Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتدريب سكان خلية استخدام المحفزات الكهربائية والميكانيكية محاكاة فسيولوجيا القلب. هذا التحفيز الكهروميكانيكية يعزز إمكانات كارديوميوجينيك الخلايا المعالجة وهو استراتيجية واعدة لزيادة العلاج بالخلايا، والنمذجة المرض، وفحص المخدرات.
Abstract
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في البلدان المتقدمة النمو. ونتيجة لذلك، قد حفز الطلب على العلاجات الفعالة خلية القلب الباحثين في مجالات الهندسة الحيوية والخلايا الجذعية لتطوير في المختبر عالية الدقة البشري عضلة القلب لكل من البحوث الأساسية والتطبيقات السريرية. ومع ذلك، هو النمط الظاهري غير ناضجة من خلايا القلب قيداً على الحصول على الأنسجة التي تحاكي وظيفيا في عضلة القلب الكبار، الذي يتسم أساسا بالإشارات الميكانيكية والكهربائية. وهكذا، والغرض من هذا البروتوكول هو إعداد وتنضج السكان الخلية المستهدفة عن طريق تحفيز الكهروميكانيكية، تلخيصا المعلمات الفسيولوجية. هندسة الأنسجة القلبية وتتطور نحو المزيد من النهج البيولوجية، واستراتيجيات تستند إلى المنبهات الفيزيائية، ومن ثم، تكتسب زخما. الجهاز لهذا الغرض هي فريدة من نوعها ويسمح التحفيز الكهربائية والميكانيكية فردية أو متزامنة، تتميز بعناية والتحقق من صحتها. على الرغم من أن قد تم تحسين المنهجية لهذا مشجعا وعدد سكانها خلية معينة، بالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة أن تتكيف خطوط الخلايا والأجهزة الأخرى. وتوفر النتائج هنا دليلاً على التزام القلب زيادة السكان خلية بعد التحفيز الكهروميكانيكية. إظهار الخلايا اليكتروميتشانيكالي حفز تعبير زيادة علامات القلب الرئيسية، بما في ذلك الجينات المبكرة والهيكلية، وتنظم الكالسيوم. ويمكن تكييف هذه الخلية مفيدة لمواصلة العلاج بالخلايا التجديدي، والنمذجة المرض، وفحص المخدرات الفائق.
Introduction
وتستند وظيفة القلب اقتران الإثارة الكهربائية والميكانيكية الانكماش. باختصار، تسمح الوصلات بين الخلايا كارديوميوسيتي نشر الإشارة الكهربائية لإنتاج تقلصات متزامنة تقريبا من القلب أن ضخ الدم النظامية، ومن خلال نظام الرئوية. وهكذا تخضع خلايا القلب، القوى الكهربائية والميكانيكية التي تنظم وظيفة الجينات الخلوية والتعبير. وبناء على ذلك، حاول العديد من المجموعات تطوير منصات الثقافة التي تحاكي البيئة الفيزيولوجية القلب لفهم دور التحفيز الميكانيكية والكهربائية في التنمية القلب والدالة، ونضج. في المختبر الكهربائية والميكانيكية التحفيز على حدة قد طبقت على نطاق واسع في هندسة الأنسجة القلبية لتعزيز الخصائص الفنية، وزيادة نضوج الخلية، أو تحسين اقتران خلية خلية والكالسيوم مناولة1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21-غير تكييف الكهروميكانيكية متزامن لا تزال غير مستغلة بسبب التحدي المتمثل في وضع مشجعا والبروتوكول، وبسبب التحسين الإلزامي22.
تناولت أعمال أولية التحفيز الكهروميكانيكية كمزيج من التحفيز الكهربائي ونضح وسائط الإعلام؛ ومع ذلك، لا تنطوي على التدفق تشوه على أساس السلالة النموذجية لملء البطين23،،من2425. في وقت لاحق، المزيد من النهج الفسيولوجية مجتمعة المحفزات الكهربائية مع التشوه البدني أو امتداد لتقليد isovolumetric انكماش26،27،،من2829،30 ،31. فينغ et al. ووصف المظاهرة الأولى من التحفيز للمقاولات في عام 2005، الإبلاغ عن تعزيز خصائص الحجم والهوس كارديوميوسيتي26. وانغ pretreated الخلايا الجذعية الوسيطة مع 5-أزاسيتيديني et al. وتطبق المتزامنة تكييف الكهربائية والميكانيكية، وتحسين ريسيلولاريزيشن وبقاء الخلية، وتمايز القلب والأنسجة إعادة عرض27. منذ تلك المنشورات، قد ذكرت في حفز الكهروميكانيكية مونولاييرس الخلية المزيد من المجموعات أو هندسة الأنسجة (مثل الأسود28نوفاكوفيتش فانيك29،31، ولدينا مجموعة30) مع اختبار الخلايا مكيفة أول المجراة في30. بإيجاز، اختبر مورغان والأسود العديد من تركيبات من المحفزات الكهربائية والميكانيكية، الإبلاغ عن أن التوقيت بين التحفيز أمر حاسم نظراً لتأخر التحفيز الكهروميكانيكية مجتمعة تسفر عن نتائج أفضل28. بعد ذلك، جودير-Furnémont والمتعاونين الأمثل بروتوكولا تحفيز الكهروميكانيكية لثوابت عضلة القلب هندسيا من خلايا القلب الفئران حديثي الولادة وتحقيقه، للمرة الأولى، علاقة إيجابية قوة تردد29. بعد ذلك، ذكرت مجموعتنا أن الخلايا اليكتروميتشانيكالي اشترطت زيادة التعبير عن علامات القلب الرئيسي في المختبر وقاعدة عريضة مفيدة تأثيرات المجراة في، مثل تحسين وظيفة القلب أو زيادة كثافة السفينة في احتشاء المنطقة الحدودية30. نشر مؤخرا أظهرت تعرض أنسجة القلب من كارديوميوسيتيس المستمدة من الخلايا الجذعية لتكييف الكهروميكانيكية الذي تم التوصل إليه نضج مستوى أقرب إلى البشرية الكبار القلب هيكل ووظيفة31. بالإضافة إلى ذلك، تشمل منصات بديلة التحفيز ثلاثي الأبعاد السقالات اليكترواكتيفي التي توفر الكهربائية والميكانيكية، والإشارات الطوبوغرافية للخلايا تعلق32. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا الناجم عن تشوه الميكانيكية (خلية أحادي الطبقة وضغط الشارع) مع أقطاب المط محاكاة الظروف الفسيولوجية العادية، فضلا عن الظروف القاسية33.
ولذلك، والأساس المنطقي أن المحفزات الكهروميكانيكية في المختبر على أساس الظروف الفسيولوجية يمكن أن تعزز إمكانات كارديوميوجينيك خلية. في الواقع، هذا التحفيز يمكن أن تستفيد كذلك التكاملات الخلايا العلاجية في عضلة القلب في سيناريو السريري أو زيادة نضوج الأنسجة للمخدرات-فحص الطلبات.
وبالإضافة إلى ذلك، نحن معزولة ويتسم أن خلايا البشرية السلف المستمدة من الأنسجة الدهنية للقلب المنشأ (أتدبكس القلب)34. وتقع هذه الخلايا في الدهون ابيكارديال. هذه الخلايا تعرض تأثيرات نسيجية ووظيفية مفيدة في علاج احتشاء عضلة القلب وأيضا الحفاظ على التمايز القلب وبطانية المحتملة. 30 , 35-افترضنا أن هذه الفوائد ستزيد بعد التحفيز الفيزيائية الأحيائية.
ونتيجة لذلك، علينا وضع جهاز ونظام تحفيز للسكان خلية من الاهتمام والتحقيق الآثار. هذا البروتوكول الكهروميكانيكية هو استراتيجية جديدة للحث على الخلية النشطة التي تمتد بطريقة عقيمة ونونينفاسيفيلي بالمقارنة مع السابق منشورات36، في تركيبة مع تنشيط الحقل الكهربائي. الأسلوب الذي ذكرته هنا يشرح بالتفصيل الجهاز والطريقة المستخدمة لتحفيز الخلايا الكهربائية والميكانيكية والكهروميكانيكية.
هذا الجهاز يمكن أن توفر التحفيز الكهربائية والميكانيكية على حد سواء، بشكل مستقل أو في نفس الوقت. يتم التنشيط مع نهج جديد موسع والعقيم الذي يتضمن دعم الخلية بريستيريليزيد، أقطاب توضع داخل لوحة ثقافة قياسية، والنظام الأساسي الذي يدفع القوات الميكانيكية والكهربائية (الشكل 1).
يمكن أن تعقد المنصة تصل إلى ثقافة ست لوحات ويتكون هيكل ساندويتش poly(methyl methacrylate) الليزر قطع وقطع الدوائر المطبوعة-المجلس. النموذج الأولى للنظام الأساسي يعتمد على مزيج من أحادية الطور للبرمجة الكمبيوتر التي تسيطر عليها الكهربائية مشجعا، لوحة دائرة مطبوعة لاتصال قوي كهربائي، وستة 10 مم × 10 مم × 5 مم مطلية ثابتة نيوديميوم مغناطيس توضع القرب من جانب واحد من ألواح الثقافة. وهناك أيضا قضيب من ألمنيوم مع المغناطيس دافعة ستة (النموذج نفسه) وضعت أمام الجانب الآخر من لوحات الثقافة وانتقلت مع سيرفوموتور خطية. المحرك مدفوعة من قبل وحدة تحكم محرك، تعمل من خلال منفذ RS 232 بالبرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد). من خلال واجهة المستخدم ومشجعا للبرمجة، فمن الممكن لبرنامج كثافة الكهربائية، مدة النبضة والتردد، وتواتر التحفيز الميكانيكي، دورة العمل، والعدد من البقول، مطال النبض (رحلة المغناطيس)، والمنحدر.
الشكل 1 : مشجعا الكهروميكانيكية. (أ) PDMS بناء المستخدمة لتكييف الخلية. (ب) الرسم بناء PDMS، بما في ذلك الأقطاب الكهربائية وقطع المغناطيس. (ج) تفصيل الدوائر المطبوعة المجلس (منصة) المستخدمة لأداء التكييف الكهروميكانيكية. وقد تم تعديل هذا الفريق من Llucià-فالديبيراس et al.30. (د) صورة لواجهة المستخدم ومنصة التحفيز الكهروميكانيكية (الكمبيوتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويرد وصف كامل مشجعا وطريقة لتكييف الكهروميكانيكية في براءات الاختراع الدولية اثنين و WO-2013185818-A137 و WO-2017125159-A138.
سيليكون متوافق حيويا وكانت مصممة لتوفير الدعم الهيكلي للخلايا واقطاب المغناطيس بنيات الموصوفة سابقا10،21. بإيجاز، وهي تتألف من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، مصبوب وعلاجه في درجة حرارة الغرفة، مع معامل الشباب 1.3 الآلام والكروب الذهنية، قريبة من المستويات الفسيولوجية. يحتوي على بنية تجمع ثقافة خلية في منطقة مرنة (10 مم × 10 مم × 2 مم)، فتحتا عرضية الداخلية عقد أقطاب كهربائية، واثنين المضمنة 6 مم × 2 مم × 4 مم مطلية نيوديميوم المغناطيس. أقطاب كهربائية يتم بناؤها مع 0.2 مم البلاتين الأسلاك الملتوية حول 2 مم × 3 مم × 12 مم تترافلوروايثيلين (PTFE) الأساسية بار (21 سم كل قطب، يتحول نحو 23) وتوضع على طرفي نقيض من منطقة مرنة تهيئة مجال الكهربائي لحمل التحفيز الكهربائي. تمتد الميكانيكية يتحقق من خلال الجذب المغناطيسية بين المغناطيس جزءا لا يتجزأ من الدعم والمغناطيس الخارجي بجوار لوحة الثقافة وعلى الذراع الألومنيوم تتحرك. وبهذه الطريقة، يمكن تمديد دعم الخلية دون كسر الحاجز العقيمة. هذا النهج مناسب لأحادي الطبقة خلية لكن يمكن تكييفه لثوابت ثلاثي الأبعاد، كذلك.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون نمطاً منتظما مطبوع حيث يتم المصنف الخلايا، قضت حيود [غرتينغ] (1,250 الأخاديد في مم) باستخدام. التصور مباشرة من الخلايا المستزرعة في بناء PDMS تحت برايتفيلد ومجاهر الفلورسنت ممكن بسبب شفافيته وسمك 0.5 مم. في هذه الحالة، قد تجمع الثقافة PDMS نمط سطح رأسي، عمودي على القوة تمتد محاذاة الخلايا عمودياً إلى الحقل الكهربائي، مما يقلل من التدرج الحقل الكهربائي عبر الخلية.
ويبين الشكل 1 وصفاً مفصلاً لبناء والجهاز المستخدم للتنشيط. بناء PDMS والخصائص هي الأمثل للخلية تمتد (الشكل 1 أ، ب). مشجعا البلدان المتقدمة النمو والتحقق من صحتها للتطبيق الفعال لتحفيز الكهربائية والميكانيكية المطلوبة للخلايا المرتبطة ببناء PDMS. وتشمل هذه العملية ضمان قابلية التشغيل المستخدم واتصال جيدة من خلال واجهة البرنامج (الشكل 1، د).
يرد وصف للإجراءات لتحفيز الخلية باستخدام هذا الجهاز مصنوعة خصيصا في قسم البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتستخدم هذه الدراسة أتدبكس القلب البشري من عينات المرضى. استخدامها وافقت عليه لجنة الأخلاقيات المحلية، وأعطى جميع المرضى المستنيرة. بروتوكول الدراسة تتفق مع المبادئ الواردة في "إعلان هلسنكي".
1-الأعمال التحضيرية
- ملاقط اﻷوتوكﻻف اثنين، 12 PTFE البلاتين أقطاب التحفيز الكهربائي، وبعض المناشف الورقية، في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
-
تعقيم 12 PDMS بنيات مصنوعة خصيصا (الشكل 1أ).
- تغسل كل بناء مع 5 مل ماء المقطر العقيمة مع التحريض المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- أغسل x 1 مع 5 مل إيثانول 70% مع الإثارة المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- أغسل x 5 مع 5 مل ماء المقطر العقيمة مع التحريض المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة للمياه والصرف الصحي، لإزالة المخلفات الكحولية.
- الجاف بنيات على مناشف ورقية معقمة داخل بين عشية وضحاها تدفق مجلس الوزراء.
- تخزينها في أنابيب الطرد المركزي العقيمة 50 مل حتى الاستخدام.
2-خلية البذر (اليوم-1)
- قبل الخلية البذر، نقل بنيات PDMS تنظيفها إلى لوحات العقيمة وتعرضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق لضمان التعقيم الكامل.
- نقل كل بناء إلى لوحة الثقافة خلية 35 مم، أو لوحة 6، حسنا، لبذر الخلية فورا.
-
تريبسينيزي المتلاقية قارورة T75 من أتدبكس القلب.
- أغسل قارورة T75 مع 5 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
- أضف 1 مل من 0.05% التربسين-يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا.
- إضافة 5 مل متوسطة كاملة لإلغاء تنشيط التربسين-يدتا.
- جمع كافة الخلايا في أنبوب 15 مل والغسيل قارورة x 2 مع 5 مل من برنامج تلفزيوني لجمع أي الخلايا المتبقية.
- الطرد المركزي في 230 س ز لمدة 5 دقائق عند 22 درجة مئوية وإزالة المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في 2 مل متوسطة كاملة لحسابها مع الدائرة هيموسيتوميتير.
- البذور 200 ميليلتر من القلب أتدبكس (2.5 × 105 خلايا/مل) في تجمع الخلية من بنيات PDMS 12 (الشكل 1أ، ب) أن يكون ~ 80% السطح بذر المشمولة بالخلايا بعد يوم، واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
ملاحظة: بعد ح 2 – 4، ينبغي أن يرفق الخلايا. أعد العدوى الخلية وفقا لحجم الخلية والنمو. لخلايا أصغر، ينبغي زيادة كثافة البذر. - إضافة 2 مل متوسطة كاملة بريوارميد (α-الفنزويلية وتستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل، 1% ل الجلوتامين، و 1% البنسلين-ستربتوميسين) بلطف للوحة الواحدة.
- احتضان بنيات في ظروف الثقافة (عادة ما تكون 37 درجة مئوية و 5% CO2) بين عشية وضحاها.
3-الكهروميكانيكية التحفيز الإعداد (يوم 0)
- قبل البدء في هذا الإجراء، أخذ ستة بنيات لتحفيز الكهروميكانيكية وستة كعناصر تحكم نونستيمولاتيد. مع أقل من ستة لوحات للتحفيز، استخدام ثوابت فارغ مع نفس الحجم المتوسط لضمان تنشيط الحقل الكهربائي السليم.
- تنظيف وحدة التحفيز مع الإيثانول 70% ووضعه في التدفق مجلس الوزراء.
- جعل أقطاب العقيمة وملاقط داخل مجلس الوزراء التدفق.
- إزالة 90% من وسائل الإعلام من لوحة الثقافة بسهولة التلاعب بأقطاب وثوابت. أولاً، وضع بنيات PDMS في الموضع الصحيح لضمان جاذبية مغناطيسية (PDMS التشرد داخل لوحة الثقافة نحو المغناطيس) بين المغناطيس الثابتة والمتحركة على حد سواء. بعد ذلك، الاتصال سلك البلاتين الموصلات القطب والجزء PTFE في مساحة معينة في بناء PDMS.
- إضافة 2.5 مل متوسطة كاملة بريوارميد جديدة لكل بناء.
ملاحظة: الحفاظ على العقم طوال فترة الإجراءات، وتعمل على بناء واحد في وقت واحد. الإبقاء على بقية من بنيات في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى الاستخدام. - حالما يتم وضع كافة بنيات PDMS وكهربائيا متصلاً بمنهاج العمل، يعود النظام الأساسي إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- قم بتوصيل مصدر الكهربائية والميكانيكية.
-
قم بتكوين برنامج التحفيز. تحديد نظم التحفيز الكهربائية والميكانيكية من خلال واجهات المستخدم مشجعا الكهربائية والتطبيق، والذي يتحكم في تنشيط ميكانيكية. تعيين التزامن على النحو التالي.
- التبديل مشجعا الكهربائية. انتظر إلى أن تظهر في العرض القائمة الرئيسية.
- ثم، حدد الخيار 2: تحرير تسلسل + Enter.
- تحرير قائمة التسلسل كما يلي.
- استخدم علامة التبويب وضع لتحديد الجهد أو التيار. حدد الحالية عن طريق النقر فوق + ، ثم اضغط Enter.
- لعلامة التبويب السعة ، حدد 1 (mA) مع +/- واضغط Enter.
- ل الفترة (T)، حدد 1000 (مللي ثانية) مع +/- واضغط مفتاح الإدخال Enter.
- تعيين مدة النبضة (Tw) إلى 2 (مللي ثانية) مع +/-- ، واضغط على Enter.
- على علامة التبويب وضع المشغل ، حدد خارجي بالبرمجيات واضغط Enter.
- في القائمة الرئيسية، حدد الخيار 4: إنشاء تسلسل واضغط على Enter.
ملاحظة: تقع مشجعا الكهربائية في الاستعداد حتى تتلقى أمر الزناد من تطبيق مشجعا الميكانيكية عن طريق المنفذ التسلسلي.
- نفذ الخطوات التالية في المقطع التحفيز الميكانيكي للوحة التحكم التطبيق (الشكل 2-ج).
- كتابة 1,000 (ms) في عنصر تحكم النص فترة النبض .
- كتابة 500 (مللي ثانية) في عنصر تحكم النص على الوقت (Tw) لتعيين مدة نبض الميكانيكية.
- الكتابة 2,000 (الاتحاد الأفريقي) في عنصر تحكم النص رحلة لتسليم استطالة بناء 10%. هذا هو عدد الخطوات في المحرك التحكم الخطية.
ملاحظة: بروتوكول تنشيط تطبيق هنا يتكون من البقول موجه مربعة أحادية الطور الحالي بالتناوب 2 مللي ثانية أم 50/سم في 1 هرتز و 10% تمتد لمدة 7 أيام. يتم تعيين أوقات صعود وهبوط نبض الميكانيكية في 100 مللي ثانية، تقليد تقريبا على شكل نبض الضغط الموقد. أيضا، يتم تعيين الوضع التكرار المستمر وهناك عداد عرض عدد النبضات.
- التبديل مشجعا الكهربائية. انتظر إلى أن تظهر في العرض القائمة الرئيسية.
- تغيير الإعلام 2 س أسبوع (الاثنين والخميس بعد الظهر). أولاً، قم بإزالة الوسائط القديمة؛ بعد ذلك إضافة وسائط الإعلام الحارة على جانبي دعم PDMS، ابدأ مباشرة على تجمع الخلية.
ملاحظة: إذا كانت الخلايا يكون معدل نمو المرتفع، ينبغي أن تكون وسائل الإعلام 3 المتغير x أسبوع (مثلاً الاثنين والأربعاء والجمعة). من الضروري أن قطع وإعادة توصيل كافة الكبلات، ولكن ليست هناك حاجة إزالة لوحات الثقافة واقطاب من مكانها. - جمع العينات بعد إجراء التجربة.
4-نموذج جمع في نهاية التجربة (اليوم السابع)
-
لإجراء تحاليل الحمض النووي الريبي
- تغسل بنية x 2 مع 3 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أضف 3 مل من 0.05% التربسين-يدتا لكل لوحة (ما يكفي لتغطية بناء أسرة) وانتظر لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- بعد أن يتم فصل الخلايا، إضافة 2 مل متوسطة كاملة لإلغاء تنشيط التربسين-يدتا.
- جمع كافة الخلايا في 15 مل أنبوب وتغسل بنية x 2 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لجمع أي الخلايا المتبقية.
- أجهزة الطرد المركزي في 230 س ز لمدة 5 دقائق عند 22 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- نقل الحل خلية أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 230 س ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية وتخزين بيليه في-80 درجة مئوية في 700 ميليلتر من تحلل الكاشف للمزيد من الحمض النووي الريبي العزلة.
- عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة أدوات تجارية، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- عكس-نسخ الرنا المعزولة باستخدام مجموعة أدوات وعشوائي hexamers، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- لتركيزات الحمض النووي الريبي الصغيرة، بريامبليفي، وتمييع 1:5 مع المياه خالية من رناسي ثم، قبل أن يتم تنفيذ النسخ العكسي في الوقت الحقيقي اللاحقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR). تواصل مع بروتوكول قياسي ل RT-PCR الوقت الحقيقي والتحقق من علامات القلب الرئيسية.
ملاحظة: علامات القلب نموذجية تشمل العلامات المبكرة والمتأخرة من فئات مختلفة، مثل عوامل النسخ القلب (2A عامل محسن ميوسيتي على حدة [MEF2A] بروتين ملزمة غاتا 4 [غاتا-4]) والهيكلية (تروبونين القلب أنا [كتني]، القلب تروبونين تي [كتنت], α-أكتينين) وتنظيم الكالسيوم (Connexin43 [Cx43]، شركة ساركو-/هيولى Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. يمكن أيضا إجراء عزل البروتين إذا لزم الأمر. يمكن إجراء عزل البروتين والحمض النووي الريبي متزامنة مع نفس العينة، باستخدام الكواشف المتوفرة تجارياً ومجموعات (جدول المواد) إذا كانت كمية العينة أقل.
-
إيمونوستينينجس
ملاحظة: وهذا يتم مباشرة على الخلايا المرفقة إلى تجمع خلية بناء PDMS. ولذلك، نوصي بوضع، كل مرة 1 سم × 1 سم من البارافين الفيلم على رأس تجمع الخلية، وبصرف النظر عن اللوحة غطاء، لتقليل تبخر الحلول حضانة.- تغسل بنية x 2 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إصلاح الخلايا المرفقة للبناء مع 2 مل فورمالين 10% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل الخلايا 3 x مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. للتخزين على المدى الطويل، تترك العينات في برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.1% في 4 درجات مئوية.
- بيرميبيليزي الخلايا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني + المنظفات 0.5% (3 x، كل الوقت 5-10 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة).
- احتضان الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + ألبومين المصل البقري 1% عند درجة حرارة الغرفة ح 1، 10% مصل الحصان + + المنظفات 0.2% كتلة جسم غير محدد ملزم.
- احتضان الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + المنظفات 0.2% + ألبومين المصل البقري 1% + 10% مصل الحصان جسم الأولية في درجة حرارة الغرفة ح 1. على سبيل المثال، الابتدائي أجسام مضادة ضد Cx43 (1: 100)، ساركوميريك α-أكتينين (1: 100)، 4-غاتا (01:50)، MEF2 (01:25)، و SERCA2 (01:50).
- أغسل x 3 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- احتضان الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + جسم الثانوية في درجة حرارة الغرفة في الظلام ح 1.
ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع فلوروفوريس مختلفة واستخدمت عامل كونتيرستينينج. - أغسل لهم x 3 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 5 دقائق.
- احتضان الخلايا مع 100 ميليلتر النووية تلطيخ (0.1 ميكروغرام/مل) في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة.
- أغسل لهم x 3 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 5 دقائق.
- تخزين العينات في 3 مل من برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.1% في 4 درجات مئوية حتى اقتناء.
ملاحظة: اقتناء مجهر الممكن على مجاهر الفلورسنت و [كنفوكل] المقلوب مع أهداف المسافة الطويلة في العمل لأن سمك بناء حوالي 0.5 ملم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرقم 2 يمثل المخطط العام اتباعها لتنشيط الخلية. بإيجاز، خلايا المصنف في بناء PDMS وتعرضوا لتحفيز الكهروميكانيكية، مع تغيير وسائل الإعلام يؤديها مرتين في أسبوع. واستخدمت كعنصر تحكم الخلايا نونستيمولاتيد للتكييف الكهروميكانيكية. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا إضافة عنصر إضافي إلى التجربة، واستخدمت أتدبكس تحت الجلد كعنصر تحكم للقلب أتدبكس. أتدبكس تحت الجلد يتم الحصول عليها من الأنسجة الدهنية تحت الجلد، اتباع نفس الإجراءات العزلة والثقافة أما بالنسبة للقلب أتدبكس33. الخلايا المرتبطة ببناء PDMS يدل النمط الظاهري مغزلي نموذجية قبل وبعد التحفيز. وعلاوة على ذلك، محاذاة الخلايا وفقا للسطح منقوشة، وفي هذه الحالة اتباع نمط عمودي.
كانت أول مرة الأمثل التحفيز الكهربائية والميكانيكية على حدة. أولاً، اليكتروستيموليشن استند إلى دراسة سابقة في أحادية الطور الحالي بالتناوب 2 مللي ثانية التي تم العثور على نبضات موجه مربع mV 50/سم في 1 هرتز أفضل للقلب أتدبكس10. أبلغنا أن التحفيز الكهربائي زاد التعبير عن علامات القلب المبكر في القلب أتدبكس، مثل MEF2A (ف = 0.050) و 4 غاتا (P = 0.031)، ولكن لم يلاحظ أي آثار على الجينات الهيكلية وتناول الكالسيوم (البيانات لا تظهر) .
ثانيا، البروتوكول ميتشانوستيموليشن تتألف من تمتد 10% والموجي المنحرف 1 هرتز مع دورة عمل 50 في المائة، مع ارتفاع 100 مللي ثانية وأوقات الخريف لتقليد الضغط دورة في القلب، كما هو موضح بالكامل قبل21. أتدبكس القلب ميكانيكيا حفز زيادة التعبير عن الجينات الهيكلية، مثل α-أكتينين (P = 0.001) أو كتني (ف = 0.044)، وأظهرت اتجاها متزايداً لعلامات القلب المبكرة، غاتا-4 (ف = 0.068) وتي--مربع عامل النسخ 5 (Tbx5؛ P = 0.065) (البيانات لا تظهر). كانت آثار المستمدة من التحفيز الميكانيكية تعتمد بقوة على السطح منقوشة.
وبعد ذلك، تم الجمع بين كلا البروتوكولين كفاءة التحفيز الكهروميكانيكية من أتدبكس القلب، تشبه سد البطين بالدم. يتألف البروتوكول الناتج البقول موجه مربعة أحادية الطور الحالي بالتناوب 2 مللي ثانية mV 50/سم في 1 هرتز و 10% تمتد لمدة 7 أيام30. إجمالاً، تعزيز حفز اليكتروميتشانيكالي القلب أتدبكس بهم كارديوميوجينيك المحتملة. أتدبكس القلب حفز زيادة المبكرة والمتأخرة الجينات القلب (الشكل 3أ)، إلا وهي أن عامل النسخ القلب غاتا-4 (P = 0.050)، سلسلة β-الميوسين ماركر الهيكلية الثقيلة (β-MHC؛ P = 0.000)، والجينات المتعلقة بالكالسيوم Cx43 (P = 0.025). كما ترجمت التحويرات الجينية الناتجة عن تحفيز الكهروميكانيكية في مستوى البروتين (الشكل 3ب-م). فالويدين تلطيخ ضد ألياف الأكتين أظهرت أن غالبية الخلايا الانحياز وفقا للنمط الرأسي، وأن التوزيع Cx43 كان معظمها في السيتوبلازم وفي غشاء البلازما، للمساهمة في الاتصالات بين الخلايا من خلال فجوة الوصلات (الشكل 3ب-E). MEF2 وعوامل النسخ غاتا-4 كانت موجودة في النوى في القلب أتدبكس؛ ومع ذلك، لم يتم الكشف عن غاتا-4 في أتدبكس تحت الجلد (الشكل 3وم). هيولى علامات SERCA2 وساركوميريك α-أكتينين لم تظهر مؤسسة ناضجة ساركومير نموذجية كارديوميوسيتيس، والضرب لم يلاحظ في السيطرة وحفز السكان الخلية (الشكل 3وم).
الشكل 2 : الكهروميكانيكية التحفيز الداخلي، وحدة، واجهة المستخدم- (أ) تحفيز الكهروميكانيكية المخطط مع الصور التمثيلية للخلايا نونستيمولاتيد في اليوم 0 وحفز الخلايا في اليوم السابع، سواء في بنيات مع نمط السطح الرأسي. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر-(ب) حفز الكهروميكانيكية وحدة: المصنف بناء واقطاب مغناطيس ثابت الجوال PDMS. (ج) مراقبة تطبيق الفريق لتحفيز الميكانيكية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تعبير الجينات والبروتين من علامات القلب الرئيسية بعد تنشيط الكهروميكانيكية أتدبكس القلب وتحت الجلد. (أ) Real-time PCR جينات القلب الرئيسي في أتدبكس القلب وتحت الجلد. التعبير النسبي علامات كارديوميوجينيك في حفز مقابل يتم إظهار عناصر التحكم نونكونديتيونيد أتدبكس القلب وتحت الجلد. قيم تم تطبيع نازعة جليسيرالديهيدي-3-الفوسفات في التعبير وتظهر بشكل يعني ± ووزارة شؤون المرأة للتجارب المستقلة الستة. ف < 0.05 (الأهمية). (ب - م) تعبير البروتين في أتدبكس القلب وتحت الجلد على تعبير سطحية منقوشة عمودي من علامات القلب الرئيسي للتحكم وحفز الخلايا. فالويدين تلطيخ (أكتينف؛ الأحمر) والتعبير Cx43 (الأخضر)، SERCA2 (أحمر)، MEF2 (الأخضر)، ساركوميريك α-أكتينين (أحمر)، والتعبير غاتا-4 (الأخضر) في عنصر التحكم (في لوحات ب، د، و، ح، ي، و L ) وتحفز (في لوحات ج ه، ز، أنا، Kو M) القلب (يسار) وأتدبكس (يمين) تحت الجلد. كانت كونتيرستينيد نوى مع DAPI (الأزرق؛ ولوحات ب - هو Lو M). أشرطة مقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من Llucià-فالديبيراس et al.30. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التحفيز للمقاولات، على ما يبدو، بديلاً أمنا لإعداد الخلايا لبيئة معادية القلب وتعزيز التزامهم بالقلب. هنا، ذكرت بروتوكول وصف خلايا القلب السلف زيادة التعبير عن علامات القلب الرئيسي وهو أن تكون مفيدة لما زرع القادم في عضلة القلب مورين إينفاركتيد30. بشكل عام، أتدبكس القلب اليكتروميتشانيكالي حفز زيادة التعبير عن الجينات ذات الصلة في وقت مبكر، والهيكلية، وتنظيم الكالسيوم، التي لم تحقق مع التحفيز الكهربائية أو الميكانيكية السابقة على حدة. في الواقع، حفزت اليكتروميتشانيكالي القلب أتدبكس إظهار صورة أكثر اكتمالا ويبدو أكثر التزاما بنسب القلب مما سبق الإبلاغ عنه.
وكان التضمين التعبير الجيني القلب في كل أنواع الخلايا بعد التحفيز الكهروميكانيكية، خاصة بعد الزيادة الملحوظة للقلب أتدبكس أتدبكس تحت الجلد بالمقارنة. قد يكون هذا النتيجة نتيجة لمنشأ الأنسجة الدهنية المستخدمة لعزل الخلية، إلا وهي الدهون تحت الجلد أو ابيكارديال، على التوالي. Epicardial الأنسجة الدهنية المحيطة بالقلب وتامور هو جهاز أيضي نشطة ومصدرا لخلايا السلف. للفائدة، قد الدهون epicardial استمرارية التشريحية والوظيفية مع عضلة القلب. في ظل الظروف العادية، قد الدهون epicardial الخصائص البيوكيميائية وحرارة كارديوبروتيكتيفي؛ على العكس من ذلك، في ظل الظروف المرضية، تفرز السيتوكينات proinflammatory تؤثر على قلب39. في الواقع، يكون النمط الظاهري مثل القلب الأصيل أتدبكس القلب ويحمل تعبير المكونة من علامات القلب، مثل α-أكتينين ساركوميريك، SERCA2، Cx43 وغاتا-4، بالمقارنة مع أتدبكس تحت الجلد، غير أن تتكيف القلب 34من البيئة. وهكذا، قد تكون آثار المستمدة من التحفيز للمقاولات أكبر لخلايا القلب السلف، التي مكانة قريبة من أو داخل الوسط احتشاء عضلة القلب.
من ملاحظة أخيرة في الجينات التي التحوير يعتمد بشدة على سكان الخلية، ينصح بروتوكول الأمثل لكل سكان الخلية، وقيم تقريبية يمكن أن تستخلص من تلك الموصوفة في هذا البروتوكول. الخطوات الأكثر أهمية في تحفيز الكهروميكانيكية الخلية خلية نظم الحجز والتحفيز (الشدة، المدة، التردد).
على سبيل المثال، المعلمات الكهربائية الحاسمة. في الواقع، شدة المجال الكهربائي المطبق كان الأمثل لخلية نونيليكتريك، وبالتالي زيادة القيم سيكون أكثر ملاءمة للخلايا ذات النشاط الكهربائي، مثل cardiomyocytes المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent غير ناضجة40،41 . أثبتت التجارب الأولية للقلب أتدبك اليكتروستيموليشن أن تيار مباشر وجهد العالي الناجم عن توقيف نمو الخلية والخلية وفاة10. من هذه النتائج، اعتمدت البروتوكولات الحالية بالتناوب والجهد المنخفض لمزيد من التجريب.
بالإضافة إلى ذلك، يقدم بعض الأنساب خلية ارتباط منخفضة على سطح PDMS، حيث يقترح طلاء أو علاج بلازما لإثراء الكفاءة بذر42. وعلاوة على ذلك، ينبغي تكييف البذر خلية لكل حجم الخلية والنمو، وانخفاض قيم الخلايا عالية التكاثري أو زيادتها لخلايا أصغر؛ وبالتالي، يوصي ببعض المحاكمات البذر كثافات عديدة في بناء PDMS. وأخيراً، تم تنفيذ البروتوكول على أحادي الطبقة خلية، وقد تكون قيم مختلفة قليلاً لسيناريو ثلاثي الأبعاد (أي، كثافة الخلية).
وعلاوة على ذلك، نمط السطح دوراً رئيسيا في تدريب خلية الميكانيكية. وقد تبين أن الخلايا الانحياز وفقا لهذا النمط، وأدائها بعد التحفيز الميكانيكية ليست هي نفسها بين الأسطح المختلفة. على سبيل المثال، حفزت ميكانيكيا القلب أتدبكس المصنف على سطوح منقوشة عمودي (عمودي للقوة تمتد) يفرز البروتينات المرتبطة باحتشاء عضلة القلب والمصفوفة خارج الخلية إعادة عرض زخارف. ميتشانوستيمولاتيد القلب أتدبكس المصنف على السطوح نونباتيرنيد يفرز البروتينات المرتبطة بتجديد القلب21.
وقد وصف السمات الرئيسية لهذا الأسلوب أعلاه. ومع ذلك، من المهم تسليط الضوء على نهج موسع للخلية تمتد كأحد أساليب فريدة من نوعها لتحقيق هذه الميزات. من الاهتمام، نظراً لأن الجهاز نفسه يمكن تقديم المحفزات الكهربائية و/أو الميكانيكية، الممكن مقارنة مباشرة من الآثار الناجمة من التحفيز المختلفة والخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، تصور الخلايا المصنفة في البناء، بفضل الشفافية وركاكة، ميزة واضحة لتقييم حالة الخلية قبل وأثناء وبعد التحفيز.
الجهاز والبروتوكول لديها بعض القيود، بعضها بالفعل ولاحظ. أولاً، كان تصميم والأمثل لثقافة خلية أحادي الطبقة وليس لثقافة خلية ثلاثية الأبعاد. على وجه التحديد، يمكن استخدام الخلايا ملتصقة فقط في الإعداد أحادي الطبقة. للخلايا نوناديرينت، ينبغي أن تنفذ نهجاً ثلاثي الأبعاد. وثانيا، يحد حجم بنية السطح البذر؛ وهكذا، عدد الخلايا تحفز صغيرة، وكل مجموعة تجريبية يتطلب replicates عدة جمع عينات كافية لمزيد من التحليلات الجين أو البروتين. رفع مستوى إلزامي للتجارب الحيوانية الكبيرة أو الترجمة السريرية، التي أعلى الخلية جرعات المطلوبة؛ وفي مثل هذه الحالات، يمكن اعتبار أكبر تحفيز السطوح.
وتشمل التطبيقات الرئيسية لهذا البروتوكول تكييف الخلية، والنمذجة المرض، وفحص المخدرات. ويعزز هذا التحفيز نضوج الخلية، وتطبيقه سيكون مفيداً لتحقيق والحفاظ النمط الظاهري أكثر نضجاً. من ناحية، الخلايا التي تحاكي النمط الظاهري الوظيفية الحالية في عضلة القلب الكبار حاسمة بالنسبة للمرض النمذجة والتجريب الجهاز على رقاقة. وفي الواقع، لا يمكن أن تمثل خزعات البشرية تطور المرض لأنها عادة ما تكون عينات نهاية مرحلة أو بعد الوفاة، بينما لا دائماً الخص نماذج حيوانية فيزيولوجيا الإنسان والأعراض. ومع ذلك، برز استخدام الخلايا الجذعية pluripotent الاصطناعية كأسلوب نمذجة بديلة لكشف الآلية الكامنة وراء أمراض التنمية43. وبالإضافة إلى ذلك، هي أجهزة على شريحة مصغرة الأنسجة والأعضاء التي نمت في المختبر تسمح بوضع نماذج لفسيولوجيا الإنسان (مرضية) وتقليد هياكل ثلاثية الأبعاد. الهدف منها هو إنشاء وحدة وظيفية دنيا يمكن أن الخص بعض جوانب علم وظائف الأعضاء البشرية والأمراض بطريقة واضحة وخاضعة للمراقبة والتصدي لقيود الخلية الموجودة ونماذج حيوانية44.
من ناحية أخرى، يتطلب فحص المخدرات منصات الثقافة التي تحاكي البيئة الفيزيائية الحالية أنان فيفو في الفائق، نظام المنمنمة لاختبار سلامة وفعالية العقاقير عن طريق الاستجابة كارديوميوسيتي. يمكن استخدام خلايا ناضجة للخص قراءات ذات صلة سريرياً (أنا. هاء، وحركية الهوس) مقايسة الفائق، لتوضيح آليات المرض وتحديد رواية العلاجي يستهدف45.
ميدان القلب نطاق هذا البروتوكول الرئيسي، إلا أنه يمكن بسهولة أن تتكيف مع نطاقات الخلايا العصبية أو الهيكل العظمى لأن هذه البيئات تتسم بالمحفزات الكهربائية والميكانيكية. أشارت الدراسات السابقة مع التحفيز المادي إلى نتائج مفيدة46،47،48،،من4950.
وفي الختام، لقد وصف بروتوكول جديد للتكييف الكهروميكانيكية متزامن من أتدبكس القلب. بروتوكول الناتجة والجهاز تم على نطاق واسع اختبارها والتحقق من صحتها للمحفزات الفردية ومتزامنة. تكييف الكهروميكانيكية متزامن من أتدبكس يعزز بهم كارديوميوجينيك المحتملة، وتبرز بوصفها استراتيجية واعدة لعلاج الخلايا والنمذجة المرض وفحص المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة الكشف عنها، إلا أن جهاز التحفيز والبروتوكول كانت سابقا براءة اختراع (WO-2013185818-A1، WO-2017125159-A1).
Acknowledgments
الكتاب أريد أن أشكر أعضاء "برنامج البحوث إيكريك" (إيجتب، بادالونا) الإلكتروني ومجموعة الأجهزة الطبية الحيوية (اتحاد الوطنيين الكونغوليين، برشلونة)، خاصة الأستاذ J. روسيل فيرير. وبالإضافة إلى ذلك، تقر الكتاب مجلة "الطب متعدية" الخلايا الجذعية والصحافة الفاميد للسماح بتكييف الأرقام المنشورة سابقا (Llucià-فالديبيراس, et al. 30)-تطوير هذا النموذج وتصميم البروتوكول كانت تدعمها وزارة التعليم ص العلوم (القوات المسلحة السودانية 2008-05144)، وزارة الاقتصاد دي y كومبيتيتيفيداد (القوات المسلحة السودانية 2014-59892)، "المفوضية الأوروبية" (البرنامج الإطاري السابع ريكاتابي، NMP3-SL-2009-229239)، المؤسسات La Marató de TV3 (080330، 201516، 201502)، ومؤسسة الفقرة la Innovación y la بروسبيكتيفا en السعود في إسبانيا (فيبسي؛ 06-00001396-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2x | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
References
- McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
- Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
- Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
- Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
- Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
- Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
- Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
- Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93 (2014).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
- Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
- Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
- Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
- Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499 (2018).
- Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
- Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
- Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
- Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
- Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
- Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
- Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
- Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895 (2018).
- Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
- Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
- Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. Rosell Ferrer, F. X., Sánchez Terrones, B., Bragós Bardia, R., Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A. , Barcelano, Spain. WO/2013/185818 (2013).
- Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A., Soler Botija, C., Bragós Bardia, R., Rosell Ferrer, F. X. , Barceleno, Spain. WO/2017/125159 (2017).
- Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
- Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
- Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
- Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
- Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
- Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
- Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
