Summary
Здесь мы представляем протокол для подготовки популяции клеток с помощью электрических и механических раздражителей, подражая физиологии сердца. Это электромеханический стимуляции усиливает потенциал cardiomyogenic лечение клеток и является перспективной стратегией для дальнейшего клеточной терапии, моделирование болезней и наркотиков скрининг.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти в развитых странах. Следовательно спрос на эффективные сердечно клеточной терапии побудило исследователей в области стволовых клеток и биоинженерии для разработки в vitro высокой верности человека миокарда для фундаментальных исследований и клинического применения. Однако незрелых фенотип сердечной клетки является ограничение на получение тканей, которые функционально имитировать взрослых миокарда, который характеризуется главным образом механических и электрических сигналов. Таким образом целью настоящего Протокола является подготовить и зрелые целевой популяции клеток через электромеханический стимуляции, изложив физиологических параметров. Инженерии сердечной ткани эволюционирует в сторону более биологические подходы и стратегии, основанные на биофизические раздражители, таким образом, набирают силу. Устройство, разработанной для этой цели является уникальной и позволяет индивидуальных или одновременное электрических и механических стимуляции, тщательно характеризуется и проверены. Кроме того хотя методология была оптимизирована для этот стимулятор и населением в определенную ячейку, она может быть легко адаптирована к другим устройствам и клеточных линий. Результаты здесь предлагают доказательства увеличение сердца приверженности популяции клеток после электромеханические стимуляции. Электрои-механическ стимулируется клетки показывают увеличение выражение основных сердца маркеров, в том числе ранних, структурных и кальция регулирующие генов. Это кондиционирование ячейки может быть полезной для дальнейшего восстановительной клеточной терапии, моделирование болезней и наркотиков высокопроизводительного скрининга.
Introduction
Сердце функция основана на сцепное устройство электрического возбуждения и механическое сокращение. Вкратце cardiomyocyte межклеточные соединения позволяют распространение электрического сигнала производить почти синхронного сокращений сердца что качать кровь, системно и через систему дыхания. Сердечной клетки, таким образом, проходят электрических и механических сил, которые регулируют выражение и клеточной функции гена. Соответственно многие группы пытаются развивать культуру платформы, которые имитируют сердца физиологической среды чтобы понять роль механической и электрической стимуляции сердечной развития, функции и созревания. Электрические и механические раздражения в vitro индивидуально применялись широко в инженерии сердечной ткани повышения функциональных свойств, увеличить созревания клеток или улучшить Связывание ячеек и кальция, обработка1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Тем не менее, синхронные электромеханические принадлежности остается неиспользованными из-за задача разработки стимулятор и протокол и обязательная оптимизация22.
Предварительные работы рассмотрены электромеханические стимуляции, как сочетание электрической стимуляции и перфузии СМИ; Однако поток не связаны на основе штамма деформации, типичных для наполнения желудочков23,24,25. Позже более физиологических подходов Комбинированные электрические стимулы с физической деформации или стрейч, чтобы имитировать isovolumetric сокращения26,27,28,29,30 ,31. Фэн et al. описал первой демонстрации электромеханических стимуляции в 2005 году, отчетности, повысить размер и сократительных свойств cardiomyocyte26. Ван et al., предварительно обработанных мезенхимальных стволовых клеток с 5-azacytidine и применяется синхронный электрические и механические принадлежности, улучшение recellularization, жизнеспособность клеток, сердечной дифференциации и тканей ремоделирования27. После этих публикаций, более групп сообщили на электромеханические стимуляции клеток монослои или инженерии тканей (например, черный28, Vunjak-Новакович29,31и наша группа30) с Первые клетки кондиционером протестированы в естественных условиях30. Вкратце Морган и черный испытаны несколько комбинаций электрических и механических раздражителей, отчетности, что сроки между стимуляцию имеет решающее значение, поскольку задержки комбинированных электромеханические стимуляции принесли лучшие результаты28. Далее Godier-Furnémont и коллаборационистов оптимизированный протокол электромеханические стимуляции для инженерии сердца мышца конструкций из клеток сердца новорожденных крыс и достигнута в первый раз, положительная сила частота отношения29. Потом наша группа сообщила, что электрои-механическ оговоренную клетки увеличилось выражение основных сердца маркеров в пробирке и широкой полезных эффектов в естественных условиях, таких как улучшение сердечной функции или увеличение плотности судна при инфаркте границы региона30. Самые последние публикации продемонстрировал, что сердечных тканей из стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов подвергнут электромеханические принадлежности, достигли созревания уровня ближе к человека взрослых сердечной структуры и функции31. Кроме того альтернативные трехмерной стимуляции платформы составляют Электроактивные леса, которые обеспечивают электрические, механические и топографические подсказки для ячейки придает32. Кроме того механические деформации (клетки однослойная растяжения и сжатия) может также быть наведено с растягивающийся электроды подражая нормальных физиологических условиях, а также экстремальных условиях33.
Таким образом объясняется тем, что в пробирке электромеханические стимулы, основанные на физиологических условиях может повысить потенциал cardiomyogenic клетки. Действительно Эта стимуляция может пользу дальнейшей интеграции терапевтических клеток в миокарде в клинической ситуации или увеличить созревания тканей для наркотиков скрининг приложений.
Кроме того, мы изолированы и характеризуется население человека жировой ткани производные прародитель клеток сердечной происхождения (сердечной ATDPCs)34. Эти клетки расположены в жировой эпикардиальной. Эти клетки отображать выгодно функциональные и гистопатологические эффекты лечения инфаркта миокарда, а также поддерживать сердечной и эндотелиальной дифференцировки потенциал. 30 , 35. Мы предположили, что эти преимущества возрастет после биофизических стимуляции.
Следовательно мы разработали устройство и режима стимуляции для популяции клеток интерес и исследованы эффекты. Этот электромеханические протокол является новой стратегии, чтобы заставить активной ячейки, растяжения образом стерильные и неинвазивно по сравнению с предыдущей публикации36, в сочетании с электрическим полем стимуляции. Техника, сообщили здесь подробно объясняет устройство и метод, используемый для электрических, механических и электромеханических стимуляции клеток.
Это устройство может обеспечить электрической и механической стимуляции, независимо или одновременно. Стимулирование осуществляется с неинвазивной и асептических новаторский подход, который включает в себя поддержку presterilized клеток, электродов, расположенных внутри стандартного культуры пластины и платформа, которая побуждает механических и электрических сил (рис. 1).
Платформа может вместить до шести культуры пластин и состоит из сэндвичевой конструкции poly(methyl methacrylate) лазерного надреза и печатных плат. Прототип платформы опирается на сочетание монофазные программируемые компьютерным управлением Электростимуляторы, печатная плата для надежного подключения электродов, и шесть 10 мм х 10 мм x 5 мм из никелированной неодим Исправлена магниты помещены возле одной стороне плиты культуры. Есть также бар алюминия с шестью вождения магнитами (же модель) перед другой стороне плиты культуры и переехала с линейной серводвигателя. Двигатель управляется контроллер двигателя, выполняемых через порт RS-232 коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Через интерфейс пользователя и программируемые стимулятор можно запрограммировать интенсивность электрического, длительность импульса и частота, частота механической стимуляции, его Скважность импульсов, количество импульсов, амплитуда импульса (экскурсия на магнит), и наклон.
Рисунок 1 : Электромеханические стимулятор. (A) PDMS конструкция, используемая для кондиционирования ячейки. (B) рисунок PDMS конструкции, в том числе электродов и магниты. (C) деталь печатной платы (платформа) используется для выполнения электромеханические принадлежности. Эта группа была изменена с Llucià-Valldeperas et al.30. (D) картина электромеханические стимуляции и пользовательский интерфейс (компьютер). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Стимулятор и метод для электромеханических кондиционирования полностью описаны в двух международных патентов, WO-2013185818-А137 и38WO-2017125159-А1.
Биосовместимых силикона, конструкции, призванных обеспечить структурную поддержку для клетки, электроды и магниты были описаны ранее10,21. Вкратце они состоят из полидиметилсилоксан (PDMS), формованных и вылечить при комнатной температуре, с Юнга 1,3 МПа, рядом физиологических уровнях. Конструкция содержит пул культуры клеток в зоне гибкие (10 x 10 x 2 мм), два внутренних поперечных слотов провести электродов и два встроенных 6 мм х 2 мм x 4 мм никелированные неодимовые магниты. Электроды строятся с 0,2 мм Платиновая Проволока витая вокруг 2 мм x 3 мм x 12 мм из политетрафторэтилена (ПТФЭ) основные бар (21 см за электродом, примерно 23 повороты) и размещены на противоположных сторонах области гибкой для создания электрического поля для стимулирования Электрическая стимуляция. Механического растяжения достигается за счет магнитного притяжения между магнитами, встроенные в поддержку и внешние магниты помещены рядом с пластину культуры и на движущихся алюминия руку. Таким образом поддержка клеток может быть продлен без нарушения стерильного барьера. Этот подход подходит для монослое клеток, но могут быть адаптированы к трехмерной конструкции, а также.
Кроме того шаблон регулярного могут быть отпечатаны, где клетки являются семенами, используя правит дифракционной решетки (1250 канавки/мм). Из-за своей прозрачности и толщиной 0,5 мм возможна прямая визуализация клетки культивировали на PDMS конструкции под brightfield и люминесцентные микроскопы. В данном случае бассейн PDMS культура имеет вертикальные поверхности шаблон, перпендикулярно растяжения силы, чтобы выровнять клетки перпендикулярно к электрического поля, которая уменьшает электрическое поле градиента через ячейку.
Рисунок 1 показывает подробное описание конструкции и устройства, используемые для стимуляции. Построить PDMS и характеристики оптимизированы для ячейки, растяжения (рис. 1A, B). Стимулятор разработан и апробирован для эффективного применения желаемого электрической и механической стимуляции клеток, придает конструкции PDMS. Этот процесс включает в себя обеспечение хорошего соединения и пользователя работоспособность через программный интерфейс (рис. 1 c, D).
Процедура стимуляции клеток, используя этот заказ устройства описан в разделе протокол.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование использует человеческого сердца ATDPCs от пациентов образцов. Их использования был одобрен местной этике, и все пациенты дал согласие. Протокол исследования соответствует принципам, изложенным в Хельсинкской декларации.
1. Подготовка
- Автоклав два пинцет, 12 платиновыми электродами PTFE для электростимуляции и некоторые бумажные полотенца, на 121 ° C в течение 20 мин.
-
Стерилизуйте 12 PDMS на заказ конструкции (рис. 1A).
- Мыть каждый конструкция с 5 мл стерильной, дистиллированной воды с магнитной агитации при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Вымойте 1 x с 5 мл 70% этанола с магнитной агитации при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Вымойте 5 x с 5 мл стерильной, дистиллированной воды с магнитной агитации при комнатной температуре 10 мин в мыть, для удаления остатков алкогольных.
- Сухие конструкции на стерильную бумажные полотенца внутри потока кабинета на ночь.
- Храните их в стерильных 50 мл пробирок до использования.
2. ячейки, посев (день -1)
- До заполнения ячейки передачи очищены PDMS конструкции для стерильных пластин и подвергать их ультрафиолетового света за 5 мин для обеспечения полной стерилизации.
- Передачи каждой конструкции плиты культуры клеток 35 мм, или 6-ну плита, для немедленного клеток посева.
-
Trypsinize вырожденная T75 настой сердечной ATDPCs.
- Вымойте T75 флакон с 5 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
- Добавить 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировать при 37 ° C за 5 мин до отсоединения клетки.
- Добавьте 5 мл полного среднего для инактивации трипсина ЭДТА.
- Собрать все клетки в 15 мл трубки и мытья Склянка 2 x с 5 мл PBS собирать любые оставшиеся ячейки.
- Центрифуга на 230 x g 5 мин при 22 ° C, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 2 мл полного среднего считать их с камеры Горяева.
- Семян 200 мкл сердечной ATDPCs (2,5 x 105 клеток/мл) в ячейку бассейн 12 PDMS конструкции (рис. 1A, B) иметь ~ 80% заполнения поверхности покрыты клетками на следующий день после и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2.
Примечание: После 2-4 ч клетки должны быть прикреплены. Посевным материалом клетки готовится согласно размер ячейки и роста. Для небольших ячеек следует увеличить плотность посева. - Аккуратно добавьте 2 мл подогретую полной среды (α-MEM дополнена 10% плода bovine сыворотки, 1% L-глютамина и 1% пенициллин стрептомицином) на пластину.
- Инкубируйте конструкций в условиях культуры (обычно 37 ° C и 5% CO2) на ночь.
3. Электромеханические стимуляции установки (день 0)
- Перед началом процедуры, принимать шесть конструкции для электромеханических стимуляции и шесть как nonstimulated элементов управления. С менее чем шести пластин в стимуляции используйте пустые конструкции с такой же средний объем для обеспечения надлежащего электрического поля стимуляции.
- Очищайте стимуляции блок 70% этанола и поместите его в потоке кабинета.
- Принесите стерильных электродов и пинцет внутри шкафа потока.
- Удаление 90% средств массовой информации от культуры пластины легко манипулировать электродов и конструкций. Во-первых место PDMS конструкции в правильном положении для обеспечения магнитного притяжения (PDMS перемещения в пределах культуры пластины к магнит) между фиксированной и мобильной магнитов. Затем подключите провод платины к разъемам электрода и часть PTFE в его место в конструкции PDMS.
- Добавьте 2.5 мл свежего подогретую полного среднего для каждой конструкции.
Примечание: Поддерживать стерильность во всей процедуре и работают на одну конструкцию одновременно. Остальная часть конструкции в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 поддерживать до использования. - После того, как все конструкции PDMS размещаются и электрически соединено с платформы, верните платформы в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
- Подключите источник электрические и механические.
-
Настройте программу стимуляции. Указание режимов электрической и механической стимуляции через интерфейсы пользователя Электростимуляторы и приложение, которое управляет механической стимуляции. Установите одновременность следующим образом.
- Включите электрический стимулятор. Ждать для главного меню появится на дисплее.
- Затем выберите вариант 2: изменить последовательность + Enter.
- Измените последовательность меню следующим образом.
- Используйте вкладку режим для выбора напряжения или тока. Выберите текущий, нажав + и нажмите клавишу Enter.
- Для амплитуды вкладки выберите 1 (mA) с + / и нажмите клавишу Enter.
- Период (T)выберите 1000 (МС) с + / и нажмите клавишу Enter.
- Установить 2 (МС) с + /- Длительность импульса (Tw) и нажмите клавишу Enter.
- На вкладке триггер режим выберите внешнее программное обеспечение и нажмите Enter.
- Вернуться в главное меню, выберите вариант 4: Создание последовательности и нажмите клавишу Enter.
Примечание: Электростимуляторы лежит в режиме ожидания до тех пор, пока он получает команду Триггер от механических стимулятор приложения через последовательный порт.
- Выполните следующие действия в разделе механической стимуляции приложения панели управления (рис. 2C).
- Напишите 1,000 (МС) в элементе управления текст Период импульса .
- Напишите 500 (МС) в элементе управления текст на время (Tw) чтобы задать длительность механических импульса.
- Запись 2000 (АС) в элементе управления текст экскурсии для доставки удлинение конструкции 10%. Это количество шагов в линейной серводвигателя.
Примечание: Стимуляция протокол применяется здесь состоит из переменного тока 2 мс монофазные площади волны импульсов 50 МВ/см на 1 Гц и 10% растяжения для 7 дней. Взлет и падение раз механических импульсов устанавливаются на 100 мс, примерно имитировать форму импульса давления очага. Кроме того режим повторения непрерывный и есть счетчик показано количество импульсов.
- Включите электрический стимулятор. Ждать для главного меню появится на дисплее.
- Измените СМИ 2 x в неделю (понедельник и четверг во второй половине дня). Во-первых удалите старые средства массовой информации; Затем добавьте теплой СМИ по бокам PDMS поддержки, никогда не непосредственно на клетки бассейн.
Примечание: Если клетки имеют высокие темпы роста, средства массовой информации должны быть изменены 3 раз в неделю (например, понедельник, среду и пятницу). Необходимо отключить и снова подключите все кабели, но нет необходимости удалить культуры пластин и электродов из их места. - Сбор образцов после выполнения экспериментов.
4. образец коллекции в конце экспериментов (7 в день)
-
Для анализа РНК
- Вымойте конструкцию 2 x 3 мл ПБС втечение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавить 3 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в каждой пластинке, (достаточно, чтобы покрыть всю конструкцию) и подождать 5 мин при 37 ° C.
- После того, как отдельные клетки, добавьте 2 мл полного среднего для инактивации трипсина ЭДТА.
- Собрать все клетки в 15 мл трубки и мыть конструкцию 2 x 3 мл PBS собирать любые оставшиеся ячейки.
- Центрифуга на 230 x g 5 минут при температуре 22 ° C.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл ФСБ.
- Передать решение ячейки 1,5 мл трубки и центрифуги на 230 x g за 5 мин.
- Удалить супернатант и хранить Пелле-80 ° c 700 мкл Реагента лизиса для дальнейшей изоляции РНК.
- Изолируйте РНК с помощью коммерческих комплект, следуя инструкциям производителя.
- Реверс транскрибируйте изолированных РНК с помощью комплекта и случайных hexamers, по словам производителя протокол.
- Для малых РНК концентрации preamplify и, затем, разбавления 1:5 бесплатно РНКазы водой перед выполнением последующих реального времени обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продолжить с стандартным протоколом для ПЦР в реальном времени и проверьте основные сердечная маркеров.
Примечание: Типичной сердечной маркеры включают ранний и поздний маркеры из разных категорий, таких как сердечная транскрипционных факторов (усилитель myocyte конкретного фактора 2A [MEF2A], Гата связывающий белок 4 [Гата-4]) и структурных (сердечной тропонин я [cTnI], сердца тропонина T [cTnT], α-актинина) и регулирование кальция (Connexin43 [Cx43], Сарко-/ эндоплазматического ретикулума Ca2 +-АТФ-азы [SERCA2])30. Белка изоляции может также выполняться при необходимости. Одновременная РНК и белков изоляции могут быть выполнены с той же пробы, использование коммерчески доступных реагентов и комплекты (Таблица материалов), если образец меньше.
-
Для immunostainings
Примечание: Это выполняется непосредственно на клетки, присоединенного к пулу клетки PDMS конструкции. Поэтому мы рекомендуем размещение, каждый раз, когда крышка 1 см x 1 см парафина фильм на верхней части клетки бассейн, помимо пластину, чтобы свести к минимуму испарения инкубации решений.- Вымойте конструкцию 2 x 3 мл PBS для 5 мин при комнатной температуре.
- Исправьте клеток, придает конструкции с 2 мл формалина 10% за 15 мин при комнатной температуре.
- Вымыть клетки 3 x 3 мл PBS для 5 мин при комнатной температуре. Для длительного хранения оставьте образцы в PBS с азидом натрия 0,1% при 4 ° C.
- Разрушения клеток с 3 мл PBS + 0,5% моющего средства (3 x, каждый раз 5-10 мин при комнатной температуре).
- Инкубируйте клетки с 100 мкл PBS + 10% лошадь сыворотка + 0,2% моющего средства + 1% бычьего сывороточного альбумина при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы блокировать неспецифических антитела связывая.
- Инкубируйте клетки с 100 мкл основное антитело при комнатной температуре в течение 1 ч, PBS + 0,2% моющего средства + альбумина bovine сыворотки 1% + 10% сыворотки крови лошади. Например, в первичных антител против Cx43 (1: 100), саркомерных α-актинина (1: 100), Гата-4 (1:50), MEF2 (1:25) и SERCA2 (1:50).
- Вымойте 3 x 3 мл PBS при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Инкубируйте клетки с 100 мкл PBS + вторичное антитело в темноте за 1 ч при комнатной температуре.
Примечание: Вторичные антитела проспряганное с различными флуорофоров и counterstaining агента были использованы. - Мыть их 3 x 3 мл PBS при комнатной температуре в темноте за 5 мин.
- Инкубируйте клетки с 100 мкл ядерного окрашивание (0,1 мкг/мл) в PBS в темноте за 15 мин при комнатной температуре.
- Мыть их 3 x 3 мл PBS при комнатной температуре в темноте за 5 мин.
- Храните образцы в 3 мл PBS с азидом натрия 0,1% при температуре 4 ° C до приобретения.
Примечание: Приобретение микроскопа возможна на Перевернутый флуоресцентные и конфокальные микроскопы с Лонг рабочих расстояние целей, потому что толщина конструкции составляет около 0,5 мм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 представляет общую схему для стимуляции клеток. Вкратце клетки были посеяны на конструкцию PDMS и подвергается электромеханические стимуляции, с изменением СМИ осуществляется два раза в неделю. Nonstimulated клетки были использованы как элемент управления для электромеханических кондиционирования. Кроме того мы добавили элемент дополнительный эксперимент, и подкожные ATDPCs были использованы в качестве элемента управления для сердечной ATDPCs. Подкожная ATDPCs получаются из подкожной жировой клетчатки, так же изоляции и культуры как сердечная ATDPCs33. Клеток, придает конструкции PDMS свидетельствует типичный веретенообразной фенотип до и после стимуляции. Кроме того клетки выровнены согласно образцу поверхности, в этом случае после вертикальным рисунком.
Электрические и механические стимуляцию впервые были оптимизированы индивидуально. Во-первых электростимуляция была основана на предыдущем исследовании, в котором монофазные переменного тока 2 мс площади волны импульсов 50 МВ/см на 1 Гц оказались лучше для сердечной ATDPCs10. Мы сообщали, увеличение электрической стимуляции выражение ранней сердечной маркеров в сердечной ATDPCs, например MEF2A (P = 0,050) и Гата-4 (P = 0,031), но не влияет на структурные и кальция обработки гены были замечены (данные не показаны) .
Во-вторых протокол mechanostimulation состоял из 10% растяжения и трапециевидного сигнала 1 Гц с рабочем цикле 50%, с ростом 100 мс и падения раз имитировать давление цикла в самом сердце, как описано в полном объеме до21. Механически стимулируется сердечной ATDPCs дополненной выражение структурных генов, например, α-актинина (P = 0,001) или cTnI (P = 0,044) и показали тенденцию к увеличению для ранней сердечной маркеры, Гата-4 (P = 0.068) и T-бокс Транскрипционный фактор 5 (Tbx5; P = 0,065) (данные не показаны). Эффекты, производный от механической стимуляции были сильно зависит от поверхности рисунком.
Позже оба протокола были объединены для эффективной электромеханические стимуляции сердечной ATDPCs, напоминающие желудочек заполнения кровью. Итоговый протокол состоит из переменного тока 2 мс Монофазные импульсы площади волны 50 МВ/см на 1 Гц и 10% растяжения для 7 дней30. В целом электрои-механическ стимулировали сердечной ATDPCs повысить их cardiomyogenic потенциала. Стимулируется сердечной ATDPCs увеличение экспрессии генов ранних и поздних сердца в (рис. 3А), а именно, сердечной транскрипционный фактор Гата-4 (P = 0,050), тяжелые цепи β-миозина структурных маркер (β-MHC; P = 0,000) и связанных с кальция гена Cx43 (P = 0,025). Джин модуляции результате электромеханические стимуляции были также переведены на уровне белка (Рисунок 3B-M). Фаллоидин пятнать против актина волокон показал, что большинство клеток выровнено по вертикальной схеме и что распределение Cx43 основном в цитоплазме и на плазматической мембране, вносить межклеточные связи через пробел узлы (рис. 3B-E). MEF2 и Гата-4 транскрипционные факторы были расположены на ядер в сердечной ATDPCs; Однако Гата-4 не был обнаружен в подкожной ATDPCs (Рисунок 3F-M). Цитоплазматических маркеров SERCA2 и саркомерных α-актинина не показывают Зрелые Саркомер Организации типичный для кардиомиоцитов, и избиения не наблюдалось в управления и стимулировали клеточных популяций (Рисунок 3F-M).
Рисунок 2 : Электромеханические стимуляции процедуры, блок и интерфейс пользователя. (A) электромеханические стимуляции схема с представителем изображения nonstimulated клеток в день 0 и стимулировал клетки в день 7, оба на конструкции с вертикальной поверхности шаблона. Масштаб баров = 100 µm. (B) электромеханические стимуляции единица: семенами PDMS конструкции, электроды и стационарных/подвижных магнитов. (C) приложения панели управления для механической стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Генов и белков выражение основных маркеров сердца после электромеханические стимуляции сердечной и подкожные ATDPCs. (A) Real-time PCR основных сердца генов в сердечной и подкожные ATDPCs. Относительное выражение cardiomyogenic маркеров в стимулированных против nonconditioned управления показано для сердца и подкожные ATDPCs. Значения были нормализованы Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа выражение и показаны как означает ± SEM для шести независимых экспериментов. P < 0,05 (значения). (B - M) Выражение протеина в сердечной и подкожные ATDPCs на узорной вертикальной поверхности выражение основных сердца маркеров для управления и стимулировал клетки. Фаллоидин окрашивание (actinF; красный) и Cx43 выражение (зеленый), SERCA2 (красный), MEF2 (зеленый), саркомерных α-актинина (красный) и выражение Гата-4 (зеленый) в элементе управления (в панели B, D, F, H, Jи L ) и стимулировали (в панели C, E, G, I, Kи M) сердечная (слева) и подкожной (справа) ATDPCs. Ядра были counterstained с DAPI (синий; панели B - E, Lи M). Масштаб баров = 50 мкм. Эта цифра была изменена с Llucià-Valldeperas et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Электромеханические стимуляции, как представляется, является безопасной альтернативой для подготовки клетки сердечной обстановке враждебности и повышения их сердца обязательство. Здесь протокол, описанный для сердца прогениторных клеток выражение основных сердца маркеров и составила сообщил полезными для их следующего имплантации infarcted мышиных миокарда30. В общем электрои-механическ стимулировали сердечной ATDPCs увеличилось на выражение генов, связанных с рано, структурных и регулирования кальция, который никогда не был достигнут с предыдущим электрической или механической стимуляции индивидуально. В самом деле электрои-механическ стимулировали сердечной ATDPCs Показать более полный профиль и представляется более привержены линии сердца, чем сообщалось ранее.
Выражение сердца гена был модулированный в обоих типах клеток после электромеханические стимуляции, особенно после заметное усиление сердечной ATDPCs, по сравнению с подкожной ATDPCs. Этот результат был следствием происхождения жировой ткани, используемые для изоляции клеток, а именно, эпикардиальной или подкожного жира, соответственно. Эпикардиальной жировой ткани вокруг сердца и перикарда является метаболически активные органа и источник прогениторных клеток. Интерес эпикардиальной жир имеет анатомической и функциональной непрерывности с сердечной мышцы. При нормальных обстоятельствах эпикардиальной жир имеет биохимических и термогенный кардиопротекторное свойства; и наоборот в патологических условиях, он может секретировать провоспалительных цитокинов влияют на сердце39. Действительно сердечной ATDPCs имеют присущих фенотипу сердца как и выставку учредительный выражения сердечной маркеров, такие как Cx43, саркомерных α-актинина, SERCA2 и Гата-4, по сравнению с подкожной ATDPCs, которые не являются, которые адаптированы к сердечной Окружающая среда34. Таким образом эффекты, производный от электромеханических стимуляции может быть больше для сердца прогениторных клеток, чьи ниша находится близко к или внутри миокарда окружение.
Последнее замечание, в котором ген модуляции сильно зависит от популяции клеток протокол оптимизации для каждой популяции клеток является целесообразным и приблизительные данные могут быть извлечены из тех, которые описаны в настоящем Протоколе. Наиболее важные шаги в электромеханических стимуляции клеток являются клетки привязанность и стимуляции режимов (интенсивность, частота и продолжительность).
К примеру электрические параметры имеют решающее значение. Действительно интенсивность электрического поля применяется был оптимальным для неэлектрические ячейки, поэтому увеличение значения будет более подходящим для ячеек с электрической активности, таких как незрелых плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов40,41 . Предварительные эксперименты для электростимуляции сердца ATDPC продемонстрировал, что постоянного тока и высокого напряжения индуцированной арест роста клеток и клеток смерть10. Из этих результатов были приняты протоколы переменного тока и низкого напряжения для дальнейших экспериментов.
Кроме того некоторые клетки линий представляют низкий привязанность к поверхности PDMS, так что покрытие или плазменной обработки предлагается обогатить посева эффективности42. Кроме того заполнение ячейки должны быть адаптированы к каждой ячейки размера и роста, уменьшения значений для высокой пролиферативной клеток или увеличения их для мелких клеток; Таким образом рекомендуется использовать несколько испытаний, заполнения нескольких плотности на конструкцию PDMS. Наконец протокол была исполнена на монослое клеток, и значения могут слегка отличаться для трехмерного сценария (т.е., плотность клеток).
Кроме того образец поверхности играет ключевую роль в подготовке механические клетки. Было показано, что клетки выровнены согласно шаблону и их производительность после механической стимуляции не было то же самое, среди различных поверхностей. К примеру механически стимулируется сердечной ATDPCs посеяны на белки узорной вертикальных поверхностей (перпендикулярная силам растяжения) выделяется связанные с инфаркта миокарда и внеклеточного матрикса, Ремоделирование мотивы. Mechanostimulated сердечной ATDPCs посеяны на nonpatterned поверхностях секретируемые белки, связанные с сердечной регенерации21.
Основные особенности этого метода были описаны выше. Однако важно подчеркнуть неинвазивная подход растяжения как один из уникальных методов достижения этих функций клеток. Интерес потому что то же устройство может представить электрических или механических раздражителей, прямое сравнение полученный эффект от различных стимуляцию и клетки возможно. Кроме того визуализация клетки посеян на конструкцию, благодаря прозрачности и тонкость, это явное преимущество для оценки состояния клеток до, во время и после стимуляции.
Устройство и Протокол имеют некоторые ограничения, некоторые из них уже отмечалось. Во-первых он был спроектирован и оптимизирован для культуры монослое клеток, а не для трехмерной клеточной культуры. В частности только адэрентных клеток может использоваться в параметре монослоя. Для nonadherent клеток должны осуществляться трехмерный подход. Во-вторых размер конструкции ограничивает заполнения поверхности; Таким образом количество стимулируется клетки является небольшим, и каждый экспериментальный набор требует несколько реплицирует собирать достаточно образцов для дальнейшего гена белка или анализа. Наращивание масштабов является обязательным для крупных животных экспериментов или клинический перевод, в котором требуются более высокие дозы клеток; в таких случаях могут рассматриваться больше стимуляции поверхности.
Основные области применения настоящего Протокола включают принадлежности клеток, моделирование болезней и наркотиков скрининг. Эта стимуляция усиливает созревания клеток, и его применение будет полезным для достижения и поддержания более зрелой фенотип. С одной стороны клетки, которые имитируют функциональные фенотип, присутствующих в миокарде взрослых имеют решающее значение для моделирования заболевания и орган на чипе экспериментов. Действительно человека биопсии не может представлять прогрессирование болезни, потому что они обычно терминальная стадия или трупных образцов, в то время как Животные модели не всегда пилки физиологии человека и симптоматики. Тем не менее метод альтернативного моделирования для разгадке механизма основной патологии развития43стало использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Кроме того органы на чипе находятся миниатюрные тканей и органов, выращенных в пробирке, которые позволяют моделирование физиологии человека (патолого) и имитации трехмерных структур. Их цель состоит в том, чтобы установить минимально функциональная единица, которая может напомнить некоторые аспекты человеческой физиологии и болезни в контролируемых и простым способом и устранения ограничений существующих клеток и Животные модели44.
С другой стороны скрининга наркотиков требует культуры платформ, которые имитируют биофизической среды настоящее яn vivo в высок объём, миниатюрных системы для тестирования безопасности и эффективности препаратов через cardiomyocyte ответ. Зрелые клетки могут быть использованы для пилки клинически значимых индикация (я. э., сократительная кинетика) в assay высок объём, для выяснения механизмов заболевания и выявления роман терапевтических целей45.
Сердечной области был основной сферы настоящего Протокола, но он может быть легко адаптирована к нейронов или скелетные доменов потому что эти среды характеризуются электрических и механических раздражителей. Предыдущие исследования с физической стимуляции указали благоприятных результатов46,47,48,,4950.
В заключение был описан новый протокол для синхронных электромеханические кондиционирования сердечной ATDPCs. Итоговый протокол и устройства были широко протестированы и проверены для индивидуальных и синхронизированные раздражителей. Синхронные электромеханические кондиционирования ATDPCs повышает их потенциал cardiomyogenic и выступает как перспективной стратегией для клеточной терапии, моделирование болезней и наркотиков скрининг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать, за исключением того, что устройство стимуляции и протокол были ранее запатентованной (WO-2013185818-А1, WO-2017125159-A1).
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить членов исследовательской программы ICREC (IGTP, Бадалона) и электронной биомедицинской аппаратуры группы (СКП, Барселона), особенно профессор J. Розе́ль-Феррер. Кроме того авторы признают журнал трансляционная Медицина стволовых клеток и AlphaMed Пресс для разрешения адаптации ранее опубликованные цифры (Llucià-Valldeperas, и др. 30). Разработка этого прототипа и дизайн протокола были поддержаны Ministerio de Educación y науки (SAF 2008-05144), y Ministerio де Economía развитию (SAF 2014-59892), Европейской Комиссии (7-й Рамочной программе RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Marató де ла Fundació TV3 (080330, 201516, 201502) и Фонд пункт ла ла Prospectiva Innovación y Salud ан Испании (FIPSE; 00001396-06-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2x | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
References
- McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
- Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
- Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
- Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
- Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
- Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
- Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
- Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93 (2014).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
- Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
- Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
- Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
- Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499 (2018).
- Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
- Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
- Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
- Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
- Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
- Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
- Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
- Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895 (2018).
- Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
- Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
- Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. Rosell Ferrer, F. X., Sánchez Terrones, B., Bragós Bardia, R., Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A. , Barcelano, Spain. WO/2013/185818 (2013).
- Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A., Soler Botija, C., Bragós Bardia, R., Rosell Ferrer, F. X. , Barceleno, Spain. WO/2017/125159 (2017).
- Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
- Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
- Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
- Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
- Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
- Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
- Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
