナノ粒子の 100 μ L (テスト比 1:1) を追加します。
    10. 最初テスト バイアル、渦それは簡潔とテストに挿入楽器カルーセルのスロットに 50 μ L (テスト比 4:1) または LAL 試薬を 100 μ l 添加 (テスト比 1:1) を追加します。1:1 の比率を使用している場合、LAL 試薬の量は 100 μ L です。
    11. 他のサンプルについて上記の手順を繰り返します。プロセスは、一度に 1 つずつをサンプリングします。
      注: は、詳細については、ディスカッションを参照してください。

4. 発色ラル

  1. 標準試料の作製
    1. ラル グレード水量 900 μ L と CSE の 100 μ L を使って、1 EU/mL の濃度校正基準の準備を有効にするために必要な多くの中間希釈を準備します。
    2. 900 μ L ラル グレードの水と 1 の EU/mL 校正基準の 100 μ L を使用して、0.1 EU/mL の濃度で 2 番目の校正標準を準備します。
    3. 2 つの低いキャリブレーション基準を準備する上記のように連続 10 倍希釈を繰り返します。至る 0.001 EU/mL の 1 4 つの校正基準が用意されていることを確認します。
  2. 品質管理の準備。
    1. ラル グレード水 950 μ L で 1 EU/mL CSE 溶液 50 μ L を組み合わせることにより 0.05 EU/mL 品質管理を準備します。
      注: は、コントロールの準備の詳細について議論を参照してください。
  3. コントロールの抑制/強化 (IEC) の準備
    1. 1 EU/mL CSE ソリューションの 25 μ L を組み合わせてテスト ナノマテリアルの 475 μ 0.05 EU/mL を準備します。
      メモ: 追加の詳細についての説明を参照します。
  4. 実験手順
    1. 事前に約 30 分のそれを回すことによってウォーム アップする楽器を許可します。セットアップ検出波長 405 にこの nm は、ラール濁度の適切な。
    2. コンピューターの画面上の対応するアイコンをクリックしてソフトウェアを開きます。ユーザー名とパスワードを入力してサインインします。
    3. ソフトウェア ホーム画面にデータを収集を選択します。ホーム画面で[全般] タブでの対応する領域にテスト ID とデータ グループの情報を入力します。
    4. ハードウェアタブをクリックしてドロップ ダウン メニューから計測器のタイプを選択します。計測器を選択します。
    5. シリアル番号、システム ID とシリアル ポートに関する情報が画面に表示されることを確認します。[Ok]をクリックします。確認するもう一度OKをクリックします。
    6. サンプルをテストする順序と同じ順序でサンプル ID を入力します。否定的なコントロールを入力する既定のボタンを使用して標準曲線とテスト サンプル。
    7. 各サンプルの重複するチューブを用意し、あらかじめラベル付きのガラス管に 200 μ L (テスト比 4:1) またはネガティブ コントロール (水)、校正規格、品質管理、テストは IEC およびナノ粒子の 100 μ L (テスト比 1:1) を追加します。
    8. 最初テスト バイアル、渦それは簡潔とテストに挿入楽器カルーセルのスロットに 50 μ L (テスト比 4:1) または LAL 試薬を 100 μ l 添加 (テスト比 1:1) を追加します。1:1 の比率を使用している場合、LAL 試薬の量は 100 μ L です。
    9. 他のサンプルについて上記の手順を繰り返します。プロセスは、一度に 1 つずつをサンプリングします。

5. ゲル血栓ラル

注: このアッセイは、目視と反応管の血栓の検出に基づくサンプルのエンドトキシンの存在を識別します。実験の手順は次のとおりです。ベンチ シートを使用して、結果を記録します。このベンチ シートは必須ではありません、測定結果を記録する他の方法も許容できます。このようなベンチ シートの例は、読者の便宜のための補足資料で提供されます。ラムダ (l) ゲル血栓アッセイの感度、0.03 EU/mL。

  1. 分析試験サンプルの数に合わせて必要に応じてできるだけ多くの反応管にラベルを付けます。ベンチ シート ステップ 1、ステップ 2 およびステップ 3 の試金で使用される複製の数の詳細についてを参照してください。
  2. チューブごとに水、コントロールまたはテスト サンプルの分注 100 μ L。
  3. 最終濃度が 4λ に等しいようなカスタム検索エンジンを準備します。
  4. 上記 2λ の CSE の最終的な集中を達成するために水やテスト サンプルの 100 μ L の標準の 100 μ L を組み合わせます。ラムダと半分ラムダとラムダの四分の一を達成するために 3 回繰り返します。
  5. 風呂の水の温度が 37 ° C であることを確認してください。
  6. 試験管、渦を簡潔にあたりライセートの 100 μ L を追加し、1 時間風呂の水に管だらけでラックを配置します。
  7. 滑らかな動きとチューブを反転します。
  8. +」(しっかりした血栓) を使用して手動でレコードの結果または「-」(血栓または緩い血栓) ベンチ シート。
  9. USP ベット 854によると分析を続行; ベンチ シートを使用して、マテリアルのサポートとして

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Representative Results

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ラルの試金でこの定式化をテストした後に生成されるデータの例は表 1に示します。希釈 5 で発色のラルとペグ化リポソーム封入ドキソルビシンの干渉。ただし、この干渉は、大きい希薄によって克服されました。この製剤は希釈 50 と濁度と発色ラル、500 および濁度ラルで希釈 5 テストされたとき、スパイク回復は 50 と 200% の間だった。希釈倍率によって調整の結果は両方のアッセイの希薄の間の一貫性。また、結果は 3 アッセイ フォーマット間で一貫してあった。

テストのサンプル 濁度ラル、EU/mg (スパイク回復、%) 発色ラル、EU/mg (スパイク回復、%) ゲル血栓ラル、EU/mg (テスト有効なはいまたはいいえ)
ペグ化リポソーム封入ドキソルビシン (材料の表を参照)
希釈 5 0.01 (141) 干渉 < 0.75 (Y)
希釈 50 < 0.025 (187) 0.029 (82) < 1.5 (Y) *
希釈 500 < 0.25 (182) < 0.25 (86) < 3 (Y) * *

表 1: ペグ化リポソーム封入ドキソルビシン ラルを使用して試金でのエンドトキシンの検出。試金のペグ化リポソーム封入ドキソルビシンは、濁度、発色性とゲル血栓ラルを使用してテストされました。サンプルの干渉は、Iec を用いて推定しました。スパイク回復のかっこに示します。50 ~ 200% の値は許容 USP ベット 85 によるとエンドトキシン検出4の標準的です。* と * * このサンプルのテスト結果がそれぞれの希釈 100 と 200 で得られました。ゲル血栓分析希釈が発色で使用されるものとは異なると濁度ラル感度やこの試金の最大有効希釈が低いので。

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Discussion

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このプロトコルで提供される情報は15,26の前に記述され、米国食品医薬品局 (US FDA または FDA) や米国薬局方 (USP)4刊規制のいくつかの文書に依存しています。,5,6,27、プロトコル STE1.2 (濁度ラル)、STE1.3 (ゲル血栓ラル) の NCL のウェブサイト20もありと、STE1.4 (発色ラル)。

テスト ナノ材料は、LAL 試薬水または無菌、パイロジェン フリーの PBS のいずれかを用意しています。研究サンプルの pH は、低 (< 6) および高い (> 8) pH ライセートの最適なパフォーマンスを妨げるために重要です。テスト粒子の pH が 6-8 の範囲外の場合、パイロジェン フリー水酸化ナトリウムや塩酸を使用して調整できます。このような調整が実行されると、電極からのサンプルの汚染を避けるために不可欠です。したがって、この手順を実行するサンプルの小さい因数は別々 のチューブに削除し、pH を測定するために使用します。

PBS または別のバッファーにサンプルが用意されて、空のバッファーはこのテストも含まれます。各物質の濃度は、ケースによって異なります。テストを使用して、アクティブな医薬品原料 (API) ミリグラムあたりエンドトキシン汚染量を推定します。しかし、ナノ製剤の種類によって濃度が推定できる mg 全配合または総要素の (e.g。、金、銀、それぞれ金、銀および鉄酸化物ナノ粒子の鉄)。MVD を超えない数の希薄を使用して素材でサンプルをテストするとします。テスト粒子のすべての希薄をラル グレードの水を使用しております。

3 つのパラメーターは、MVD の計算に使用されます。彼らは、エンドトキシン制限 (EL)、サンプル濃度およびアッセイ感度 (λ)4。エンドトキシン制限 (EL) を計算する次の数式を使用: エル = K/M, K はしきい値の発熱量 (e.g, 5 EU/kg 導入部分で説明したように) M は体の 1 キログラムあたり管理向けテスト ナノマテリアルの最大投与量。単一の時間4の重量。前述のように、放射性医薬品、または医療機器として使用されるナノ材料のエルの推定依存しきい値デグサ線量とか数式とは異なり 5/M。これらの詳細は、導入に記載され、USP と米国 FDA ガイドライン4,5,6さらに見直される可能性があります。点眼や眼内のデバイスの推奨されるエンドトキシンの制限は、これらの製品の6の米国 FDA ガイドラインで提供されます。動物モデル (e.g。、マウス) は nanoformulation の投与量を確立するため、この情報を使用して、いわゆる人間の等価線量 (HED) を推定。HED はで除して算出した動物の線量換算係数、各動物種に固有であります。たとえば、変換係数は、12.3、6.2、マウス、ラット、ウサギ、それぞれ273.1 です。変換プロシージャとそれを使用するための理論的根拠は、米国 FDA ガイドライン27で詳細に説明します。癌治療は、mg/m2で表されるサーフェス ボディ面積あたりしばしば投与されています。平方メートル当たりミリグラムの投与薬のエルを計算する USP ガイドラインに従う 1 つか、この量を mg/kg の範囲に変換します。Mg/m2の用量は、27種特異的変換係数を用いた mg/kg で投与量を調整できます。大人の人間、それは 37 と大量の定数27を参照する Kmとして示されています。Km 要因が kg/m2単位それは平方メートル (m2)27の表面積で割った値キログラム (kg) の体重と同じです。たとえば、人間の線量または 74 mg/m2の HED は、2 mg/kg または 74/37 に対応します。MVD を調べる USP ベット 85 標準は、次の数式を使用: MVD = (EL サンプル濃度 x)/λ)4。架空のシナリオでナノ粒子サンプル濃度は 10 mg/mL とマウスでの最大投与量は 615 mg/kg。この場合、HED は 615/12.3 = 50 mg/kg。髄腔内を除くすべてのルートのための EL は 0.1 EU/mg (5 EU/kg/50 mg/kg)、MVD は 1,000 ((0.1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 EU/mL)。

多くの場合、研究生ナノマテリアルのエンドトキシン汚染を評価する際、線量情報は利用できません。これらの材料の MVD とエルを推定する方法の調和させていたプロシージャがないです。このケース スタディは、在庫から直接テストを実行 (よくこの溶液の濃度は 1 mg/mL) といくつかの希釈、通常 5、50、500 -、5,000 ひだ。投与量、投与経路、サンプル濃度、注入は、与えられたテスト ナノ材料変更の時間、エルと MVD も変更されます。したがって、1 つは、情報を評価し、量、投与時間、想定される経路と特定の製剤の濃度に関連するその他のパラメーターのコンテキストでエルと MVD の推定を実行します。

注意することが重要だカタログ番号と製品仕様 (e.g。、効力量バイアルあたり)、CSE のはラルの異なる形式の異なる。ラルはゲル血栓ラルにも使用できます濁度で使用される検索エンジン。ただし、発色のラルの CSE は、このアッセイの形式に固有です。次の手順に従って、すべてのアッセイ フォーマットで使用される CSE に適用されます。検索エンジンは、凍結乾燥粉末として提供されたエシェリヒア属大腸菌リポポリサッカライド (LPS) です。この標準メーカー参照標準エンドトキシン (RSE) に対して知られている効能を認定です。~3.2 - パイロジェン フリー LAL 試薬水 5.0 mL、CSE のバイアルの内容を再構成する必要があります。さまざまな分析フォーマット用 CSE の違いに加えて、再構成のボリュームもこの規格の各ロットに固有です。したがって、最終的な標準の各ロットの CSE 原液濃度を計算する必要があります。各バイアルに含まれる標準の力に基づいて、計算が実行されます。エンドトキシン標準の各ロットに固有解析の証明書には、効力とバイアルあたりの量についての情報が含まれています。1 つは、厳密な渦標準 30 ~ 60 秒間再構成中および使用中に。セトリング時間 5-10 分を使用して再構築を実行することはお勧めも、30-60 分以上すべてが材料を凍結乾燥を確認する時間枠が解決策になります。アッセイに使用する前に室温に CSE 株式を平衡します。溶解後 CSE 株式保管冷蔵することができます、4 週間安定です。

検索エンジンと同様に、LAL 試薬も各形式に固有です。次の手順に従って、すべてラール アッセイ形式に該当します。LAL 試薬は、凍結乾燥粉末として提供されます。各バイアルを再構成する製造元の推奨事項に従います。ラル グレード水またはベータ-グルカンを阻害するバッファーのいずれかを使用できます。それはベータ-グルカンから干渉を除くことができますので、このケーススタディで β グルカンを阻害するバッファーが適しています。この偽陽性の干渉は、セルロース アセテート フィルター ナノマテリアルの合成時に使われる、グルカン汚染15のソースとしてためナノ材料で非常に共通です。ほとんどバイアル 5 mL の最終巻に再構成が必要になります。10 年以上のこのアッセイで著者の経験に基づいて、それがついたこのバッファーの包含が反応が遅くで最低のキャリブレータを許可する機器の設定で最大発症時間を増やす必要があります、開発に 0.001 EU/mL の濃度です。

標準の準備の間に正確な希釈を確保するためは、10 倍希釈の手順を使用することをお勧めします。在庫やパイロジェン フリー水の高い濃度が 900 μ L に標準の 100 μ L スパイクで連続 10 倍希釈液を用意できます。以来、CSE 株式の濃度は通常高 (1,000 〜 EU/mL)、中間希釈濃度が 100 と 10 EU/mL を 1 EU/mL の濃度測定校正器を準備する前にお勧めの準備。テスト サンプルとライセート二つの比率は、このプロトコルのとおりです。にもかかわらず、両方の比が使われます曲線直線性が許容理想的ではない 4:1 の比率とベータ-グルカン (材料の表を参照) を阻害するバッファーが使用されます。

同じ規則校正標準準備について上記のようには品質管理 (QC) の準備にも当てはまります。これらのコントロールを使用してアッセイが正常に機能していることを確認します。パイロジェン フリー水に CSE の既知の量のスパイクによって準備されます。QC の濃度が測定範囲の真ん中に通常選択されます。濁度ラル試金の範囲は、1 に 0.001 EU/mL です。したがって、0.05 EU/mL の濃度で QC を使用します。試金の範囲内でその他の濃度は、品質管理の準備にも使用できます。

抑制強化コントロール (IEC) を肯定的な商品管理 (PPC) とも呼びます。それは、テスト サンプルに CSE の既知濃度のスパイクによって準備されます。IEC (PPC) の濃度が測定範囲の真ん中に通常選択されます。濁度ラル試金の範囲は、1 に 0.001 EU/mL です。したがって、0.05 EU/mL の濃度で IEC を使用します。この IEC の準備 1 EU/mL CSE 溶液 50 μ L を組み合わせてテスト粒子の 950 μ L 1 つ必要があります。IEC は、テスト ナノマテリアルの各希釈用に用意しています。たとえば、ナノ定式化は、3 つの希薄 (1:50、1: 500、1:5, 000) でテストされて、1 つは、3 Iec をそれぞれこれらの希薄のための 1 つを準備します。試金の範囲内でその他の濃度は、IEC サンプルを準備しても使用できます。このコントロールを使用して、指定されたナノ配合試験結果の妥当性を理解します。USP によるとテスト結果、スパイク回復の IEC (PPC) が 50 ~ 2004場合に有効です。エンドトキシン検出し、したがって、テストにテスト ナノマテリアルが阻害することスパイク 50% 未満の回復手段の過小推計のエンドトキシン汚染と有効ではありません。スパイク回復 200% 以上では、試験材料アッセイ結果が向上または汚染のエンドトキシンのあまりにも高いレベルが含まれていることを示唆しています。強化の場合試験結果いないも正確です。そのような干渉とそれらを克服するいくつかの方法の例は、説明されている以前12,15をされています。

濁度と発色アッセイを実行している場合は、リピータのピペットを使用して、すべてのサンプルに LAL 試薬を追加するそれをお勧めします。平均測定器の操作時間は 7200 秒です。しかし、反応は速くなったり遅くライセートの一部ロットですることができます。場合、反応が遅い、1 つ 9600s 以上、機器の設定を変更する必要があります。この変更を開発する最低の校正となります。

ペグ化リポソーム封入ドキソルビシンは 2 Mg/ml の濃度でアクティブな医薬品 (API) の成分を含む製剤です。50 mg/m2の用量としてクリニックで使用されます。この量を mg/kg の範囲に変換するには、係数 3727によって分けられます。ペグ化リポソーム封入ドキソルビシン mg/kg の用量したがって、1.35 であります。計算するエル 5 (EU/kg でしきい値線量パイロジェン) 1.35 (Doxil の mg/kg の線量) で除算し、3.7 EU/mg4を取得します。この番号は、ペグ化リポソーム封入ドキソルビシン 1.35 mg/kg の線量で管理できることを安全に 1 1 時間あたりエンドトキシン定式化には 3.7 EU/mg、mg が API を参照を超えない場合を意味します。

次に、この情報を使用して、ラルの試金の MVD を計算します。濁度、発色性と本論文で示したゲル血栓アッセイの感度 (ラムダ) は、それぞれ 0.03 EU/mL で、0.001 0.001 です。したがって、MVD、濁度と発色アッセイ 7,407 ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 EU/mL)、および 247 ゲル血栓の試金 ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 EU/mL)。

ドキソルビシンは、発色ラル28, 29の測定波長と重なる幅広い吸光度スペクトルを有する。また、ほとんどのリポソーム製剤は濁り、ミルキーが表示されます。この固有の濁度は、リポソームの濁度測定に干渉の非常に一般的な理由です。ペグ化リポソーム封入ドキソルビシンの場合濁度による干渉は希釈 5 スパイク回復値が 50 ~ 200% (表 1) によって証明されるように襲われました。しかし、同じ希釈ドキソルビシンで濃度はまだ十分に高い発色性ラール (表 1) を妨害します。発色のラルとペグ化リポソーム封入ドキソルビシン干渉を克服するを助けた 2 つ以降希薄 (50 と 500)ゲル血栓アッセイは濁度とサンプル色の独立したゲル血栓範囲内、製剤中のエンドトキシン レベルにあるので、ペグ化リポソーム封入ドキソルビシンでしたに干渉しないゲル血栓試金テストすべてで希釈。このケース スタディでペグ化リポソーム封入ドキソルビシンのいくつかの希釈はこれらの試金のため使用されました。ゲル血栓試金のため希釈 5、50、500 の濁度と発色として 50、100 と 200 は、MVD 内にあるために選ばれました。この試金の感受性はまたより低いゲル血栓アッセイの MVD は濁度と発色ラルスよりも低下します。定式化は、濁度と発色アッセイ希釈 500 でラルと干渉、(例えば5,000、6,000、7,000 または 7,407) より高い希薄で解析が実行でした。ゲル血栓アッセイにおける希釈 50 で得られたエンドトキシン レベルだったので EL の下、低い希釈でこの公式の分析が実行されませんでした。しかし、他のケースでテスト続けることができる希釈 20、10、5、または最低のないを識別するために 2 に希釈を干渉し、製剤中のエンドトキシン レベルが EL 以下かどうかを理解します。

ゲル血栓試金のため、この試金の期間の水お風呂の水循環機能をオフまたは水の流れ、血栓を損害賠償し、g の精度に影響を与える可能性がありますのでこのようなオプションを使用せず水風呂の利用に不可欠なは言及することが重要です。エル塊ラルの試金。サンプル希釈液を増やすことによってラル試金ナノ粒子干渉を克服するためには常に。戦略や干渉の様々 なタイプとラルの試金がされている問題をよく表すナノ粒子の例を克服するためのいくつかのアプローチ他12,13,14 の他のグループと私たちについて議論 ,15,30,31。本稿の分析は、モデルの定式化に基づいています。その他の nanoformulations の経験は異なる場合があります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

調査は国立がん研究所から連邦政府の資金によってサポートされた国立衛生研究所、契約 HHSN261200800001E の下で。この文書のコンテンツ ビューまたは政策の保健社会福祉省、必ずしも反映しないも言及されている商号、商品、または組織は、米国政府によって裏書を意味します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

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References

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ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して
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Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

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