Summary
Her presenterer vi en protokoll for å trene en celle befolkningen ved hjelp av mekaniske og elektriske stimuli simulere cardiac fysiologi. Denne elektromekaniske stimulering forbedrer cardiomyogenic potensialet i behandlet cellene og er en lovende strategi for ytterligere cellen terapi, sykdom modellering og narkotikarelaterte screening.
Abstract
Kardiovaskulære sykdommer er den ledende dødsårsaken i utviklede land. Derfor har behovet for effektiv cardiac cellen terapi motivert forskere i feltene stilk cellen og bioteknologi å utvikle i vitro Hi-Fi-menneskelige myokard både grunnleggende forskning og klinisk bruk. Umodne fenotypen av cardiac celler er imidlertid en begrensning på å oppnå vev som etterligner funksjonelt voksen myokard, som kjennetegnes hovedsakelig av mekaniske og elektriske signaler. Dermed er formålet med denne protokollen å forberede og modne målet cellen befolkningen gjennom elektromekaniske stimulering, recapitulating fysiologiske parametere. Hjerte vev utvikling er i utvikling mot mer biologiske tilnærminger og strategier basert på Biofysiske stimuli, dermed er frammarsj. Enheten utviklet for dette formålet er unik og lar enkeltpersoner eller samtidige elektro og mekanisk stimulering, nøye preget og godkjent. I tillegg selv om metodikken er optimalisert for denne stimulator og en bestemt celle befolkningen, kan det enkelt tilpasses til andre enheter og linjer. Resultater her tilbyr bevis på økt hjerte engasjement av celle befolkningen etter elektromekaniske stimulering. Electromechanically stimulert celler Vis økt uttrykk for viktigste cardiac markører, inkludert tidlig, strukturelle og kalsium-regulere gener. Denne cellen condition kan være nyttig for ytterligere regenerativ cellen terapi, sykdom modellering og høy gjennomstrømming narkotikarelaterte screening.
Introduction
Hjertefunksjon er basert på koblingen av elektriske eksitasjon og mekanisk sammentrekning. Kort, cardiomyocyte intercellulære veikryss tillater elektrisk signal overføring å produsere nesten synkron sammentrekninger av hjertet som pumper blod systemisk og pulmonal systemet. CARDIAC celler, dermed gjennomgå både elektrisk og mekanisk styrker som regulerer gen uttrykk og cellular funksjon. Følgelig har mange grupper forsøkt å utvikle kultur plattformer som etterligner cardiac fysiologiske miljøet for å forstå rollen av mekanisk og elektrisk stimulering hjerte utvikling, funksjon og modning. In vitro mekaniske og elektriske stimulations er individuelt brukt mye i cardiac tissue engineering å forbedre funksjonelle egenskaper, øke celle modning, eller forbedre celle-celle kopling og kalsium håndtering1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. imidlertid synkron elektromekaniske condition fortsatt uutnyttet på grunn av utfordringen med å utvikle en stimulator og protokollen, og fordi det obligatoriske optimalisering22.
Forarbeidet adressert elektromekaniske stimulering som en kombinasjon av elektrisk stimulering og media perfusjon; flyten innebærer imidlertid ikke press-baserte deformasjon typisk ventrikkel fylling23,24,25. Senere, kombinert mer fysiologiske tilnærminger elektrisk stimuli med fysiske feil eller strekke å etterligne i isovolumetric sammentrekning26,27,28,29,30 ,31. Feng et al. beskrevet den første demonstrasjonen av elektromekaniske stimulering i 2005, rapportering forbedret cardiomyocyte størrelse og kontraktile26. Wang et al. forbehandlet mesenchymal stamceller med 5-azacytidine og brukt samtidig mekaniske og elektriske condition, bedre recellularization, celle levedyktighet, hjerte differensiering og vev remodeling27. Siden disse publikasjoner, flere grupper har rapportert på elektromekaniske stimulering av celle monolayers eller utviklet vev (f.eks svart28, Vunjak-Novakovic29,31og vår gruppe30) med den første betinget celler testet i vivo30. Kort, Morgan og svart testet flere kombinasjoner av mekaniske og elektriske stimuli, rapporterer at timingen mellom stimulations var viktig fordi forsinket kombinert elektromekaniske stimulering gitt de beste resultater28. Deretter Godier Furnémont og samarbeidspartnere optimalisert en elektromekaniske stimulering protokoll for konstruert hjertet muskel konstruksjoner fra neonatal rotte hjerteceller og oppnådd, for første gang, en positiv kraft-frekvens forholdet29. Etterpå rapportert vår gruppe at electromechanically preconditioned celler økt uttrykk for viktigste cardiac markører i vitro og bred gunstige effekter i vivo, som forbedret hjertefunksjon eller økt fartøyet tetthet i betennelsessykdommer grensen område30. Den nyeste publikasjonen har vist at hjerte vev fra stem-cell-derived cardiomyocytes utsatt for elektromekaniske condition nådde en modning nivå nærmere menneskelige voksne cardiac struktur og funksjon31. I tillegg alternativ tredimensjonale stimulering plattformer omfatter electroactive stillaser som gir elektriske, mekaniske og topografiske signaler til cellene festet32. Videre kan mekanisk deformasjon (celle monolayer stretching og kompresjon) også bli satt med elastisk elektroder mimicking normale fysiologiske forhold, samt ekstreme forhold33.
Begrunnelsen er derfor at i vitro elektromekaniske stimuli basert på fysiologiske forhold kan styrke cardiomyogenic potensialet i en celle. Faktisk kunne denne Stimuleringen dra videre integrasjoner av terapeutiske celler i myokard i klinisk scenario eller øke vev modning for narkotika-screening programmer.
Dessuten, vi isolert og preget en befolkning på menneskelig fettvev-avledet progenitor celler av cardiac opprinnelse (hjerte ATDPCs)34. Disse cellene er plassert i epicardial fettet. Disse cellene vise gunstige histopathological og funksjonelle effekter i behandlingen av hjerteinfarkt og også vedlikeholde cardiac og endothelial differensiering potensielle. 30 , 35. vi hypotesen at disse fordelene vil øke etter Biofysiske stimulering.
Derfor vi utviklet en enhet og en stimulering regime for celle befolkningen av interesse og undersøkt virkningene. Denne elektromekaniske protokollen er en ny strategi å indusere aktive cellen strekker seg på en steril måte og sammenlignet noninvasively med tidligere publikasjoner36, i kombinasjon med elektrisk felt stimulering. Teknikken rapporterte her forklarer i detalj enheten og metoden brukes til elektriske, mekaniske og elektromekaniske stimulering av celler.
Denne enheten kan gi både elektrisk og mekanisk stimulering, uavhengig eller samtidig. Stimulering utføres med en noninvasive og aseptisk romanen tilnærming som inkluderer presterilized cellestøtte, elektroder plassert inne i en standard kultur plate, og en plattform som induserer de mekaniske og elektriske styrkene (figur 1).
Plattformen kan inneholde opptil seks kultur plater og består av en sandwich struktur laserskåret poly(methyl methacrylate) og kretskort stykker. Plattformen prototypen er avhengig av en kombinasjon av en monophasic programmerbare datastyrt elektro stimulator, et kretskort for robust tilkoblingen elektroder og seks 10 x 10 mm x 5 mm nikkelbelagt Neodym-fast magneter plassert nær ene kultur platene. Det er også en aluminium bar med seks kjøring magneter (samme modell) plassert foran den andre siden av kultur platene og flyttet med en lineær servomotor. Motoren er drevet av en motor kontroller, drives gjennom en RS-232 port av kommersiell programvare (se Tabell for materiale). Gjennom brukergrensesnittet og programmerbare stimulator er det mulig å programmere elektrisk intensiteten, hele puls og frekvens, hyppigheten av mekanisk stimulering, sin driftssyklus, antall pulser, puls amplitude (magnet utflukt), og bakken.
Figur 1 : Elektromekaniske stimulator. (A) PDMS konstruere brukes for cellen condition. (B) tegning av den PDMS konstruksjonen, inkludert elektroder og magneter. (C) detalj av kretskort (plattform) brukes til å utføre den elektromekaniske condition. Dette panelet er endret fra Llucià-Valldeperas et al.30. (D) bilde av elektromekaniske stimulering plattformen og grensesnittet (datamaskin). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Både stimulator og metoden for elektromekaniske condition er fullstendig beskrevet i to internasjonale patenter, WO-2013185818-A137 og WO-2017125159-A138.
Biokompatible silikon konstruksjoner laget for å gi strukturell støtte celler, elektroder og magneter har vært beskrevet tidligere10,21. Kort, de består av polydimethylsiloxane (PDMS), støpt og kurert ved romtemperatur, med en ung modulus 1.3 MPA, nær fysiologiske nivåer. Konstruer inneholder en celle kultur basseng i et fleksibelt (10 mm x 10 x 2 mm), to indre tverrgående spor å holde elektrodene og to innebygd 6 x 2 mm x 4 mm nikkelbelagt neodymmagneter. Elektrodene er bygget med 0.2 mm platina wire snurret rundt en 2 x 3 mm x 12 mm polytetrafluoroethylene (PTFE) core bar (21 cm per elektrode, ca 23 svinger) og plassert på motsatte sider av fleksible området for å opprette et elektrisk felt for induksjon elektrisk stimulering. Mekanisk strekker oppnås gjennom magnetisk tiltrekning mellom magneter i støtte og eksterne magneter plassert ved kultur plate og på bevegelige aluminium arm. På denne måten kan cellestøtte utvides uten å bryte sterilt barrieren. Denne tilnærmingen passer for en celle monolayer, men kan tilpasses til tre-dimensjonale konstruksjoner, også.
I tillegg kan mønsteret være trykt hvor cellene er sådd, bruker en styrt Diffraksjon rist (1250 riller/mm). Direkte visualisering av celler kultivert på PDMS Konstruer under brightfield og fluorescerende mikroskop er mulig på grunn av sin åpenhet og 0,5 mm tykkelse. I det aktuelle tilfellet har PDMS kultur bassenget en vertikal overflaten mønster, vinkelrett strekker styrken, justere cellene vinkelrett til elektriske feltet som minimerer elektrisk felt graderingen over cellen.
Figur 1 viser en detaljert beskrivelse av konstruksjonen og apparat for stimulering. PDMS konstruere og egenskaper er optimalisert for celle strekker (figur 1A, B). Stimulator er utviklet og godkjent for effektiv bruk av ønsket elektro og mekanisk stimulering celler knyttet til den PDMS konstruksjonen. Denne prosessen inneholder sikre god tilkobling og bruker brukbarhet gjennom programvaregrensesnitt (figur 1 c, D).
Fremgangsmåten for cellen stimulering bruke skreddersydd enheten er beskrevet i delen protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien bruker menneskelige hjerte ATDPCs fra pasientprøvene. Bruken er godkjent av den lokale etikk, og alle pasienter ga samtykke. Studien protokollen følger prinsippene som ble forklart i erklæringen i Helsinki.
1. forberedelser
- Autoclave to pinsett, 12 platina PTFE elektroder elektrisk stimulering og noen papirhåndklær, 121 ° c for 20 min.
-
Sterilisere 12 PDMS skreddersydd konstruksjoner (figur 1A).
- Vask hver konstruksjon med 5 mL steril, destillert vann med magnetiske agitasjon i romtemperatur i 15 min.
- Vask 1 x med 5 mL av 70% etanol med magnetiske agitasjon ved romtemperatur for 5 min.
- Vask 5 ganger med 5 mL steril, destillert vann med magnetiske agitasjon ved romtemperatur for 10 min per vask, fjerne alkoholholdige rester.
- Tørr konstruksjoner på sterilt papirhåndklær inne flyt CAB overnatting.
- Lagre dem i sterilt 50 mL sentrifuge rør til bruk.
2. celle Seeding (dag -1)
- Før celle såing, overføre de renset PDMS konstruksjoner til sterilt plater og utsette dem for vinduskarm 5 min å sikre fullstendig sterilisering.
- Overføre hver konstruere til 35 mm celle kultur plate eller 6-vel plate, for umiddelbar celle seeding.
-
Trypsinize en confluent MT75 kolbe av cardiac ATDPCs.
- Vask MT75 flasken 5 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Legg 1 mL av 0,05% trypsin-EDTA og ruge ved 37 ° C i 5 min koble cellene.
- Legge til 5 mL av komplett medium å deaktivere trypsin-EDTA.
- Samle alle celler i en 15 mL tube og vask kolbe 2 x med 5 mL PBS å samle alle gjenværende celler.
- Sentrifuge 230 x g i 5 min på 22 ° C, fjerne nedbryting og resuspend cellene i 2 mL komplett medium for å telle dem med hemocytometer kammeret.
- Frø 200 µL av cardiac ATDPCs (2,5 x 105 celler/mL) i celle bassenget av 12 PDMS sammensetningene (figur 1A, B) ha ~ 80% av den seeding underlag som er dekket av cellene dagen etter og ruge på 37 ° C og 5% CO2.
Merk: Etter 2-4 h, skal cellene være tilknyttet. Celle inoculum er utarbeidet i henhold til Cellestørrelse og vekst. For mindre celler økes seeding tettheten. - Forsiktig legge 2 mL prewarmed komplett medium (α-MEM supplert med 10% fosterets bovin serum, 1% L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin) per plate.
- Inkuber konstruksjoner på kultur forhold (vanligvis 37 ° C og 5% CO2) over natten.
3. elektromekaniske stimulering Setup (dag 0)
- Før du starter prosedyren, ta seks konstruksjoner for elektromekaniske stimulering og seks nonstimulated kontroller. Med færre enn seks plater per stimulering, bruke tomme konstruksjoner med samme middels volum for å sikre riktig elektrisk felt stimulering.
- Rengjør stimulering enheten med 70% etanol, og plasser den i flyten regjering.
- Bringe sterilt elektroder og pinsett innsiden av flyt-kabinettet.
- Fjerne 90% av media fra kultur plate å lett manipulere elektroder og konstruksjoner. Først plasser PDMS konstruksjoner i riktig posisjon slik magnetisk tiltrekningskraft (PDMS Forskyvning innen kultur plate mot magneten) mellom både faste og mobile magneter. Så koble platina wire elektrode kontaktene og PTFE-del i sin egen plass i PDMS Konstruer.
- Legge til 2,5 mL av fersk prewarmed fullstendig medium hver konstruksjon.
Merk: Opprettholde sterilitet hele prosedyren og operere på en konstruksjon samtidig. Opprettholde resten av konstruksjoner i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 før bruk. - Når alle PDMS konstruksjoner er plassert og elektrisk koblet til plattform, bringe plattformen tilbake i inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
- Koble den mekaniske og elektriske kilden.
-
Konfigurere programmet stimulering. Angi elektro og mekanisk stimulering regimer gjennom brukergrensesnitt til elektro stimulator og programmet, som styrer mekanisk stimulering. Angi synkroniseringen som følger.
- Slå på til elektro stimulator. Vent til hovedmenyen vises på skjermen.
- Velg alternativ 2: Rediger sekvens + Enter.
- Redigere sekvensen menyen som følger.
- Bruk kategorien modus for å velge enten voltage eller nåværende. Velg gjeldende ved å klikke + og trykk Enter.
- For kategorien Amplitude , velg 1 (mA) med +/- og trykk Enter.
- Velger 1000 (ms) med +/- på Perioden (T), og trykk Enter.
- Angi puls varighet (Tw) til 2 (ms) med +/- og trykk Enter.
- Velg ekstern programvare for kategorien utløse modus , og trykk Enter.
- I hovedmenyen, velg alternativ 4: generere rekkefølge og trykk Enter.
Merk: Til elektro stimulator hviler på standby til den mottar en utløser kommando fra programmet mekanisk stimulator gjennom den serielle porten.
- Gjør følgende i delen mekanisk stimulering av programmet kontrollpanelet (figur 2C).
- Skriv 1000 (ms) i tekstkontrollen Puls periode .
- Skrive 500 (ms) i tekstkontrollen tid (Tw) sette mekanisk puls varigheten.
- Skrive 2000 (AU) i tekstkontrollen utflukt til å levere en 10% konstruere forlengelse. Dette er antall trinn i lineær kontroll motoren.
Merk: Stimulering protokollen brukt her består av vekslende gjeldende 2 ms monophasic square-bølge pulser av 50 mV/cm ved 1 Hz og 10% strekke i 7 dager. Vekst og fall tider mekanisk pulsen settes på 100 ms, til omtrent imitere form av Arne press pulsen. Også den repetisjon er satt til Fortløpende og det er en teller viser antall pulser.
- Slå på til elektro stimulator. Vent til hovedmenyen vises på skjermen.
- Endre media 2 x i uken (mandag og torsdag ettermiddag). Først fjerne den gamle mediet; deretter legger til varm media på sidene av PDMS støtte, aldri direkte på cellen bassenget.
Merk: Hvis cellene har en høy vekst, være media endret 3 x i uken (f.eks mandag, onsdag og fredag). Det er nødvendig å koble fra og koble alle kablene, men det er ikke nødvendig å fjerne kultur plater og elektroder fra deres plass. - Avhente eksemplar etter eksperimentering er utført.
4. prøvetaking på slutten av eksperimentering (dag 7)
-
For RNA analyser
- Vask Konstruer 2 x med 3 mL 1 x PBS i 5 minutter ved romtemperatur.
- Legge til 3 mL 0,05% trypsin-EDTA hver plate (nok til å dekke hele Konstruer) og vent 5 min på 37 ° C.
- Når cellene er enebolig, legge 2 mL komplett medium å deaktivere trypsin-EDTA.
- Samle alle celler i en 15 mL tube og vaske Konstruer 2 x med 3 mL PBS å samle alle gjenværende celler.
- Sentrifuger 230 x g i 5 min på 22 ° C.
- Fjern nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av PBS.
- Overføre celle løsningen til en 1,5 mL rør og sentrifuge 230 x g for 5 min.
- Fjern nedbryting og lagre pellet ved-80 ° C i 700 µL av lysis reagensen ytterligere RNA isolering.
- Isolere RNA bruker en kommersiell kit, følger produsentens instruksjoner.
- Omvendt-transkribere isolert RNA bruke kit og tilfeldig hexamers, i henhold til produsentens protokollen.
- For små RNA konsentrasjoner, preamplify og deretter fortynnes 1:5 med RNase-fritt vann før påfølgende sanntid omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) utføres. Fortsette med standard protokoll for sanntids RT PCR og sjekk viktigste cardiac markører.
Merk: Typisk cardiac markører utgjør tidlige og sene markører fra forskjellige kategorier, for eksempel enkelte transkripsjonsfaktorer (myocyte-spesifikke enhancer faktor 2A [MEF2A], GATA-bindende protein 4 [GATA-4]) og strukturelle (hjerte troponin jeg [cTnI], hjerte Troponin T [cTnT], α-actinin) og kalsium regulering (Connexin43 [Cx43], sarco-/ endoplasmatiske retikulum Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. Protein isolasjon kan også utføres hvis nødvendig. Samtidige RNA og protein isolasjon kan utføres med samme prøven, bruke kommersielt tilgjengelige reagenser og kits (Tabell for materiale) hvis prøven antallet er mindre.
-
For immunostainings
Merk: Dette utføres direkte på cellene knyttet til celle pool av den PDMS konstruksjonen. Derfor anbefaler vi å plassere, hver gang, 1 cm x 1 cm parafin film på cellen bassenget, bortsett fra platen lokk, for å minimere fordampning inkubasjon løsninger.- Vask Konstruer 2 x med 3 mL PBS i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fastsette cellene knyttet til Konstruer med 2 mL 10% formalin i 15 min ved romtemperatur.
- Vask cellene 3 x med 3 mL PBS i 5 minutter ved romtemperatur. For langvarig lagring, forlate prøvene i PBS med 0,1% Natriumazid på 4 ° C.
- Permeabilize cellene med 3 mL PBS + 0,5% vaskemiddel (3 x, hver gang 5-10 min, ved romtemperatur).
- Inkuber cellene med 100 µL av PBS + 10% hest serum + 0,2% vaskemiddel + 1% bovin serum albumin ved romtemperatur 1t, for å blokkere uspesifikke antistoff bindende.
- Inkuber cellene med 100 µL av PBS + 10% hest serum 0,2% vaskemiddel + 1% bovin serum albumin ++ primære antistoff ved romtemperatur 1t. For eksempel primære antistoffer mot Cx43 (1: 100), sarcomeric α-actinin (1: 100), GATA-4 (1:50), MEF2 (1:25), og SERCA2 (1:50).
- Vask 3 x med 3 mL PBS ved romtemperatur for 5 min.
- Inkuber cellene med 100 µL av PBS + sekundær antistoff ved romtemperatur i mørket 1t.
Merk: Sekundær antistoffer konjugert med forskjellige fluorophores og en counterstaining agent ble brukt. - Vask dem 3 x med 3 mL PBS ved romtemperatur i mørket 5 min.
- Inkuber cellene med 100 µL av kjernefysiske flekker (0,1 µg/mL) i PBS ved romtemperatur i mørket i 15 min.
- Vask dem 3 x med 3 mL PBS ved romtemperatur i mørket 5 min.
- Lagre prøvene i 3 mL PBS med 0,1% Natriumazid på 4 ° C til oppkjøpet.
Merk: Mikroskopet oppkjøpet er mulig på invertert fluorescerende og AC confocal mikroskop med lang arbeidende avstand mål fordi konstruere tykkelsen er ca 0,5 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 representerer generelle skjemaet fulgt i cellen stimulering. Kort, celler var sådd på den PDMS konstruksjonen og utsatt for elektromekaniske stimulering, med en media endring utført to ganger i uken. Nonstimulated celler ble brukt som en kontroll for elektromekaniske condition. I tillegg vi lagt til en ekstra kontroll til eksperimentet, og underhud ATDPCs ble brukt som en kontroll for enkelte ATDPCs. Subkutan ATDPCs hentes fra subkutan fettvev, følge samme isolasjon og kultur prosedyrer for hjerte ATDPCs33. Celler som er knyttet til den PDMS konstruere dokumentert en typisk fusiform fenotypen før og etter stimulering. Videre cellene justert etter mønstret overflaten, i dette tilfellet følger det loddrette mønsteret.
Mekaniske og elektriske stimulations ble først optimalisert individuelt. Først var elektrosimuering basert på en tidligere studie i hvilke vekslende gjeldende 2 ms monophasic square-bølge pulser av 50 mV/cm ved 1 Hz ble funnet for å være best for hjerte ATDPCs10. Vi rapporterte at elektrisk stimulering økt uttrykk for tidlig cardiac markører i cardiac ATDPCs, som MEF2A (P = 0.050) og GATA-4 (P = 0.031), men ingen effekter på strukturelle og kalsium-håndtering gener ble observert (data ikke vist) .
Andre, mechanostimulation protokollen besto av 10% strekke og en 1 Hz trapesformet bølgeform med en 50% driftssyklus, med 100 ms rise og fall tider å imitere trykket bla i hjertet, som beskrevet i sin helhet før21. Mekanisk stimulert cardiac ATDPCs utvidet uttrykket av strukturelle gener som α-actinin (P = 0,001) eller cTnI (P = 0.044), og viste en økende trend for tidlig cardiac markører, GATA-4 (P = 0.068) og T-box transkripsjon faktor 5 (Tbx5; P = 0.065) (data ikke vist). Effekter fra mekanisk stimulering var sterkt avhengig av mønstret overflaten.
Etterpå ble begge protokollene kombinert for en effektiv elektromekaniske stimulering av cardiac ATDPCs, som likner ventrikkel fyller blod. Den resulterende protokollen består vekselvis gjeldende 2 ms monophasic square-bølge pulser av 50 mV/cm ved 1 Hz og 10% strekke på 7 dager30. Samlet forbedret electromechanically stimulert cardiac ATDPCs deres cardiomyogenic potensielle. Stimulert cardiac ATDPCs økt uttrykk for tidlige og sene cardiac gener (Figur 3A), nemlig hjerte transkripsjon faktoren GATA-4 (P = 0.050), den strukturelle markør β-myosin tunge kjeden (β-MHC; P = 0.000), og kalsium-relaterte genet Cx43 (P = 0.025). Gene modulasjoner skyldes elektromekaniske stimulering ble også oversatt på protein nivå (Figur 3B-M). Phalloidin flekker mot utgangen fiber viste at fleste cellene justert etter vertikal mønster og at den Cx43 fordelingen var hovedsakelig i cytoplasma og plasma membranen, bidra til intercellulære kommunikasjon gjennom gap veikryss (Figur 3B-E). MEF2 og GATA-4 transkripsjonsfaktorer lå i kjerner i cardiac ATDPCs; GATA-4 fant imidlertid ikke i subkutant ATDPCs (Figur 3F-M). Cytoplasmatiske markører SERCA2 og sarcomeric α-actinin viser ikke en moden sarcomere organisasjon typisk for cardiomyocytes, og slo var ikke observert i kontroll og stimulere celle populasjoner (Figur 3F-M).
Figur 2 : Elektromekaniske stimulering prosedyre, enhet, og brukergrensesnitt. (A) elektromekaniske stimulering skjema med representant bilder av nonstimulated celler på dag 0 og stimulert celler på dag 7, både på konstruksjoner med vertikale overflaten mønster. Skalere barer = 100 µm. (B) elektromekaniske stimulering enhet: seeded PDMS konstruksjon, elektroder og fast/mobil magneter. (C) programmet Kontrollpanel for mekanisk stimulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Gene og protein uttrykk for de viktigste cardiac markørene etter elektromekaniske stimulering av cardiac og underhud ATDPCs. (A) Real-time PCR av viktigste cardiac gener i cardiac og underhud ATDPCs. Relativ uttrykket av cardiomyogenic markører i stimulert versus vises nonconditioned kontroller for hjerte og underhud ATDPCs. Var normalisert til glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase uttrykk og vises som betyr ± SEM for seks uavhengige eksperimenter. P < 0,05 (betydning). (B - M) Protein uttrykk i cardiac og underhud ATDPCs på et loddrett-mønstrete overflaten uttrykk for viktigste cardiac markører for kontroll og stimulert celler. Phalloidin flekker (actinF, rød) og Cx43 uttrykk (grønn), SERCA2 (rød), MEF2 (grønn), sarcomeric α-actinin (rød) og GATA-4 (grønn) uttrykk i kontroll (i paneler B, D, F, H, Jog L ) og stimulert (i paneler C, E, G, I, Kog M) kardial (venstre) og underhud (høyre) ATDPCs. Kjerner var counterstained med DAPI (blå; paneler B - E, L, og M). Skala barer = 50 µm. Dette tallet har blitt endret fra Llucià-Valldeperas et al.30. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektromekanisk stimulering synes å være et trygt alternativ for celler forberedte et fiendtlig cardiac miljø og forsterke deres hjerte engasjement. Her, rapportert en protokoll beskrevet for hjerte progenitor celler økt uttrykk for viktigste cardiac markører og ble for å være gunstig for deres neste implantasjon på infarcted murint myokard30. Generelt økt electromechanically stimulert cardiac ATDPCs uttrykk for gener knyttet til tidlig, strukturelle og kalsium regulering, som aldri har vært oppnådd med tidligere elektriske eller mekaniske stimulations individuelt. Faktisk electromechanically stimulert cardiac ATDPCs viser en mer fullstendig profil og syntes å være mer engasjert i cardiac arverekken enn tidligere rapportert.
CARDIAC genuttrykk var modulert i begge celletyper etter elektromekaniske stimulering, spesielt etter kjente augmentation av cardiac ATDPCs forhold til subkutan ATDPCs. Dette resultatet kan ha vært en konsekvens av opprinnelsen til fettvev brukes for cellen aisolering, nemlig epicardial eller subkutant fett, henholdsvis. Epicardial fettvev rundt både hjerte og pericardium er en metabolsk aktive orgel og en kilde til progenitor celler. Av interesse har epicardial fettet anatomiske og funksjonelle kontinuitet med myokard. Under normale omstendigheter har epicardial fettet biokjemiske og thermogenic Kardioprotektive egenskaper; omvendt, under pathological betingelser, kan det avsondre proinflammatory cytokiner å påvirke hjertet39. Faktisk cardiac ATDPCs har en iboende hjerte-lignende fenotype, og viser en grunnleggende uttrykk for cardiac markører, som Cx43, sarcomeric α-actinin, SERCA2 og GATA-4, sammenlignet med subkutan ATDPCs, som ikke er som tilpasset cardiac miljø34. Dermed kan effekter fra elektromekaniske stimulering være større for cardiac stamfar celler, som nisje er nær eller innenfor hjerteinfarkt miljøet.
Siste observasjon i hvilket gen avhenger modulering sterkt celle befolkningen, en protokollen optimalisering for hver celle befolkningen anbefales og omtrentlige verdier kan trekkes fra dem som er beskrevet i denne protokollen. De viktigste trinnene i cellen elektromekaniske stimulering er cellen vedlegg og stimulering regimer (intensitet, varighet, frekvens).
For eksempel er elektriske parameterne avgjørende. Faktisk, elektrisk felt intensitet brukt var optimale for en nonelectric celle, så økte verdier ville være mer passende for celler med elektrisk aktivitet, for eksempel umodne pluripotent stilk-cell-derived cardiomyocytes40,41 . Innledende eksperimentering for hjerte ATDPC elektrosimuering viste at en likespenning og en høy spenning forårsaket celle vekst arrestasjon og celle død10. Fra disse resultatene, ble veksler gjeldende og lavspent vedtatt for videre eksperimentering.
I tillegg presentere noen celle linjene en lav tilknytning til PDMS overflaten, så et belegg eller plasma behandling er foreslått for å berike seeding effektivitet42. Videre bør celle såing være tilpasset hver Cellestørrelse og vekst, reduserer verdiene for svært proliferativ cellene eller øke dem for mindre celler. dermed anbefales noen forsøk seeding flere tettheter på PDMS Konstruer. Endelig protokollen ble utført på en celle monolayer, og verdiene kan være litt annerledes for tredimensjonale scenario (dvs. den cellen tettheten).
Videre spiller overflaten mønsteret en nøkkelrolle i mekanisk celle trening. Det ble vist at cellene justert etter mønsteret og ytelsen når mekanisk stimulering ikke var det samme blant ulike overflater. For eksempel, mekanisk stimulert cardiac ATDPCs seeded på vertikale-mønstret overflater (vinkelrett til strekker force) utskilles proteiner forbundet med hjerteinfarkt og ekstracellulær matrix remodeling motiver. Mechanostimulated hjerte ATDPCs seeded på nonpatterned overflater utskilles proteiner forbundet med hjerte gjenfødelse21.
De viktigste funksjonene i denne metoden er beskrevet ovenfor. Det er imidlertid viktig å understreke noninvasive tilnærming av cellen strekker seg som en av de unike metodene for å oppnå disse funksjonene. Rundt, fordi den samme enheten kan sende elektriske og/eller mekanisk stimuli, er en direkte sammenligning av den resulterende effektene fra ulike stimulations og cellene mulig. I tillegg er visualisering av cellene seeded på Konstruer, gjennomsiktighet og thinness, en klar fordel å vurdere celle status før, under og etter stimulering.
Enheten og protokollen har noen begrensninger, noen av dem allerede er registrert. Først var det designet og optimalisert for en monolayer cellekultur og ikke for en tredimensjonal cellekultur. Spesielt kan bare tilhenger celler brukes i innstillingen monolayer. For nonadherent celler, skal en tre-dimensjonal tilnærming implementeres. Andre begrenser konstruere størrelsen seeding overflaten; dermed antall stimulert celler er liten, og hvert eksperimentelle sett krever flere gjentak å samle nok prøver for videre genet eller protein analyser. En skala-up er obligatorisk for store dyr eksperimentering eller klinisk oversettelse, der høyere celle doser er obligatoriske. i slike tilfeller betraktes større stimulering overflater.
De viktigste programmene av denne protokollen inkluderer cellen condition, sykdom modellering og narkotikarelaterte screening. Denne Stimuleringen forbedrer celle modning, og programmet ville være nyttig for å oppnå og opprettholde en mer moden fenotypen. På den ene siden er celler som etterligner funksjonelle fenotypen i voksen myokard avgjørende for sykdom modellering og orgel på-chip eksperimentering. Faktisk kan ikke menneskelig biopsies representere progresjon av sykdommen fordi de er vanligvis sluttstadiet eller evaluering prøver, mens dyremodeller ikke alltid er recapitulate menneskelige fysiologi og symptomer. Likevel har bruk av menneskeskapte pluripotent stamceller framstått som en alternativ modellering metode for unraveling mekanisme underliggende patologi utvikling43. I tillegg er organer på-chip miniatyr vev og organer vokst i vitro som tillater modellering av menneskelige (patho) fysiologi og etterligne tredimensjonale strukturer. Deres mål er å etablere en minimal funksjonell enhet som kan recapitulate visse aspekter av menneskelige fysiologi og sykdom i en kontrollert måte og adresse begrensningene for eksisterende celle og dyremodeller44.
På den annen side, krever narkotikarelaterte screening kultur plattformer som etterligner Biofysiske miljø stede jegn vivo i en høy gjennomstrømming, miniatyriserte system for å teste sikkerheten og effekten av rusmidler fra cardiomyocyte svar. Eldre celler kan brukes til recapitulate en klinisk relevante avlesning (jeg. e., kontraktile kinetics) i en høy gjennomstrømming analysen, belyse sykdom mekanismer og identifisere romanen terapeutiske mål45.
Feltet hjerte var viktigste omfanget av denne protokollen, men det kan lett tilpasses til nevronale eller skjelettlidelser domener fordi disse miljøene er preget av mekaniske og elektriske stimuli. Tidligere studier med fysisk stimulations har vist resultater,46,,47,,48,,49,,50.
Som konklusjon, har en ny protokoll for synkron elektromekaniske Kondisjonering av cardiac ATDPCs blitt beskrevet. Resulterende protokollen og enheten er grundig testet og godkjent for individuelle og synkronisert stimuli. Synkron elektromekaniske condition av ATDPCs øker deres cardiomyogenic potensielle og fremstår som en lovende strategi for cellen terapi, sykdom modellering og narkotikarelaterte screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre, bortsett fra at stimulering enheten og protokollen ble tidligere patentert (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1).
Acknowledgments
Forfatterne vil takke medlemmer av elektronisk og biomedisinsk instrumentering gruppe (UPC, Barcelona), spesielt Prof J. Rosell-Ferrer forskningsprogrammet ICREC (IGTP, Badalona). I tillegg bekrefter forfatterne STAMCELLER translasjonsforskning medisin journal og AlphaMed Trykk for å tillate tilpasning av tidligere publiserte tall (Llucià-Valldeperas, et al. 30). utvikling av denne prototypen og utformingen av protokollen ble støttet av Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), Europakommisjonen 7th Framework Programme ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502), og Fundación para la Innovación y la Prospectiva no Salud España (FIPSE; 06-00001396-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2x | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
References
- McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
- Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
- Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
- Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
- Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
- Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
- Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
- Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93 (2014).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
- Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
- Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
- Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
- Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499 (2018).
- Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
- Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
- Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
- Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
- Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
- Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
- Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
- Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895 (2018).
- Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
- Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
- Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. Rosell Ferrer, F. X., Sánchez Terrones, B., Bragós Bardia, R., Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A. , Barcelano, Spain. WO/2013/185818 (2013).
- Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A., Soler Botija, C., Bragós Bardia, R., Rosell Ferrer, F. X. , Barceleno, Spain. WO/2017/125159 (2017).
- Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
- Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
- Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
- Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
- Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
- Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
- Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
