Summary
Nous présentons ici un protocole pour la formation d’une population de cellules à l’aide de stimuli électriques et mécaniques, émulant la physiologie cardiaque. Cette stimulation électromécanique améliore le potentiel de cardiomyogénique des cellules traitées et est une stratégie prometteuse pour autre thérapie cellulaire, modélisation de la maladie et dépistage des drogues.
Abstract
Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans les pays développés. Par conséquent, la demande pour des thérapies efficaces cellule cardiaque a motivé des chercheurs dans les domaines de la bio-ingénierie et de cellules souches pour développer en vitro haute-fidélité humaine myocarde pour la recherche fondamentale et les applications cliniques. Cependant, le phénotype immature des cellules cardiaques est une limitation sur l’obtention de tissus qui imitent fonctionnellement le myocarde adult, qui se caractérise principalement par des signaux mécaniques et électriques. Ainsi, le but du présent protocole est de préparer et de maturité de la population de cellules cibles par le biais de la stimulation électromécanique, récapitulant les paramètres physiologiques. Génie tissulaire cardiaque évolue vers des approches plus biologiques, et des stratégies fondées sur des stimuli biophysiques, ainsi, sont accélèrent. Le dispositif mis au point à cet effet est unique et permet individuelle ou simultanée électrique et mécanique stimulation, soigneusement caractérisés et validées. En outre, bien que la méthodologie a été optimisée pour ce stimulateur et une population de cellules spécifiques, il peut être facilement adaptée à d’autres dispositifs et les lignées cellulaires. Les résultats présentés ici offrent la preuve de l’engagement cardiaque accrue de la population cellulaire après stimulation électromécanique. Cellules stimulées électro-mécaniquement montrent une augmentation de l’expression des principaux marqueurs cardiaques, y compris des gènes précoces, structurales et régulatrices du calcium. Ce conditionnement cellulaire pourrait être utile pour encore la thérapie régénératrice cellulaire, modélisation de la maladie et dépistage des drogues de haut débit.
Introduction
La fonction cardiaque est basée sur le couplage de l’excitation électrique et mécanique contraction. Brièvement, jonctions intercellulaires cardiomyocyte permettent de propagation du signal électrique pour produire des contractions presque synchrones du coeur qui pompe le sang systémique et à travers le système pulmonaire. Les cellules cardiaques, subissent ainsi, électriques et mécaniques des forces qui régissent la fonction cellulaire et de l’expression du gène. En conséquence, plusieurs groupes ont tenté de développer des plates-formes de culture qui imitent l’environnement physiologique cardiaque pour comprendre le rôle de stimulation mécanique et électrique sur le développement cardiaque, fonction et la maturation. In vitro les stimulations électriques et mécaniques individuellement ont été appliquées largement dans l’ingénierie du tissu cardiaque pour améliorer les propriétés fonctionnelles, augmenter la maturation cellulaire ou améliorer le couplage cellule-cellule et calcium manipulation1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Néanmoins, climatisation electromecanique synchrone reste inexploitée en raison du défi de mettre au point un protocole et un stimulateur et l' optimisation obligatoire22.
Les travaux préliminaires adressées stimulation électromécanique comme une combinaison de la stimulation électrique et de la perfusion de médias ; Toutefois, le flux n’implique pas la déformation axée sur la souche typique du remplissage ventriculaire23,24,25. Plus tard, les approches physiologiques plus combinée des stimuli électriques avec déformation physique ou d’étirement pour imiter les isovolumétriques contraction26,27,28,29,30 ,,31. Feng Al décrit la première démonstration de stimulation électromécanique en 2005, rapports améliorés cardiomyocyte les propriétés size et contractiles26. Wang Al prétraitées avec des cellules souches mésenchymateuses avec la 5-azacytidine et appliqué simultanée climatisation électrique et mécanique, amélioration de la recellularization, la viabilité cellulaire, différenciation cardiaque et tissu transformant le27. Depuis ces publications, plusieurs groupes ont rapporté sur la stimulation électromécanique de monocouches de cellules ou ingénierie des tissus (p. ex., noir28, Vunjak-Novakovic29,31et notre groupe30) avec la premières cellules climatisées testé in vivo30. En bref, Morgan et noir testé plusieurs combinaisons de stimuli électriques et mécaniques, déclaration que le moment entre les stimulations était crucial car retardée combinée stimulation électromécanique ont donné les meilleurs résultats28. Ensuite, Godier-Furnémont et collaborateurs optimisé un protocole de stimulation électromécaniques pour constructions muscle cœur machiné de cellules cardiaques de rat néonatal et atteint, pour la première fois, une de relation positive force-fréquence29. Par la suite, notre groupe a indiqué qu’électro-mécaniquement préconditionnés cellules augmenté l’expression de marqueurs cardiaques principal in vitro et large bénéfique effets in vivo, tels qu’améliore la fonction cardiaque ou augmente la densité des navires dans l’infarctus frontière région30. La publication la plus récente a démontré que les tissus cardiaques de cardiomyocytes dérivés tige-cellule soumis à atteint une maturation niveau plus proche de l’humain adulte cardiaque structure et la fonction31aux électromécaniques. En outre, les plates-formes alternatives de stimulation en trois dimensions représentent électroactifs échafaudages qui fournissent l’électricité, mécanique et repères topographiques aux cellules attaché32. En outre, déformation mécanique (cellulaire monocouche qui s’étend et compression) peut également être induite avec électrodes extensibles imitant les conditions physiologiques normales, ainsi que des conditions extrêmes,33.
Par conséquent, le raisonnement est que des stimuli électromécaniques in vitro selon les conditions physiologiques pourraient renforcer le potentiel de cardiomyogénique d’une cellule. En effet, cette stimulation pourrait une prestation plus intégrations de cellules thérapeutiques dans le myocarde dans un scénario clinique ou la maturation des tissus pour des applications de dépistage des drogues.
En outre, nous avons isolé et caractérisé une population de cellules progénitrices de dérivées du tissu adipeux humain de cardiaque d’origine (ATDPCs cardiaques)34. Ces cellules sont situées dans la graisse épicardique. Ces cellules affichent des effets histopathologiques et fonctionnels bénéfiques dans le traitement de l’infarctus du myocarde et aussi maintient la différenciation cardiaque et endothéliale potentiel. 30 , 35. nous avons supposé que ces bénéfices augmenteraient après stimulation biophysique.
Par conséquent, nous avons mis au point un dispositif et un régime de stimulation pour la population de cellules d’intérêt et ont étudié les effets. Ce protocole électromécanique est une nouvelle stratégie pour induire la cellule active, qui s’étend de façon stérile et non invasive par rapport aux précédentes publications36, en combinaison avec une stimulation de champ électrique. La technique rapportée ici explique en détail l’appareil et la méthode utilisée pour la stimulation électrique, mécanique et électromécanique des cellules.
Cet appareil peut fournir la stimulation électrique et mécanique, indépendamment ou simultanément. La stimulation est effectuée avec une nouvelle approche non invasive et aseptique qui inclut le support de cellule pré-stérilisé, électrodes placées à l’intérieur d’une plaque de culture standard et une plate-forme qui induit les forces mécaniques et électriques (Figure 1).
La plate-forme peut contenir jusqu'à six culture plaques et se compose d’une structure "sandwich" de poly(methyl methacrylate) découpé au laser et des morceaux de carte de circuit imprimé. Le prototype de plate-forme repose sur une combinaison d’une monophasique programmable commandé par ordinateur stimulateur électrique, une carte de circuit imprimé pour la connexion robuste des électrodes et six 10 x 10 mm x 5 mm nickelé-correction de néodyme aimants placés près d’un côté des plaques de culture. Il y a également une barre en aluminium avec six aimants conduites (même modèle) placé en face de l’autre côté des plaques de culture et s’installe avec un servomoteur linéaire. Le moteur est entraîné par un contrôleur de moteur, opéré via un port RS-232 par des logiciels commerciaux (voir la Table des matières). Par le biais de l’interface utilisateur et stimulateur programmable, il est possible de programmer l’intensité électrique, la durée de l’impulsion et de fréquence, la fréquence de stimulation mécanique, son rapport cyclique, le nombre d’impulsions, l’amplitude de l’impulsion (excursion aimant), et la pente.
Figure 1 : Stimulateur électromécanique. (A), PDMS construction utilisée pour le conditionnement de la cellule. Dessin (B) de la construction PDMS, y compris les électrodes et les aimants. (C) détail de la platine (plate-forme) utilisée pour effectuer le conditionnement électromécanique. Ce panneau a été modifié par Llucià-Valldeperas Al30. (D) photo de la stimulation électromécaniques plate-forme et interface utilisateur (ordinateur). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tant le stimulateur et le mode de conditionnement électromécanique sont décrites en détail dans deux brevets internationaux, WO-2013185818-A137 et38de la WO-2017125159-A1.
Le silicone biocompatible constructions conçues pour apporter un soutien structurel aux cellules, électrodes et aimants ont été décrits précédemment10,21. En bref, ils se composent de polydiméthylsiloxane (PDMS), moulé et durci à la température ambiante, avec un module d’Young de 1,3 MPa, proches des niveaux physiologiques. La construction contient un bassin de culture cellulaire dans une zone flexible (10 x 10 x 2 mm), deux fentes transversales intérieures pour tenir les électrodes et deux intégré 6 x 2 mm x 4 mm nickelé néodyme. Les électrodes sont construits avec 0,2 mm platine fil torsadé autour d’une 2 x 3 mm x 12 le polytétrafluoroéthylène (PTFE) de mm base bar (21 cm par électrode, environ 23 tours) et mis à part et d’autre de la zone flexible pour créer un champ électrique pour induire stimulation électrique. Étirement mécanique est obtenue par une attraction magnétique entre les aimants intégrés dans le support et aimants externes placés à côté de la plaque de culture et sur le bras en aluminium mobile. De cette façon, le soutien de la cellule peut être étendu sans casser la barrière stérile. Cette approche convient à une monocouche de cellules, mais pourrait être adaptée pour des constructions en trois dimensions, aussi bien.
En outre, un modèle régulier pourrait être imprimé où les cellules sont ensemencées, à l’aide d’un réseau de diffraction gouverné (1 250 rainures/mm). La visualisation directe des cellules cultivées sur la construction PDMS sous fond clair et microscopes fluorescents est possible en raison de sa transparence et son épaisseur 0,5 mm. En l’espèce, la piscine de la culture PDMS a un motif de surface vertical, perpendiculaire à la force d’étirement, d’aligner les cellules perpendiculairement au champ électrique, ce qui minimise le gradient de champ électrique dans l’ensemble de la cellule.
La figure 1 montre une description détaillée de la construction et le dispositif utilisé pour la stimulation. Construire les PDMS et caractéristiques sont optimisés pour une cellule qui s’étend (Figure 1 a, B). Le stimulateur est développé et validé pour l’application effective de la stimulation électrique et mécanique souhaitée aux cellules attaché à la construction PDMS. Ce processus vise à assurer le bon fonctionnement connectivité et utilisateur par le biais de l’interface du logiciel (Figure 1, D).
La procédure pour la stimulation des cellules à l’aide de ce dispositif sur mesure est décrite dans la section protocole.
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Protocol
Cette étude utilise une ATDPCs cardiaque humaine d’échantillons de patients. Leur utilisation a été approuvée par le Comité d’éthique local et tous les patients ont donné un consentement éclairé. Le protocole de l’étude est conforme aux principes énoncés dans la déclaration d’Helsinki.
1. les préparatifs
- Autoclave deux pincettes, 12 électrodes de platine PTFE pour la stimulation électrique et quelques serviettes en papier, à 121 ° C pendant 20 min.
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Stériliser des constructions sur mesure de PDMS 12 (Figure 1A).
- Lavez chaque construction avec 5 mL d’eau distillée stérile avec agitation magnétique à température ambiante pendant 15 min.
- Laver 1 fois avec 5 mL d’éthanol à 70 % avec agitation magnétique à température ambiante pendant 5 min.
- Laver 5 x 5 ml d’eau distillée stérile avec agitation magnétique à température ambiante pendant 10 min / cycle de lavage, pour éliminer les résidus alcooliques.
- Sécher les constructions sur des essuie-tout stérile à l’intérieur de la nuit armoire de flux.
- Rangez-les dans des tubes à centrifuger stérile de 50 mL jusqu'à l’utilisation.
2. cellule ensemencement (jour -1)
- Avant cellule ensemencement, transférer les constructions PDMS nettoyées à plaques stériles et les exposer aux rayons ultraviolets pendant 5 min afin d’assurer une stérilisation complète.
- Transférer chaque construction à une plaque de culture cellulaire 35 mm ou plaque 6 puits, pour l’ensemencement de la cellule immédiatement.
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Trypsinize une fiole T75 confluente de ATDPCs cardiaques.
- Laver la fiole T75 avec 5 mL 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C pendant 5 min détacher les cellules.
- Ajouter 5 mL de milieu complet pour inactiver la trypsine-EDTA.
- Recueillir toutes les cellules dans un tube de 15 mL et laver la fiole 2 x 5 ml de PBS pour recueillir les cellules restantes.
- Centrifuger à 230 x g pendant 5 min à 22 ° C, retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 mL de milieu complet pour les compter avec la chambre hémocytomètre.
- Semences 200 µL de ATDPCs cardiaques (2. 5 x 105 cellules/mL) dans le pool de cellules des constructions PDMS 12 (Figure 1A, B) d’avoir environ 80 % de la surface d’ensemencement couverte par des cellules le lendemain et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2.
Remarque : Après 2 à 4 h, les cellules doivent être attachés. Cellule inoculum est préparé selon la taille des cellules et la croissance. Pour les plus petites cellules, la densité de semis doit être augmentée. - Doucement, ajouter 2 mL de milieu complet préchauffée (α-MEM additionné de 10 % fœtale bovine sérique, 1 % L-glutamine et 1 % la pénicilline-streptomycine) par plaque.
- Incuber les constructions à des conditions de culture (généralement 37 ° C et 5 % CO2) jusqu’au lendemain.
3. électromécaniques Stimulation Setup (jour 0)
- Avant de commencer la procédure, prendre six constructions électromécaniques stimulation et six en tant que contrôles non stimulées. Avec moins de six plaques par stimulation, utilisent des constructions vides avec le même volume moyen d’assurer une stimulation appropriée de champ électrique.
- Nettoyer l’appareil de stimulation avec l’éthanol à 70 % et le placer dans le flux du cabinet.
- Mettre les électrodes stériles et la pince à épiler à l’intérieur de l’armoire de flux.
- Retirez la plaque de culture pour manipuler facilement les électrodes et les constructions de 90 % des médias. Tout d’abord, placez les constructions PDMS dans la bonne position pour assurer une attraction magnétique (déplacement de PDMS dans la plaque de culture vers l’aimant) entre les aimants fixes et mobiles. Ensuite, connectez le fil de platine pour les connecteurs de l’électrode et la pièce PTFE dans son espace désigné dans la construction PDMS.
- Ajouter 2,5 mL de milieu complet préchauffée frais à chaque construction.
Remarque : Maintenir la stérilité tout au long de la procédure et d’exploiter sur une construction à la fois. Conserver le reste des constructions dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 jusqu'à utilisation. - Une fois que toutes les constructions PDMS sont placées et raccordées électriquement à la plate-forme, ramener la plate-forme dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Connectez la source électrique et mécanique.
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Configurer le programme de stimulation. Spécifier des régimes de stimulation électrique et mécanique via les interfaces utilisateur du stimulateur électrique et de l’application, qui contrôle la stimulation mécanique. Définissez le synchronisme comme suit.
- Allumez le stimulateur électrique. Attendez que le menu principal sur l’affichage.
- Puis, sélectionnez Option 2 : modifier la séquence + entrée.
- Modifier la séquence de Menu comme suit.
- Utilisez l’onglet Mode pour sélectionner la tension ou courant. Sélectionnez actuel en cliquant sur + et appuyez sur entrée.
- Pour l’Amplitude onglet, sélectionnez 1 (mA) avec +/- et appuyez sur entrée.
- Pour la Période (T), 1000 (ms) avec +/- , presser Enter.
- Réglez la durée de l’impulsion (Tw) sur 2 (ms) avec +/- et appuyez sur entrée.
- Pour l’onglet mode de déclenchement , sélectionnez externe par le logiciel et appuyez sur entrée.
- Retour dans le menu principal, sélectionnez Option 4 : générer la séquence et appuyez sur entrée.
Remarque : Le stimulateur électrique repose dans l’attente jusqu'à ce qu’il reçoit une commande de déclencheur de l’application de stimulateur mécanique via le port série.
- Effectuez les opérations suivantes dans la section de stimulation mécanique du panneau application (Figure 2C).
- Écrire 1 000 (ms) dans le contrôle de texte de Période d’impulsion .
- Écrire 500 (ms) dans le contrôle de texte ON time (Tw) pour définir la durée de l’impulsion mécanique.
- Écriture 2 000 (UA) dans le contrôle de texte Excursion pour livrer un allongement de la construction de 10 %. C’est le nombre d’étapes dans le moteur de commande linéaire.
Remarque : Le protocole de stimulation appliqué ici consistant en courant alternatif 2 ms monophasiques impulsions d’ondes carrées de 50 mV/cm à 1 Hz et 10 % qui s’étend sur 7 jours. Les temps de montée et la chute de l’impulsion mécanique sont fixés à 100 ms, d’imiter à peu près la forme de l’impulsion de pression du foyer. En outre, le mode de répétition est défini sur continue et il y a un compteur affichant le nombre d’impulsions.
- Allumez le stimulateur électrique. Attendez que le menu principal sur l’affichage.
- Modifier les médias 2 x par semaine (lundi et jeudi après-midi). Tout d’abord, enlever les anciens médias ; Ensuite, ajoutez les médias chauds sur les côtés du support PDMS, jamais directement sur la piscine de la cellule.
Remarque : Si les cellules ont un taux de croissance élevés, les médias doivent être changé 3 x par semaine (par exemple, lundi, mercredi et vendredi). Il est nécessaire de débrancher et rebrancher tous les câbles, mais il n’y a aucun besoin d’enlever les plaques de culture et les électrodes de leur place. - Recueillir les échantillons après que l’expérimentation ne soit effectuée.
4. PRELEVEMENT à la fin de l’expérimentation (jour 7)
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Pour les analyses de RNA
- La construction de lavage 2 x avec 3 mL de PBS 1 x pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 3 mL de 0.05 % trypsine-EDTA à chaque plat (assez pour couvrir tout l’assemblage) et attendre 5 min à 37 ° C.
- Après que les cellules sont individuelles, ajouter 2 mL de milieu complet pour inactiver la trypsine-EDTA.
- Recueillir toutes les cellules dans un 15 mL tube et laver la construction 2 x avec 3 mL de PBS pour recueillir les cellules restantes.
- Centrifuger à 230 x g pendant 5 min à 22 ° C.
- Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL de PBS.
- Transférer la solution de cellules dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 230 x g pendant 5 min.
- Retirez le surnageant et stocker le culot à-80 ° C à 700 µL de réactif de lyse d’autres ARN.
- Isoler l’ARN à l’aide d’une trousse commerciale, suivant les instructions du fabricant.
- Inverse-transcrire l’ARN isolé à l’aide de la trousse et hexamères aléatoire, selon le protocole du fabricant.
- Pour les faibles concentrations de RNA, preamplify et ensuite, diluer 1:5 avec de l’eau exempte de RNase avant transcription inverse en temps réel les PCR (RT-PCR) est effectuée. Continuer avec le protocole standard pour la RT-PCR en temps réel et vérifier les principaux marqueurs cardiaques.
NOTE : Les marqueurs cardiaques typiques comprennent des marqueurs précoces et tardives de différentes catégories, telles que les facteurs de transcription cardiaque (axée sur les myocytes enhancer facteur 2 a [MEF2A], protéine GATA-4 [GATA-4]) et structurels (troponine cardiaque je [TNIC], cardiaque troponine T [cTnT], α-actinine) et régulation du calcium (Connexin43 [Cx43], sarco-/ réticulum endoplasmique Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. Isolement de protéine aussi peut être effectuée que si nécessaire. Simultanée isolement d’ARN et de protéine peut être effectuée avec le même échantillon, à l’aide de réactifs commercialement disponibles et nécessaires (Table des matières) si la quantité de l’échantillon est inférieure.
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Pour immunostainings
Remarque : Ceci est réalisé directement sur les cellules attachés à la piscine de la cellule de la construction PDMS. Par conséquent, nous recommandons de placer, à chaque fois, couvercle de 1 cm x 1 cm de film de paraffine sur le dessus de la piscine de la cellule, en dehors de la plaque, pour minimiser l’évaporation des solutions d’incubation.- La construction de lavage 2 x avec 3 mL de PBS pendant 5 min à température ambiante.
- Fixer les cellules attachés à la construction avec 2 mL de formol 10 % pendant 15 min à température ambiante.
- Laver les cellules 3 x 3 ml de PBS pendant 5 min à température ambiante. Pour le stockage à long terme, laisser les échantillons dans du PBS avec 0,1 % d’azide de sodium à 4 ° C.
- Permeabilize les cellules avec 3 mL de PBS + 0,5 % de détergent (3 x, chaque fois 5 à 10 minutes, à température ambiante).
- Incuber les cellules avec 100 µL de PBS + 10 % de sérum de cheval, 1 % d’albumine sérique bovine à température ambiante pendant 1 h, + 0,2 % de détergent pour bloquer la liaison de l’anticorps non spécifiques.
- Incuber les cellules avec 100 µL de PBS + 10 % de sérum de cheval + 0,2 % de détergent + 1 % d’albumine sérique bovine, l’anticorps primaire à température ambiante pendant 1 h. Par exemple, les anticorps primaires contre Cx43 (au 1/100), du sarcomère α-actinine (au 1/100), GATA-4 (01:50), MEF2 (01:25) et SERCA2 (01:50).
- Laver 3 fois avec 3 mL de PBS à température ambiante pendant 5 min.
- Incuber les cellules avec 100 µL de PBS + anticorps secondaire dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante.
Remarque : Anticorps secondaires conjugués avec des fluorophores différents et un agent de counterstaining ont été utilisés. - Laver 3 x avec 3 mL de PBS dans l’obscurité pendant 5 min à température ambiante.
- Incuber les cellules avec 100 µL de nucléaire coloration (0,1 µg/mL) dans du PBS à température de la pièce dans l’obscurité pendant 15 min.
- Laver 3 x avec 3 mL de PBS dans l’obscurité pendant 5 min à température ambiante.
- Stocker les échantillons dans 3 mL de PBS avec 0,1 % d’azide de sodium à 4 ° C jusqu'à l’acquisition.
Remarque : Acquisition de microscope est possible sur des microscopes inversés fluorescents et confocale avec objectifs de distance de long-travail parce que l’épaisseur de la construction est d’environ 0,5 mm.
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Representative Results
La figure 2 représente le schéma général suivi pour la stimulation des cellules. Brièvement, les cellules ont été ensemencées sur la construction PDMS et soumis à une stimulation électromécanique, avec un changement de support effectué deux fois par semaine. Les cellules stimulées ont été utilisés comme un contrôle pour la climatisation electromecanique. En outre, nous avons ajouté un contrôle supplémentaire à l’expérience, et ATDPCs sous-cutanée ont servi un contrôle cardiaques ATDPCs. ATDPCs sous-cutanées sont obtenus à partir du tissu adipeux sous-cutané, suivant les mêmes procédures d’isolement et de la culture en ce qui concerne les cardiaques ATDPCs33. Cellules attachés à la construction PDMS mis en évidence un phénotype typique fusiforme, avant et après stimulation. En outre, les cellules alignement selon la surface à motifs, dans ce cas suivant le modèle vertical.
Les stimulations électriques et mécaniques ont été optimisées tout d’abord individuellement. Tout d’abord, l’électrostimulation reposait sur une étude antérieure dans laquelle monophasique courant alternatif 2 ms impulsions d’ondes carrées de 50 mV/cm à 1 Hz ont été jugées meilleures pour cardiaque ATDPCs10. Nous avons signalé que la stimulation électrique a augmenté l’expression de marqueurs cardiaques précoces en ATDPCs cardiaques, tels que MEF2A (P = 0,050) et GATA-4 (P = 0,031), mais a observé aucun effet sur les gènes structures et calcium-manutention (données non présentées) .
En second lieu, le protocole mechanostimulation se composait de 10 % qui s’étend et une forme d’onde trapézoïdale 1 Hz avec un cycle d’utilisation de 50 %, avec une hausse de 100 ms, et le cycle de chute fois à imiter la pression au cœur, comme décrit dans intégrale après21. ATDPCs cardiaques stimulées mécaniquement augmentée de l’expression des gènes structuraux, tels que le α-actinine (P = 0,001) ou cTnI (P = 0.044) et a montré une tendance à la hausse pour les marqueurs cardiaques précoces, GATA-4 (P = 0,068) et T-box facteur de transcription 5 (Tbx5 ; P = 0,065) (données non présentées). Effets de stimulation mécanique ont été fortement dépendants de la surface à motifs.
Par la suite, les deux protocoles ont été combinées pour une stimulation efficace électromécanique de ATDPCs cardiaques, ressemblant à remplissage ventriculaire par le sang. Le protocole qui en résulte comprend courant alternatif 2 ms monophasiques impulsions d’ondes carrées de 50 mV/cm à 1 Hz et 10 % qui s’étend sur 7 jours,30. Dans l’ensemble, électromécanique stimulées ATDPCs cardiaques amélioré leur cardiomyogénique potentiel. ATDPCs cardiaques stimulées augmenté l’expression de tôt ou tard gènes cardiaques (Figure 3A), à savoir, le facteur de transcription cardiaque GATA-4 (P = 0,050), la chaîne lourde de la β-myosine de marqueur structural (β-MHC ; P = 0.000) et le gène Cx43 calcium liés (P = 0,025). Des modulations de gène résultant de la stimulation électromécanique étaient traduites au niveau protéine (Figure 3B-M). Phalloïdine coloration contre les fibres d’actine a montré que la majorité des cellules alignées selon le modèle vertical et que la répartition de Cx43 était principalement dans le cytoplasme et la membrane plasmique, de contribuer à la communication intercellulaire via gap jonctions (Figure 3B-E). MEF2 et facteurs de transcription GATA-4 étaient situées à noyaux de ATDPCs cardiaques ; Cependant, GATA-4 n’a pas été détecté dans ATDPCs sous-cutanée (Figure 3,F-M). Les marqueurs cytoplasmiques SERCA2 et α-actinine sarcomère n’a pas montré une organisation mature sarcomère typique des cardiomyocytes et coups n’a été observée dans le contrôle et stimulée par les populations de cellules (Figure 3,F-M).
Figure 2 : Stimulation électromécaniques procédure, unité et l’interface utilisateur. (A) schéma de stimulation électromécaniques avec des images représentant des cellules stimulées au jour J0 et cellules stimulées au jour 7, toutes deux sur des constructions avec le motif de surface verticale. Barreaux de l’échelle = 100 µm. (B) de l’appareil électromécanique de stimulation : graines PDMS construct, électrodes et aimants fixes ou mobiles. (C) panneau d’application pour la stimulation mécanique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Expression génique et protéique des principaux marqueurs cardiaques après la stimulation électromécanique de ATDPCs cardiaques et sous-cutanée. (A) PCR en temps réel des principaux gènes cardiaques en ATDPCs cardiaques et sous-cutanée. L’expression relative cardiomyogénique marqueurs stimulée par rapport aux contrôles nonconditioned figure ATDPCs cardiaques et sous-cutanée. Les valeurs ont été normalisées à l’expression de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase et apparaissent en moyenne ± SEM pour six expériences indépendantes. P < 0,05 (signification). (B - M) Expression de la protéine en ATDPCs cardiaques et sous-cutanée sur une expression à la surface verticale à motifs principaux marqueurs cardiaques pour le contrôle et les cellules stimulées. Phalloïdine coloration (actinF ; rouge) et Cx43 expression (vert), SERCA2 (rouge), MEF2 (vert), α-actinine sarcomère (rouge) et l’expression de GATA-4 (vert) dans le contrôle (dans les groupes B, D, F, H, Jet L ) et cardiaque stimulée (dans les groupes C, E, G, I, Ket M) (à gauche) et ATDPCs (à droite) sous-cutanée. Les noyaux étaient eosine au DAPI (bleu ; panneaux B - E, Let M). Les barres d’échelle = 50 µm. Ce chiffre a été modifié par Llucià-Valldeperas Al30. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La stimulation électromécanique semble être une alternative sûre pour préparer des cellules pour un environnement hostile cardiaque et renforcer leur engagement cardiaque. Ici, un protocole décrit pour cellules souches cardiaques a augmenté l’expression de marqueurs cardiaques principales et a été rapporté pour être bénéfique pour leur prochaine implantation le myocarde murin infarci30. En général, électromécanique stimulées ATDPCs cardiaques a augmenté l’expression de gènes liés à tôt, structurels et régulation du calcium, qui n’a jamais été réalisée avec des stimulations électriques ou mécaniques précédentes individuellement. En fait, cardiaque électro-mécaniquement stimulée ATDPCs montrent un profil plus complet et semblait être plus engagé à la lignée cardiaque que ceux rapportés antérieurement.
Expression génétique cardiaque a été modulée dans les deux types de cellules après stimulation électromécanique, surtout après l’augmentation notable de la ATDPCs cardiaques par rapport à ATDPCs sous-cutanée. Ce résultat peut avoir été une conséquence de l’origine du tissu adipeux utilisé pour isoler les cellules, à savoir, la graisse épicardique ou sous-cutanée, respectivement. Le tissu adipeux épicardique entourant le cœur et le péricarde est un organe métaboliquement actif et une source de cellules progénitrices. D’intérêt, la graisse épicardique a continuité anatomique et fonctionnelle avec le myocarde. Dans des circonstances normales, la graisse épicardique possède des propriétés cardioprotectrices thermogénique et biochimiques ; à l’inverse, dans des conditions pathologiques, il peut sécréter des cytokines proinflammatoires pour affecter le coeur39. En effet, ATDPCs cardiaques ont un phénotype cardiaque comme inhérent et présentent une expression constitutive de marqueurs cardiaques, comme les Cx43, α-actinine sarcomère, SERCA2 et GATA-4, par rapport à ATDPCs sous-cutanée, qui ne sont pas adaptés pour les cardiaques environnement,34. Ainsi, les effets dérivés de stimulation électromécanique peuvent être supérieur pour les progéniteurs cardiaques, dont la niche est proche d’ou dans le milieu du myocarde.
Depuis la dernière observation qui gène modulation dépend fortement de la population cellulaire, une optimisation de protocole pour chaque population cellulaire est conseillée, et valeurs approximatives peuvent être extraites de celles décrites dans le présent protocole. Les étapes plus critiques dans la stimulation des cellules électromécaniques sont des régimes d’attachement et de la stimulation cellulaire (intensité, durée, fréquence).
Par exemple, les paramètres électriques sont indispensables. En effet, l’intensité du champ électrique appliquée était optimale pour une cellule non électriques, donc une augmentation des valeurs serait plus appropriés pour les cellules avec une activité électrique, tels que les immatures pluripotentes cardiomyocytes dérivés tige-cellule40,41 . Expérimentation préliminaire pour cardiaque ATDPC électrostimulation a démontré qu’un courant continu et une haute tension induite par arrêt de la croissance cellulaire et de mort cellulaire10. D’après ces résultats, des protocoles courant alternatif et à basse tension ont été adoptés pour l’expérimentation supplémentaire.
En outre, certaines lignées de cellules présentent un faible attachement à la surface PDMS, donc un revêtement ou un traitement plasma est proposé afin d’enrichir les semis efficacité42. En outre, ensemencement de la cellule doit être adaptée à chaque taille des cellules et la croissance, diminuant les valeurs pour les cellules hautement prolifératives ou en les augmentant de cellules plus petites ; ainsi, quelques essais semis plusieurs densités sur la construction PDMS sont recommandés. Enfin, le protocole a été réalisé sur une monocouche de cellules, et de valeurs peuvent être légèrement différents pour un scénario en trois dimensions (i.e., la densité cellulaire).
En outre, le motif de surface joue un rôle clé dans la formation de cellules mécaniques. Il a été démontré que les cellules alignement selon le modèle et leur performance après qu’une stimulation mécanique n’a pas la même entre les différentes surfaces. Par exemple, mécaniquement stimulé cardiaque ATDPCs ensemencées sur protéines de surfaces verticales à motifs (perpendiculaire à la force d’étirement) sécrétées associée à l’infarctus du myocarde et remodelage des motifs de la matrice extracellulaire. Mechanostimulated cardiaque ATDPCs ensemencées sur surfaces enduits des protéines sécrétées associés à la régénération cardiaque21.
Les principales caractéristiques de cette méthode ont été décrites ci-dessus. Toutefois, il est important de souligner l’approche non invasive de la cellule qui s’étend comme une des méthodes uniques afin de réaliser ces aspects. D’intérêt, parce que le même appareil peut présenter des stimuli électriques et/ou mécaniques, une comparaison directe des effets qui en résultent des cellules et des stimulations différentes est possible. En outre, la visualisation des cellules ensemencées sur la construction, grâce à la transparence et finesse, est un avantage évident à évaluer l’état de la cellule avant, pendant et après la stimulation.
L’appareil et le protocole ont certaines limites, certains d'entre eux ont déjà fait remarquer. Tout d’abord, il a été conçu et optimisé pour une culture de cellules de monocouche et non pour une culture de cellules en trois dimensions. Plus précisément, seules les cellules adhérentes peuvent être utilisés dans le cadre de la monocouche. Pour les cellules non adhérentes, il faut appliquer une approche tridimensionnelle. Deuxièmement, la taille de construction limite la surface de semis ; ainsi, le nombre de cellules stimulées est petit, et chaque ensemble expérimental nécessite plusieurs répétitions de recueillir suffisamment d’échantillons pour approfondir les analyses de gène ou protéine. Une intensification est obligatoire pour la grande expérimentation animale ou traduction clinique, dans laquelle des doses plus élevées de cellules sont nécessaires ; dans de tels cas, on peuvent considérer les plus grandes surfaces de stimulation.
Les principales applications du présent protocole comprennent climatisation cellule, modélisation de la maladie et dépistage des drogues. Cette stimulation améliore la maturation des cellules, et son application serait utile pour atteindre et maintenir un phénotype plus mature. D’une part, les cellules qui imitent le phénotype fonctionnel présent dans le myocarde adult sont indispensables à la modélisation de maladies et d’expérimentation de l’orgue-on-a-chip. En effet, les biopsies humaines ne peut pas représenter la progression de la maladie parce qu’ils sont habituellement des échantillons terminale ou post-mortem, tandis que les modèles animaux récapituler pas toujours symptomatologie et la physiologie humaine. Néanmoins, l’utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme est devenue une méthode de modélisation alternative pour démêler le mécanisme sous-jacent pathologie développement43. En outre, les organes-on-a-chip sont miniature tissus et les organes cultivées in vitro qui permettent la modélisation de la physiologie de l’homme (patho) et imitent les structures tridimensionnelles. Leur but est d’établir une unité fonctionnelle minimale qui peut récapituler certains aspects de la physiologie humaine et la maladie de manière contrôlée et simple et de pallier les lacunes des cellules existantes et des modèles animaux44.
En revanche, dépistage des drogues exige des plates-formes de culture qui imitent l’environnement biophysique présent jen vivo dans un haut-débit, système miniaturisé pour tester l’innocuité et l’efficacité des médicaments par l’intermédiaire de réponse cardiomyocyte. Cellules matures pourraient être utilisés pour récapituler une lecture cliniquement pertinente (je. e., de la cinétique contractile) dans un essai de haut-débit, pour élucider les mécanismes de la maladie et identifier roman thérapeutique cible45.
Le champ cardiaque était le principal champ d’application du présent protocole, mais il pourrait s’adapter facilement à domaines neuronales ou squelettiques car ces milieux est caractérisés par des stimuli électriques et mécaniques. Des études antérieures avec les stimulations physiques ont indiqué des résultats bénéfiques46,47,48,49,50.
En conclusion, un nouveau protocole pour le conditionnement électromécanique synchrone de ATDPCs cardiaques a été décrite. Le protocole qui en résulte et l’appareil ont largement testés et validé pour les stimuli individuels et synchronisés. Synchrone conditionnement électromécanique de ATDPCs augmente leur potentiel cardiomyogénique et apparaît comme une stratégie prometteuse pour la thérapie cellulaire, modélisation de la maladie et dépistage des drogues.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer, sauf que l’appareil de stimulation et du protocole ont été déjà brevetés (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1).
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier les membres du programme de recherche établissement (Mechanism, Badalona) et électroniques et de groupe d’Instrumentation biomédicale (UPC, Barcelone), particulièrement Prof. J. Rosell-Ferrer. En outre, les auteurs reconnaissent cellules souches Translational Medicine journal et presse AlphaMed pour permettre l’adaptation des chiffres précédemment publiés (Llucià-Valldeperas, et al. 30). le développement de ce prototype et la conception du protocole ont été pris en charge par Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), la Commission européenne 7e Programme-cadre () RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), fondation La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) et Fundación para la Salud Innovación y la Prospectiva fr España (FIPSE ; 00001396-06-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2x | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
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