Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para a formação de uma população celular usando estímulos elétricos e mecânicos, emulando a fisiologia cardíaca. Esta estimulação eletromecânica aumenta o potencial de cardiomyogenic das células tratadas e é uma estratégia promissora para mais terapia celular, modelagem de doença e despistagem de drogas.
Abstract
Doenças cardiovasculares são a principal causa de morte nos países desenvolvidos. Consequentemente, a procura de terapias com células cardíacas eficaz tem motivado pesquisadores nos campos da bioengenharia e células-tronco para desenvolver em vitro alta fidelidade humana miocárdio para investigação fundamental e aplicações clínicas. No entanto, o fenótipo imaturo de células cardíacas é uma limitação na obtenção de tecidos que imitam funcionalmente o miocárdio adulto, que se caracteriza principalmente por sinais mecânicos e elétricos. Assim, o propósito do presente protocolo é preparar e amadurecer o populacao de celula alvo através da estimulação de Eletromecânica, recapitulando parâmetros fisiológicos. Engenharia de tecido cardíaco está evoluindo em direção a abordagens mais biológicas e estratégias baseadas em estímulos biofísicos, assim, estão ganhando impulso. O dispositivo desenvolvido para esta finalidade é único e permite individual ou simultânea elétrica e mecânica estimulação, cuidadosamente caracterizada e validado. Além disso, embora a metodologia foi otimizada para este estimulador e uma população de células específicas, facilmente pode ser adaptado para outros dispositivos e linhas celulares. Os resultados aqui oferecem evidências do compromisso cardíaco aumento da população celular após estimulação eletromecânica. Industrial estimulado as células apresentam um aumento da expressão de marcadores cardíacos principais, incluindo início, estruturais e cálcio-regulação de genes. Este condicionamento celular poderia ser útil para mais longe da terapia com células regenerativas, modelagem de doença e triagem de drogas de alto rendimento.
Introduction
Função do coração é baseada no acoplamento da excitação elétrica e a contração mecânica. Brevemente, junções intercelulares casos permitem a propagação do sinal elétrico para produzir quase síncronas contrações do coração bombear o sangue sistemicamente e através do sistema pulmonar. Células cardíacas, assim, passam por forças elétricas e mecânicas que regulam a função celular e a expressão dos genes. Nesse sentido, muitos grupos têm tentado desenvolver plataformas de cultura que imitam o ambiente fisiológico cardíaco para compreender o papel da estimulação mecânica e elétrica em desenvolvimento cardíaco, função e maturação. Em vitro estímulos elétricos e mecânicos individualmente foram aplicados extensivamente em engenharia de tecido cardíaco para melhorar propriedades funcionais, aumentar a maturação celular ou melhorar o acoplamento de célula-célula e cálcio manipulação1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. no entanto, condicionado eletromecânico síncrono permanece inexplorado devido o desafio de desenvolver um estimulador e protocolo e devido a otimização obrigatório22.
Trabalho preliminar dirigida estimulação eletromecânica como uma combinação de estimulação elétrica e perfusão de mídia; no entanto, o fluxo não envolve a deformação baseados em tensão típica de enchimento ventricular23,24,25. Mais tarde, abordagens mais fisiológicas combinados estímulos elétricos com deformação física ou estiramento para imitar o tempo contração26,,27,28,29,30 ,31. Feng et al. descreveram a primeira demonstração de estimulação Eletromecânica em 2005, comunicação aprimorada casos propriedades contráteis e tamanho26. Wang et al. pré-tratados com células-tronco mesenquimais com 5 azacytidine e aplicado simultâneo condicionado elétrico e mecânico, melhorando recellularization, viabilidade celular, diferenciação cardíaca e tecido remodelação27. Desde aquelas publicações, mais grupos têm relatado na estimulação eletromecânica de monocamadas de células ou engenharia de tecidos (por exemplo, preto28,29,de Vunjak-Novakovic31e nosso grupo30) com o primeiras células condicionadas testaram in vivo30. Brevemente, Morgan e preto testaram várias combinações de estímulos elétricos e mecânicos, relatando que o sincronismo entre estímulos foi crucial porque atrasada combinada eletromecânica estimulação rendeu os melhores resultados de28. Em seguida, Godier-Furnémont e colaboradores otimizado um protocolo de estimulação Eletromecânica para construções de músculo coração engenharia de células de coração de rato neonatal e alcançado, pela primeira vez, uma relação de força positiva-frequência29. Depois disso, nosso grupo relatou que células precondicionadas industrial aumentaram a expressão de marcadores cardíacos principais em vitro e ampla benéfica efeitos in vivo, tais como melhorar a função cardíaca ou aumentou a densidade do navio no infarto região de fronteira30. A publicação mais recente demonstrou que os tecidos cardíacos de haste-pilha-derivado cardiomyocytes sujeitos a eletromecânico condicionado alcançado uma maturação nível mais próximo ao ser humano adulto cardíaca estrutura e função de31. Além disso, plataformas alternativas estimulação tridimensional compreendem eletroativos andaimes que fornecem elétrico, mecânico, e topográficas pistas para as células anexado32. Além disso, a deformação mecânica (célula monocamada alongamento e compressão) pode também ser induzida com eletrodos stretchable, simulando as condições fisiológicas normais, bem como condições extremas33.
Portanto, a lógica é que estímulos eletromecânicos in-vitro, com base em condições fisiológicas poderiam aumentar o potencial de cardiomyogenic de uma célula. Na verdade, este estímulo poderia beneficiar ainda mais integrações de células terapêuticas para o miocárdio em um cenário clínico ou aumentar a maturação do tecido para aplicações de despistagem de drogas.
Além disso, estamos isolados e caracteriza-se uma população de células progenitoras derivadas de tecido adiposo humano de cardíaco de origem (ATDPCs cardíacas)34. Estas células estão localizadas na gordura Epicárdica. Estas células exibir efeitos benéficos de histopatológicos e funcionais no tratamento de infarto do miocárdio e também mantenham a diferenciação cardíaca e endotelial potenciais. 30 , 35. formulamos a hipótese que estes benefícios aumentaria após estimulação Biofísica.
Consequentemente, desenvolvemos um dispositivo e um regime de estimulação para a população de células de interesse e investigou os efeitos. Este protocolo eletromecânico é uma nova estratégia para induzir a célula ativa, estendendo-se de forma estéril e canaliza em comparação com anteriores Publicações36, em combinação com a estimulação do campo elétrico. A técnica aqui relatada explica em detalhe o dispositivo e o método utilizado para a estimulação elétrica, mecânica e eletromecânica de células.
Este dispositivo pode fornecer estimulação elétrica e mecânica, isoladamente ou em simultâneo. A estimulação é realizada com uma abordagem de romance não-invasiva e asséptica que inclui suporte a célula presterilized, eletrodos colocados dentro de uma placa de cultura padrão e uma plataforma que induz as forças mecânicas e elétricas (Figura 1).
A plataforma pode conter até seis cultura placas e consiste de uma estrutura de sanduíche de poly(methyl methacrylate) cortados a laser e peças de placa de circuito impresso. O protótipo de plataforma se baseia em uma combinação de um monofásico programáveis controlados por computador estimulador elétrico, uma placa de circuito impresso para a robusta conexão dos eletrodos e seis 10 x 10 mm x 5 mm niquelado fixo de neodímio ímans colocados perto de um dos lados das placas de cultura. Há também uma barra de alumínio com seis ímãs condução (mesmo modelo) colocado na frente do outro lado das placas de cultura e mudou-se com um servomotor linear. O motor é impulsionado por um controlador do motor, operado através de uma porta RS-232 por software comercial (veja a Tabela de materiais). Através da interface do usuário e estimulador programável, é possível programar a intensidade elétrica e frequência, a duração do pulso, a frequência de estimulação mecânica, seu ciclo de trabalho, o número de pulsos, a amplitude de pulso (excursão do ímã), e a inclinação.
Figura 1 : Estimulador eletromecânica. (A) PDMS construção utilizada para o acondicionamento da célula. (B) desenho de construção de PDMS, incluindo eletrodos e ímãs. (C) detalhe da placa de circuito impresso (plataforma), usada para realizar o condicionamento eletromecânico. Este painel foi modificado de Llucià-vedi et al.30. (D) imagens da estimulação eletromecânica plataforma e usuário interface (computador). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tanto o estimulador e o método para o condicionamento de eletromecânico são totalmente descritos em duas patentes internacionais, WO-2013185818-A137 e WO-2017125159-A138.
O silicone biocompatível construções projetadas para fornecer suporte estrutural para as células, eletrodos e ímãs têm sido descritos anteriormente10,21. Resumidamente, eles consistem de polidimetilsiloxano (PDMS), moldado e curado à temperatura ambiente, com um módulo de Young de 1,3 MPa, perto de níveis fisiológicos. A construção contém um pool de cultura de células em uma área de flexível (10 x 10 x 2 mm), dois slots transversais internas para manter os eletrodos e dois incorporado 6 x 2 mm x 4 mm niquelado os ímãs do neodymium. Os eletrodos são construídos com 0,2 platina fio torcido em torno de uma 2 x 3 mm x 12 mm politetrafluoretileno core bar (21 cm por eletrodo, aproximadamente 23 voltas) e colocados em lados opostos da área flexível para criar um campo elétrico por indução estimulação elétrica. Alongamento mecânico é alcançado através da atração magnética entre ímãs encaixados no suporte e externos ímãs colocados ao lado da placa de cultura e o braço de alumínio em movimento. Desta forma, o suporte do celular pode ser estendido sem quebrar a barreira estéril. Esta abordagem é adequada para uma monocamada de células, mas pode ser adaptada para construções tridimensionais, bem como.
Além disso, um padrão regular poderia ser imprimido onde as células são semeadas, usando uma grade de difração regrada (1.250 grooves/mm). A visualização direta das células cultivadas na construção de PDMS sob brightfield e microscópios fluorescentes é possível devido à sua transparência e 0,5 mm de espessura. No presente caso, a piscina de cultura PDMS tem um padrão de superfície vertical, perpendicular à força de alongamento, para alinhar as células perpendicularmente ao campo elétrico, o que minimiza o gradiente do campo elétrico através da célula.
A Figura 1 mostra uma descrição detalhada da construção e o dispositivo usado para a estimulação. Construir os PDMS e características são otimizadas para celular alongamento (figura 1A, B). O estimulador é desenvolvido e validado para a aplicação efectiva da estimulação elétrica e mecânica desejada para células anexado para a construção PDMS. Este processo inclui garantir boa operabilidade de conectividade e usuário através da interface de software (Figura 1, D).
O procedimento para a estimulação de células usando este dispositivo feito por medida é descrito na seção de protocolo.
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Protocol
Este estudo utiliza ATDPCs cardíacos humanos de amostras de pacientes. Seu uso foi aprovado pelo Comitê de ética local, e todos os pacientes deram consentimento informado. O protocolo do estudo está em conformidade com os princípios delineados na declaração de Helsinque.
1. preparações
- Autoclave de duas pinças, 12 eletrodos platina de PTFE para estimulação elétrica e toalhas de papel, a 121 ° C por 20 min.
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Esterilize 12 construções sob medidas de PDMS (Figura 1A).
- Lave cada construção com 5 mL de água destilada estéril com agitação magnética em temperatura ambiente por 15 min.
- Lave 1x com 5 mL de etanol a 70% com agitação magnética em temperatura ambiente por 5 min.
- Lave 5x com 5 mL de água destilada estéril com agitação magnética em temperatura ambiente por 10 min por lavagem, para remover resíduos de bebidas alcoólicos.
- Seque as construções em toalhas de papel estéril dentro o pernoite do armário de fluxo.
- Armazená-los em tubos de centrífuga de 50ml estéril até o uso.
2. célula de semeadura (dia -1)
- Antes célula semeadura, transferir as construções de PDMS limpas para placas estéreis e expô-los à luz ultravioleta por 5 min garantir a esterilização completa.
- Transferi cada construção para uma placa de cultura de células de 35 mm, ou placa de 6, para a propagação de célula imediata.
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Trypsinize balão T75 confluente de ATDPCs cardíacas.
- Lave o balão T75 com 5 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x.
- Adicione 1 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e incubar a 37 ° C por 5 min separar as células.
- Adicione 5 mL de meio completo para inactivar o tripsina-EDTA.
- Recolher todas as células em um tubo de 15 mL e lavar o frasco 2 x com 5 mL de PBS para coletar as células restantes.
- Centrifugar a 230 x g por 5 min a 22 ° C, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de meio completo para contá-los com a câmara de hemocytometer.
- Propagar a 200 µ l de ATDPCs cardíacos (2,5 x 105 células/mL) na piscina da célula das construções de PDMS 12 (Figura 1A, B) ter ~ 80% da superfície da semeadura coberta pelas células no dia seguinte e incubar a 37 ° C e 5% de CO2.
Nota: Após 2 – 4 h, devem ser anexadas as células. Inóculo de célula é preparado de acordo com o tamanho da célula e crescimento. Para células menores, a densidade de semeadura deve ser aumentada. - Delicadamente, adicione 2 mL de meio completo escaldado (α-MEM suplementado com 10% fetal bovino soro 1% L-glutamina e 1% penicilina-estreptomicina) por placa.
- Incube as construções em condições de cultura (geralmente 37 ° C e 5% CO2) durante a noite.
3. Eletromecânica estimulação Setup (dia 0)
- Antes de iniciar o procedimento, pegue seis construções para estimulação eletromecânica e seis como controles nonstimulated. Com menos de seis placas por estimulação, use construções vazias com o mesmo volume médio para garantir estimulação adequada de campo elétrico.
- Limpe a unidade de estimulação com 70% de etanol e coloque-o no fluxo do armário.
- Trazer o estéril eléctrodos e pinças para dentro do gabinete de fluxo.
- Remova 90% dos meios de comunicação da placa de cultura facilmente manipular a eletrodos e construções. Primeiro, coloque as construções de PDMS na posição certa para garantir a atração magnética (deslocamento de PDMS dentro da placa de cultura em direção do ímã) entre ímãs fixos e móveis. Em seguida, ligue o fio de platina para os conectores de eletrodo e a parte PTFE em seu espaço designado na construção de PDMS.
- Adicione 2,5 mL de meio fresco de completo escaldado para cada construção.
Nota: Manter a esterilidade durante todo o procedimento e operar em uma construção de cada vez. Manter o resto das construções na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 até o uso. - Uma vez que todas as construções PDMS são colocadas e eletricamente ligadas à plataforma, trazer a plataforma de volta para a incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
- Ligue a fonte de elétrica e mecânica.
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Configure o programa de estimulação. Especifica a regimes de estimulação elétrica e mecânica, por meio de interfaces de usuário do estimulador elétrico e o aplicativo, que controla a estimulação mecânica. Defina o sincronismo da seguinte forma.
- Ligue o estimulador elétrico. Espere para o menu principal aparecer no display.
- Em seguida, selecione opção 2: editar sequência + Enter.
- A sequência do Menu edite como segue.
- Use a guia de modo selecionar tensão ou corrente. Selecione atual clicando + e pressione Enter.
- Para o guia de Amplitude , selecione 1 (mA) com + /- e pressione Enter.
- Durante o Período (T), selecione 1000 (ms) , com + /- e pressione Enter.
- Definir a duração do pulso (Tw) para 2 (ms) com + /- e pressione Enter.
- Para o modo de gatilho guia, selecione externo pelo software e pressione Enter.
- Volta no menu principal, selecione opção 4: gerar sequência e pressione Enter.
Nota: O estimulador elétrico baseia-se no modo de espera até que ele recebe um comando de gatilho do aplicativo estimulador mecânico através da porta serial.
- Execute as seguintes etapas na seção de estimulação mecânica, a aplicação do painel de controle (Figura 2C).
- Escreva 1.000 (ms) no Período de pulso controle de texto.
- Escreva 500 (ms) no controle de texto no tempo (Tw) para definir a duração do pulso mecânico.
- Gravação 2.000 (AU) no controle de texto de excursão para entregar um alongamento de construção de 10%. Este é o número de passos do motor de controle linear.
Nota: O protocolo de estimulação aplicado aqui consiste em pulsos de onda quadrada 2 ms de corrente alternada monofásica de 50 mV/cm em 1 Hz e 10%, se estendendo por 7 dias. Os tempos de ascensão e queda do pulso mecânico situam-se a 100 ms para imitar mais ou menos a forma do pulso da pressão a lareira. Além disso, o modo de repetição é definido como contínuo e há um contador exibindo o número de pulsos.
- Ligue o estimulador elétrico. Espere para o menu principal aparecer no display.
- Mude a mídia 2 x por semana (segunda e quinta à tarde). Primeiro, remova a mídia velha; em seguida, adicione a mídia quente nas laterais do suporte PDMS, nunca diretamente sobre o pool de células.
Nota: Se as células têm uma alta taxa de crescimento, a mídia deve ser alterado de 3 x por semana (por exemplo, segunda, quarta e sexta-feira). É necessário desconecte e reconecte todos os cabos, mas não há nenhuma necessidade de remover as placas de cultura e eletrodos de seu lugar. - Colete as amostras após a experimentação é executada.
4. amostra coleta no final da experimentação (dia 7)
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Para análises de RNA
- Lave a construção 2x com 3 mL de 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 3 mL de 0,05% do trypsin-EDTA para cada placa (suficiente para cobrir a construção inteira) e espere por 5 min a 37 ° C.
- Depois que as células são desanexadas, adicione 2 mL de meio completo para inactivar o tripsina-EDTA.
- Recolher todas as células em um 15 mL do tubo e lavar a construção 2x com 3 mL de PBS para coletar as células restantes.
- Centrifugar a 230 x g por 5 min a 22 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de PBS.
- Transferi a solução de célula para um tubo de 1,5 mL e centrifugar 230 x g por 5 min.
- Remover o sobrenadante e armazenar a pelota a-80 ° C em 700 µ l de reagente de Lise para isolamento de RNA ainda mais.
- Isole o RNA usando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante.
- Reverso-transcrever o RNA isolado usando o kit e hexâmeros aleatórios, de acordo com o protocolo do fabricante.
- Para pequenas concentrações de RNA, preamplify e, em seguida, diluir 1:5 com água livre de RNase antes subsequente transcrição reversa em tempo real reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) é executada. Continuar com o protocolo padrão para o RT-PCR em tempo real e verificar os principais marcadores cardíacos.
Nota: Marcadores cardíacos típicos abrangem marcadores de início e finais de categorias diferentes, tais como fatores de transcrição cardíaca (2A de factor potenciador miócito específicos [MEF2A], proteína GATA-4 [GATA-4]) e estruturais (troponina cardíaca eu [cTnI], cardíaca troponina T [miocardite], α-actinin) e regulamento de cálcio (Connexin43 [Cx43], sarco-/ retículo endoplasmático Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. Isolamento da proteína também pode ser realizado se necessário. Isolamento de RNA e proteína simultâneo pode ser executado com a mesma amostra, usando reagentes disponíveis comercialmente e kits (Tabela de materiais), se a quantidade de amostra é menor.
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Por immunostainings
Nota: Isso é executado diretamente sobre as células anexadas para o pool de células da construção de PDMS. Portanto, recomendamos a colocação, cada vez, 1 x 1 cm da película de parafina no topo da piscina de celular, além da placa da tampa, para minimizar a evaporação das soluções de incubação.- Lave a construção 2x com 3 mL de PBS durante 5 min à temperatura ambiente.
- Conserte as células anexadas ao construção com 2 mL de formol a 10% por 15 min à temperatura ambiente.
- Lavar as células 3 x com 3 mL de PBS durante 5 min à temperatura ambiente. Para armazenamento a longo prazo, deixar as amostras em PBS com 0,1% de azida de sódio a 4 ° C.
- Permeabilize as células com 3 mL de PBS + 0,5% de detergente (3x, cada um tempo de 5 a 10 min, à temperatura ambiente).
- Incube as células com 100 µ l de PBS + 0,2% de detergente + 10% de soro de cavalo, albumina de soro bovino 1% à temperatura ambiente durante 1 h, para bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos.
- Incube as células com 100 µ l de PBS + 10% de soro de cavalo + 0,2% de detergente + 1% albumina de soro bovino, anticorpo primário à temperatura ambiente durante 1 h. Por exemplo, os anticorpos primários contra Cx43 (1: 100), sarcomero α-actinin (1: 100), GATA-4 (01:50), MEF2 (01:25) e SERCA2 (01:50).
- Lave 3x com 3 mL de PBS em temperatura ambiente por 5 min.
- Incube as células com 100 µ l de PBS + anticorpo secundário à temperatura ambiente no escuro durante 1 h.
Nota: Anticorpos secundarios conjugados com diferente fluorophores e um agente counterstaining foram usados. - Lave-os 3 x com 3 mL de PBS em temperatura ambiente no escuro por 5 min.
- Incube as células com 100 µ l de nuclear de coloração (0,1 µ g/mL) em PBS a temperatura ambiente no escuro por 15 min.
- Lave-os 3 x com 3 mL de PBS em temperatura ambiente no escuro por 5 min.
- Armazene as amostras em 3 mL de PBS com 0,1% de azida de sódio a 4 ° C até a aquisição.
Nota: Aquisição de microscópio é possível em microscópios invertidos fluorescentes e confocal com objectivos de distância longa-trabalho porque a espessura da construção é de cerca de 0,5 mm.
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Representative Results
A Figura 2 representa o esquema geral seguido para a estimulação da célula. Brevemente, as células foram semeadas na construção de PDMS e submetidas à estimulação eletromecânica, com uma mudança de mídia realizada duas vezes por semana. Células nonstimulated foram usadas como um controle para o condicionamento eletromecânico. Além disso, nós adicionamos um controle extra para o experimento, e ATDPCs subcutâneas foram usados como um controle para ATDPCs cardíacas. ATDPCs subcutâneos são obtidos do tecido adiposo subcutâneo, seguindo os mesmos procedimentos de isolamento e cultura quanto cardíaca ATDPCs33. Células anexadas ao PDMS construção evidenciado um fenótipo típico fusiforme, antes e após a estimulação. Além disso, as células alinhadas de acordo com a superfície padronizada, neste caso, seguindo o padrão vertical.
Estímulos elétricos e mecânicos, primeiro foram otimizados individualmente. Primeiro, eletroestimulação foi baseada em um estudo anterior em que 2 ms de corrente alternada monofásica pulsos de onda quadrada de 50 mV/cm a 1 Hz foram encontrados para ser melhor para cardíaca ATDPCs10. Informamos que a estimulação elétrica aumentou a expressão dos marcadores cardíacos cedo em ATDPCs cardíacas, tais como MEF2A (P = 0.050) e GATA-4 (P = 0,031), mas sem efeitos nos genes estruturais e manipulação de cálcio foram observados (dados não mostrados) .
Em segundo lugar, o protocolo de mechanostimulation consistia em 10% de alongamento e uma forma de onda trapezoidal 1 Hz com um ciclo de trabalho de 50%, com aumento de 100 ms e ciclo de tempos de queda para imitar a pressão no coração, como descrito em cheio antes de21. Estimulados mecanicamente ATDPCs cardíacas aumentada a expressão de genes estruturais, tais como α-actinin (P = 0,001) ou cTnI (P = 0,044) e mostrou uma tendência crescente para marcadores cardíacos iniciais, GATA-4 (P = 0.068) e T-box fator de transcrição 5 (Tbx5; P = 0.065) (dados não mostrados). Efeitos derivados de estimulação mecânica dependiam fortemente a superfície padronizada.
Depois, ambos os protocolos foram combinados para uma estimulação eficiente eletromecânica de ATDPCs cardíacas, assemelhando-se ventrículo-enchimento por sangue. O protocolo resultante composta por pulsos de onda quadrada 2 ms de corrente alternada monofásica de 50 mV/cm em 1 Hz e 10%, se estendendo por 7 dias,30. Em geral, ATDPCs cardíacas industrial estimulados aprimorado seu cardiomyogenic potencial. ATDPCs cardíacas estimuladas aumentaram a expressão de cedo e tarde cardíacas genes(Figura 3),ou seja, o fator de transcrição cardíaca GATA-4 (P = 0.050), a cadeia pesada de miosina β marcador estrutural (β-MHC; P = 0.000) e o gene relacionados ao cálcio Cx43 (P = 0,025). Modulações de gene resultantes da estimulação eletromecânica também foram traduzidas no nível de proteína (Figura 3B-M). Faloidina coloração contra fibras de actina, mostrou que a maioria das células alinhadas de acordo com o padrão vertical e que a distribuição de Cx43 foi principalmente no citoplasma e na membrana plasmática, contribuir para a comunicação intercelular através de lacuna junções (Figura 3B-E). MEF2 e fatores de transcrição GATA-4 localizavam-se em núcleos em ATDPCs cardíacas; no entanto, a GATA-4 não foi detectado em ATDPCs subcutâneos (Figura 3F-M). Os marcadores citoplasmáticos SERCA2 e sarcomero α-actinin não mostrou uma organização madura sarcômero típico para cardiomyocytes e espancamento não foi observado no controle e estimulou a populações de células (Figura 3F-M).
Figura 2 : Estimulação eletromecânica procedimento, unidade e interface de usuário. (A) esquema de estimulação Eletromecânica com imagens representativas de células nonstimulated no dia 0 e células estimuladas no dia 7, ambos em construções com o padrão de superfície vertical. Barras de escala = 100 µm. (B) unidade de estimulação eletromecânica: semeado PDMS construção, eletrodos e ímãs fixo/móvel. (C) painel de controle do aplicativo para a estimulação mecânica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Expressão de Gene e proteína dos principais marcadores cardíacos após a estimulação eletromecânica da ATDPCs cardíacas e subcutâneas. (A) real-time PCR de genes cardíacos principais em ATDPCs cardíacas e subcutâneos. A expressão relativa de cardiomyogenic marcadores em estimulada contra controles nonconditioned é mostrado para ATDPCs cardíacas e subcutâneos. Os valores foram normalizados para expressão de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e são apresentados como média ± SEM para seis experimentos independentes. P < 0,05 (significado). (B - M) Expressão de proteínas em ATDPCs cardíacas e subcutâneas em uma expressão de superfície vertical-modelados de marcadores cardíacos principais para o controle e as células estimuladas. Faloidina coloração (actinF; vermelho) e a expressão de Cx43 (verde), SERCA2 (vermelho), MEF2 (verde), sarcomero α-actinin (vermelho) e expressão de GATA-4 (verde) no controle (em painéis, B, D, F, H, Je L ) e estimulada (em painéis C, E, G, I, Ke M) cardíaca (à esquerda) e ATDPCs (à direita) subcutâneas. Núcleos eram counterstained com DAPI (azul; painéis B - E, Le M). As barras de escala = 50 µm. Esta figura foi modificada de Llucià-vedi et al.30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Estimulação eletromecânica parece ser uma alternativa segura para preparar células para um ambiente hostil e cardíaco e reforçar seu compromisso cardíaco. Aqui, um protocolo descrito para as células progenitoras cardíacas aumentou a expressão de marcadores cardíacos principais e foi relatado para ser benéfico para a sua próxima implantação no miocárdio murino enfartado30. Em geral, industrial estimulados ATDPCs cardíacas aumentaram a expressão de genes relacionados a cedo, estruturais e regulamento de cálcio, que nunca foi alcançado com estímulos elétricos ou mecânicos anteriores individualmente. Na verdade, industrial estimulado cardíaco ATDPCs mostrar um perfil mais completo e parecia ser mais comprometida com a linhagem cardíaca do que relatado anteriormente.
Expressão gênica cardíaca foi modulada em ambos os tipos de célula após estimulação eletromecânica, especialmente após o notável aumento da ATDPCs cardíacas em comparação com ATDPCs subcutâneos. Este resultado pode ter sido uma consequência da origem do tecido adiposo utilizado para isolamento de célula, ou seja, gordura Epicárdica ou subcutânea, respectivamente. O tecido adiposo epicárdico, envolvendo tanto o coração e o pericárdio é um órgão metabolicamente ativo e uma fonte de células progenitoras. De interesse, a gordura Epicárdica tem continuidade anatômica e funcional com o miocárdio. Em circunstâncias normais, a gordura Epicárdica tem propriedades bioquímicas e termogênico cardioprotetores; por outro lado, sob condições patológicas, isso pode secretar cytokines proinflammatory para afetar o coração39. Com efeito, ATDPCs cardíacas têm um fenótipo cardíaco como inerente e exibem uma expressão constitutiva de marcadores cardíacos, tais como Cx43, sarcomero α-actinin, SERCA2 e GATA-4, em comparação com ATDPCs subcutâneos, que não são adaptados para o cardíaco ambiente,34. Assim, os efeitos derivados de estimulação eletromecânica podem ser maiores para as células progenitoras cardíacas, cujo nicho está perto ou dentro do meio do miocárdio.
Desde a última observação na qual gene modulação depende fortemente de população celular, aconselha-se uma otimização de protocolo para cada população de células, e valores aproximados podem ser extraídos das descritas no presente protocolo. Os passos mais críticos na estimulação eletromecânica de célula são regimes celular acessório e estimulação (intensidade, duração, frequência).
Por exemplo, os parâmetros elétricos são cruciais. Com efeito, a intensidade do campo elétrico aplicada foi otimizada para uma célula nonelectric, para que valores de aumento seria mais apropriados para células com atividade elétrica, tais como imaturas pluripotentes células-tronco-derivadas cardiomyocytes40,41 . Experimentos preliminares para eletroestimulação cardíaca de ATDPC demonstraram que uma corrente contínua e uma alta tensão induzida por prisão de crescimento de célula e de morte celular10. Nesses resultados, adoptaram-se protocolos de corrente alternada e de baixa voltagem para novas experiências.
Além disso, algumas linhagens de células apresentam uma fixação baixo para a superfície PDMS, então um revestimento ou um tratamento de plasma é sugerido para enriquecer a semeadura de eficiência42. Além disso, a célula semeadura deve ser adaptado para cada tamanho de célula e crescimento, diminuindo os valores das células altamente proliferativa ou aumentá-los para células menores; assim, recomenda-se alguns ensaios semeadura várias densidades na construção de PDMS. Finalmente, o protocolo foi realizado em uma monocamada de células, e valores podem ser ligeiramente diferentes para um cenário tridimensional (isto é, a densidade de células).
Além disso, o padrão de superfície desempenha um papel fundamental na formação de mecânico de célula. Foi demonstrado que as células alinhadas de acordo com o padrão e seu desempenho após estimulação mecânica não foi o mesmo entre diferentes superfícies. Por exemplo, estimulado mecanicamente cardíaco ATDPCs semeados em proteínas de superfícies com estampas vertical (perpendicular à força de alongamento) secretadas associado com infarto do miocárdio e motivos de remodelação da matriz extracelular. Mechanostimulated cardíaca ATDPCs semeado na nonpatterned superfícies secretadas proteínas associadas com regeneração cardíaca21.
As principais características desse método tem sido descritas acima. No entanto, é importante destacar a abordagem não-invasiva da célula, estendendo-se como um dos métodos para alcançar estas características únicos. De interesse, porque o mesmo dispositivo pode apresentar estímulos eléctricos e/ou mecânicos, uma comparação direta dos efeitos resultantes de diferentes estímulos e células é possível. Além disso, a visualização das células semeado na construção, graças à transparência e magreza, é uma clara vantagem para avaliar o status da célula, antes, durante e após a estimulação.
O dispositivo e o protocolo têm algumas limitações, alguns deles já observou. Primeiro, foi projetado e otimizado para uma cultura de células monocamadas e não para uma cultura de pilha tridimensional. Especificamente, apenas células aderentes podem ser usadas na configuração de monocamada. De células, de uma abordagem tridimensional deve ser implementada. Em segundo lugar, o tamanho de construção limita a superfície de semeadura; assim, o número de células estimuladas é pequeno, e cada conjunto experimental requer várias repetições para coletar suficiente amostras para análises mais gene ou a proteína. Uma escala-up é obrigatória para grande experimentação animal ou tradução clínica, em que doses mais elevadas de célula são necessárias; em tais casos, podem ser consideradas maiores superfícies de estimulação.
As principais aplicações do presente protocolo incluem célula condicionado, modelagem de doença e despistagem de drogas. Esta estimulação aumenta a maturação da célula, e sua aplicação seria útil para alcançar e manter um fenótipo mais maduro. Por um lado, as células que imitam o fenótipo funcional presente no miocárdio adulto são cruciais para a modelagem de doença e órgão-em-um-microplaqueta experimentação. Com efeito, biópsias humanas não podem representar a progressão da doença, porque eles são geralmente amostras fase final ou post-mortem, enquanto modelos animais não sempre recapitular sintomatologia e fisiologia humana. No entanto, o uso de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem tem emergido como um método de modelagem alternativa para desvendar o mecanismo subjacente patologia desenvolvimento43. Além disso, órgãos-em-um-microplaqueta são diminutos tecidos e órgãos cultivados in vitro que permitem a modelagem de fisiologia humana (patho) e imitam as estruturas tridimensionais. O seu objectivo é estabelecer uma unidade minimamente funcional que pode recapitular a certos aspectos da fisiologia humana e doença de uma forma simples e controlada e resolver as limitações de célula existente e modelos animais44.
Por outro lado, triagem de drogas requer plataformas de cultura que imitam o ambiente biofísico presente eun vivo em uma alta produtividade, sistema miniaturizado para a segurança e a eficácia de medicamentos via resposta de casos de teste. Células maduras poderiam ser usadas para recapitular uma leitura clinicamente relevante (eu. e., cinética contrátil) em um ensaio de alto rendimento elucidar os mecanismos da doença e identificar romance terapêutico alveja45.
O campo cardíaco foi o principal escopo do presente protocolo, mas poderia facilmente ser adaptado para domínios neuronais ou esqueléticos porque esses ambientes são caracterizados por estímulos elétricos e mecânicos. Estudos anteriores com estímulos físicos indicaram resultados benéficos46,47,,48,,49,50.
Em conclusão, foi descrito um novo protocolo para o condicionamento de eletromecânico síncrono de ATDPCs cardíacas. O protocolo resultante e o dispositivo foram extensivamente testados e validados para estímulos individuais e sincronizados. Síncrono condicionado eletromecânico de ATDPCs aumenta o seu potencial de cardiomyogenic e emerge como uma estratégia promissora para terapia celular, modelagem de doença e despistagem de drogas.
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Disclosures
Os autores têm nada divulgar, exceto que o dispositivo de estimulação e protocolo anteriormente foram patenteados (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1).
Acknowledgments
Os autores querem agradecer aos membros do programa de pesquisa ICREC (IGTP, Badalona) e grupo de instrumentação biomédica (UPC, Barcelona), especialmente Prof J. Rosell-Ferrer e eletrônica. Além disso, os autores reconhecem diário de medicina translacional de células-tronco e AlphaMed Press para permitir a adaptação das figuras previamente publicadas (Llucià-vedi, et al 30). o desenvolvimento deste protótipo e o design do protocolo foram apoiadas pelo Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y competitividade (SAF 2014-59892), a Comissão Europeia 7º programa-quadro ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) e Fundación para la Innovación y la Prospectiva en de Salud en España (FIPSE; 06-00001396-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2x | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
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