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Bioengineering

एक साथ विद्युत और यांत्रिक उत्तेजना कोशिकाओं ' Cardiomyogenic क्षमता बढ़ाने के लिए

Published: January 18, 2019 doi: 10.3791/58934
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4,5,6
1Insuficiencia Cardiaca y Regeneración Cardiaca (ICREC) Research Program, Health Science Research Institute Germans Trias i Pujol, 2Amsterdam Universitair Medisch Centrum (UMC), Vrije Universiteit Amsterdam, Pulmonology and Physiology, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3Electronic and Biomedical Instrumentation Group, Departament d'Enginyeria Electrònica, Universitat Politècnica de Catalunya, 4Cardiology Service, Germans Trias i Pujol University Hospital, 5Department of Medicine, Universitat Autònoma de Barcelona, 6Centro de Investigación Biomédica en Red (CIBER) Cardiovascular, Instituto de Salud Carlos III

Summary

यहां हम बिजली और यांत्रिक उत्तेजनाओं हृदय शरीर क्रिया विज्ञान की नकल का उपयोग कर एक सेल जनसंख्या प्रशिक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद । यह विद्युत उत्तेजना इलाज कोशिकाओं की cardiomyogenic क्षमता को बढ़ाता है और आगे सेल थेरेपी, रोग मॉडलिंग, और दवा स्क्रीनिंग के लिए एक आशाजनक रणनीति है ।

Abstract

हृदय रोग विकसित देशों में मृत्यु का प्रमुख कारण हैं. नतीजतन, प्रभावी हृदय कोशिका चिकित्सा के लिए मांग स्टेम सेल और इंजीनियरिंग क्षेत्रों में शोधकर्ताओं को प्रेरित किया है इन विट्रो उच्च-निष्ठा मानव मायोकार्डियम दोनों बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए विकसित करने के लिए । हालांकि, हृदय कोशिकाओं के अपरिपक्व phenotype ऊतकों है कि कार्यात्मकता वयस्क मायोकार्डियम, जो मुख्य रूप से यांत्रिक और बिजली के संकेतों की विशेषता है नकल प्राप्त करने पर एक सीमा है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए तैयार है और विद्युत उत्तेजना, recapitulating शारीरिक मापदंडों के माध्यम से लक्ष्य सेल जनसंख्या परिपक्व है । कार्डिएक ऊतक इंजीनियरिंग अधिक जैविक दृष्टिकोण की ओर विकसित हो रहा है, और रणनीतियों जैव उत्तेजनाओं पर आधारित है, इस प्रकार, गति प्राप्त कर रहे हैं । इस उद्देश्य के लिए विकसित युक्ति अद्वितीय है और व्यक्तिगत या एक साथ बिजली और यांत्रिक उत्तेजना, ध्यान से विशेषता और पुष्टि की अनुमति देता है । इसके अलावा, यद्यपि इस पद्धति को इस उत्तेजितकर्ता और एक विशिष्ट कोशिका जनसंख्या के लिए अनुकूलित किया गया है, यह आसानी से अंय उपकरणों और सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यहां परिणाम विद्युत उत्तेजना के बाद सेल जनसंख्या के हृदय की प्रतिबद्धता में वृद्धि के सबूत प्रदान करते हैं । Electromechanically उत्तेजित कोशिकाओं जल्दी, संरचनात्मक, और कैल्शियम को विनियमित जीन सहित मुख्य हृदय मार्करों की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति दिखाने के लिए । इस सेल कंडीशनिंग आगे अपक्षयी सेल थेरेपी, रोग मॉडलिंग, और उच्च प्रवाह दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है ।

Introduction

हार्ट समारोह विद्युत उत्तेजना और यांत्रिक संकुचन के युग्मन पर आधारित है । संक्षेप में, cardiomyocyte सेलुलर जंक्शनों विद्युत संकेत प्रसार की अनुमति दिल के लगभग तुल्यकालिक संकुचन कि पंप रक्त प्रणालीबद्ध और फुफ्फुसीय प्रणाली के माध्यम से उत्पादन । कार्डिएक कोशिकाओं, इस प्रकार, दोनों विद्युत और यांत्रिक बलों है कि जीन अभिव्यक्ति और सेलुलर समारोह को विनियमित से गुजरना । तदनुसार, कई समूहों के लिए संस्कृति प्लेटफार्मों कि कार्डियक शारीरिक पर्यावरण की नकल करने के लिए हृदय विकास, समारोह पर यांत्रिक और विद्युत उत्तेजना की भूमिका समझ विकसित करने का प्रयास किया है, और परिपक्वता । इन विट्रो में विद्युत और यांत्रिक उत्तेजना व्यक्तिगत रूप से कार्डियक टिशू इंजीनियरिंग में बड़े पैमाने पर लागू किया गया है कार्यात्मक गुण बढ़ाने के लिए, सेल परिपक्वता में वृद्धि, या सेल सेल युग्मन और कैल्शियम हैंडलिंग में सुधार1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. फिर भी, तुल्यकालिक विद्युत कंडीशनिंग एक उत्तेजक और प्रोटोकॉल के विकास की चुनौती की वजह से, और क्योंकि अनिवार्य22अनुकूलन के शोषण नहीं रहता है ।

प्रारंभिक काम विद्युत उत्तेजना और मीडिया छिड़काव का एक संयोजन के रूप में विद्युत उत्तेजना को संबोधित किया; हालांकि, प्रवाह को शामिल नहीं करता है तनाव आधारित विकृति वेंट्रिकुलर भरने की विशिष्ट ठेठ23,24,25। बाद में, अधिक शारीरिक दृष्टिकोण भौतिक विकृति या खिंचाव isovolumetric संकुचन26,27,28,29,30 की नकल के साथ विद्युत उत्तेजनाओं संयुक्त ,31. फेंग एट अल. २००५ में विद्युत उत्तेजना के पहले प्रदर्शन का वर्णन, बढ़ाकर cardiomyocyte आकार और सिकुड़ा गुण26रिपोर्टिंग । वांग एट अल. mesenchymal 5-azacytidine के साथ स्टेम कोशिकाओं का इलाज किया और एक साथ विद्युत और यांत्रिक कंडीशनिंग लागू किया, सुधार recellularization, कोशिका व्यवहार्यता, हृदय भेदभाव, और27remodeling ऊतक । उन प्रकाशनों के बाद से, और अधिक समूहों सेल monolayers या इंजीनियर ऊतकों की विद्युत उत्तेजना पर सूचना दी है (जैसे, काले28, Vunjak-Novakovic29,31, और हमारे30समूह) के साथ पहली वातानुकूलित कोशिकाओं vivo30में परीक्षण किया । संक्षेप में, मॉर्गन और काले विद्युत और यांत्रिक उत्तेजनाओं के कई संयोजनों का परीक्षण किया, रिपोर्टिंग है कि उत्तेजना के बीच समय महत्वपूर्ण था क्योंकि देरी से संयुक्त विद्युत उत्तेजना सबसे अच्छा परिणाम28झुकेंगे । अगले, Godier-Furnémont और सहयोगियों के इंजीनियर दिल मांसपेशी नवजात चूहे के दिल की कोशिकाओं से निर्माण के लिए एक विद्युत उत्तेजना प्रोटोकॉल अनुकूलित और पहली बार, एक सकारात्मक बल-आवृत्ति संबंध29के लिए हासिल की । इसके बाद, हमारे समूह ने बताया कि electromechanically के बिना शर्त कोशिकाओं इन विट्रो में मुख्य कार्डियक मार्कर की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई और vivo में व्यापक लाभकारी प्रभाव, जैसे कि कार्डियक फंक्शन में सुधार या infarct में पोत घनत्व में वृद्धि सीमा क्षेत्र30. सबसे हाल ही में प्रकाशन का प्रदर्शन किया कि स्टेम से हृदय के ऊतकों-कोशिका व्युत्पंन cardiomyocytes विद्युत कंडीशनिंग के अधीन एक परिपक्वता मानव वयस्क हृदय संरचना और31समारोह के करीब स्तर तक पहुंच गया । इसके अतिरिक्त, वैकल्पिक तीन आयामी उत्तेजना प्लेटफार्मों electroactive पाड़ों कि बिजली, यांत्रिक प्रदान करते हैं, और३२संलग्न कोशिकाओं को स्थलाकृतिक cues शामिल हैं । इसके अलावा, यांत्रिक विकृति (सेल monolayer खींच और संपीड़न) भी सामान्य शारीरिक स्थितियों, साथ ही चरम स्थितियों३३नकल उतारने के लिए स्केलेबल इलेक्ट्रोड के साथ प्रेरित किया जा सकता है ।

इसलिए, तर्क यह है कि इन विट्रो विद्युत उत्तेजनाओं शारीरिक स्थितियों पर आधारित एक कोशिका की cardiomyogenic क्षमता में वृद्धि कर सकता है । वास्तव में, इस उत्तेजना एक नैदानिक परिदृश्य में मायोकार्डियम में चिकित्सीय कोशिकाओं के आगे एकीकरण लाभ या दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए ऊतक परिपक्वता वृद्धि कर सकता है ।

इसके अलावा, हम अलग और मानव वसा ऊतक की एक जनसंख्या की विशेषता-कार्डियक मूल के जनक कोशिकाओं व्युत्पंन (कार्डिएक ATDPCs)३४। इन कोशिकाओं epicardial वसा में स्थित हैं । ये कोशिकाएं रोधगलन के उपचार में लाभकारी histopathological और कार्यात्मक प्रभाव प्रदर्शित करती हैं और हृदय और endothelial विभेदक क्षमता को भी बनाए रखती हैं । 30 , ३५. हमने यह परिकल्पना की कि ये लाभ भौतिक उत्तेजना के बाद बढ़ जाएंगे ।

नतीजतन, हम एक उपकरण और ब्याज की कोशिका जनसंख्या के लिए एक उत्तेजना शासन विकसित और प्रभाव की जांच की । इस विद्युत प्रोटोकॉल एक नई रणनीति सक्रिय एक बाँझ तरीके से खींच सेल प्रेरित और इनवेसिव पिछले प्रकाशन३६की तुलना में, बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के साथ संयोजन में है । तकनीक यहां बताया विस्तार से उपकरण और विधि विद्युत, यांत्रिक, और कोशिकाओं के विद्युत उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया ।

इस उपकरण को विद्युत और यांत्रिक उत्तेजना, स्वतंत्र रूप से या एक साथ दोनों प्रदान कर सकते हैं । उत्तेजना एक इनवेसिव और अपूतित उपंयास दृष्टिकोण है कि, एक मानक संस्कृति प्लेट के अंदर रखा इलेक्ट्रोड, और यांत्रिक और विद्युत बलों (1 चित्रा) लाती है कि एक मंच के भीतर रख दिया है ।

मंच छह संस्कृति प्लेट तक पकड़ कर सकते है और लेजर के एक सैंडविच संरचना-कट पाली (मिथाइल methacrylate) और मुद्रित सर्किट बोर्ड के टुकड़े के होते हैं । मंच प्रोटोटाइप एक monophasic प्रोग्राम कंप्यूटर का एक संयोजन पर निर्भर करता है-विद्युत उत्तेजित करता है, इलेक्ट्रोड के मजबूत कनेक्शन के लिए एक मुद्रित सर्किट बोर्ड नियंत्रित, और ६ १० मिमी x 10 मिमी x 5 मिमी निकेल मढ़वाया neodymium-फिक्स्ड मैग्नेट रखा संस्कृति प्लेटों के एक तरफ के पास । वहां भी छह ड्राइविंग मैग्नेट (एक ही मॉडल) संस्कृति प्लेटों के दूसरे पक्ष के सामने रखा और एक रैखिक servomotor के साथ चले गए के साथ एक एल्यूमीनियम बार है । मोटर एक मोटर नियंत्रक द्वारा संचालित है, वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर द्वारा एक रुपए-२३२ बंदरगाह के माध्यम से संचालित ( सामग्री की मेजदेखें) । उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस और प्रोग्राम उत्तेजक के माध्यम से, यह बिजली की तीव्रता कार्यक्रम के लिए संभव है, पल्स अवधि और आवृत्ति, यांत्रिक उत्तेजना की आवृत्ति, अपने कर्तव्य चक्र, दालों की संख्या, पल्स आयाम (चुंबक भ्रमण), और ढलान ।

Figure 1
चित्रा 1 : विद्युत उत्तेजित करता है । (A) PDMS कक्ष कंडीशनिंग के लिए उपयोग किया गया निर्माण । (ख) PDMS के ड्राइंग, इलेक्ट्रोड और मैग्नेट सहित निर्माण । (ग) मुद्रित सर्किट बोर्ड (प्लेटफार्म) का विस्तार विद्युत कंडीशनिंग करने के लिए किया जाता है. इस पैनल को Llucià-Valldeperas एट अल.30से संशोधित किया गया है । (घ) विद्युत उत्तेजना मंच और यूजर इंटरफेस (कम्प्यूटर) का चित्र. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

दोनों उत्तेजक और विद्युत कंडीशनिंग के लिए विधि पूरी तरह से दो अंतरराष्ट्रीय पेटेंट में वर्णित हैं, हाय-२०१३१८५८१८-a1३७ और हाय-२०१७१२५१५९-a1३८।

कोशिकाओं, इलेक्ट्रोड, और मैग्नेट के लिए संरचनात्मक सहायता प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो पहले से ही10,21वर्णित किया गया है । संक्षेप में, वे polydimethylsiloxane से मिलकर बनता है (PDMS), ढाला और कमरे के तापमान पर ठीक हो, १.३ MPa के एक जवान के मापांक के साथ, शारीरिक स्तर के करीब । निर्माण एक लचीला क्षेत्र में एक सेल संस्कृति पूल (10 मिमी x 10 मिमी x 2 मिमी), दो भीतरी अनुप्रस्थ के लिए इलेक्ट्रोड पकड़ स्लॉट्स शामिल हैं, और दो एम्बेडेड 6 मिमी x 2 मिमी x 4 मिमी निकल मढ़वाया neodymium मैग्नेट. इलेक्ट्रोड के साथ निर्मित कर रहे हैं ०.२ mm प्लेटिनम तार के आसपास मुड़ एक 2 मिमी x 3 मिमी x 12 मिमी polytetrafluoroethylene (PTFE) कोर बार (इलेक्ट्रोड प्रति 21 सेमी, लगभग 23 बदल जाता है) और एक बिजली के क्षेत्र बनाने के लिए लचीला क्षेत्र के विपरीत पक्षों में रखा उत्प्रेरण के लिए विद्युत उत्तेजना । यांत्रिक खींच समर्थन और बाहरी मैग्नेट संस्कृति की थाली के बगल में रखा और चलती एल्यूमीनियम हाथ पर में एंबेडेड मैग्नेट के बीच चुंबकीय आकर्षण के माध्यम से हासिल की है । इस तरह, बाँझ बाधा को तोड़ने के बिना सेल समर्थन बढ़ाया जा सकता है । यह दृष्टिकोण एक सेल monolayer के लिए उपयुक्त है, लेकिन तीन आयामी निर्माण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से ।

इसके अलावा, एक नियमित रूप से पैटर्न जहां कोशिकाओं को वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, एक शासन विवर्तन कद्दूकस करना (१,२५० खांचे/ PDMS पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य brightfield और फ्लोरोसेंट सूक्ष्मदर्शी के तहत निर्माण अपनी पारदर्शिता और ०.५ mm मोटाई की वजह से संभव है । मौजूदा मामले में, PDMS संस्कृति पूल एक ऊर्ध्वाधर सतह पैटर्न है, सीधा खींच बल के लिए, कोशिकाओं को सीधा विद्युत क्षेत्र है, जो सेल भर में बिजली के क्षेत्र ढाल को कम करने के लिए संरेखित करें ।

चित्रा 1 निर्माण और उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया डिवाइस का एक विस्तृत विवरण से पता चलता है. PDMS निर्माण और विशेषताओं सेल खींचने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं (आंकड़ा 1a, बी). उत्तेजितकर्ता विकसित और PDMS निर्माण से जुड़ी कोशिकाओं को वांछित बिजली और यांत्रिक उत्तेजना के प्रभावी अनुप्रयोग के लिए मान्य है. इस प्रक्रिया में सॉफ्टवेयर इंटरफेस (चित्रा 1C, डी) के माध्यम से अच्छी कनेक्टिविटी और उपयोगकर्ता अंतर को सुनिश्चित करना शामिल है ।

इस कस्टम-निर्मित डिवाइस का उपयोग करके कक्ष उत्तेजना के लिए कार्यविधि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णन किया गया है ।

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Protocol

यह अध्ययन रोगी के नमूनों से मानव कार्डियक ATDPCs का उपयोग करता है. उनका उपयोग स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित कर दिया गया है, और सभी रोगियों को सूचित सहमति दे दी है. अध्ययन प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा में उल्लिखित सिद्धांतों के अनुरूप है.

1. तैयारी

  1. आटोक्लेव दो चिमटी, बिजली की उत्तेजना के लिए 12 प्लेटिनम PTFE इलेक्ट्रोड, और कुछ कागज तौलिए, 20 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर ।
  2. एकमेकांना १२ PDMS कस्टम निर्मिती गावातील (चित्र १अ).
    1. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबकीय आंदोलन के साथ बाँझ, आसुत जल के 5 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक निर्माण धो लो ।
    2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबकीय आंदोलन के साथ ७०% इथेनॉल के 5 मिलीलीटर के साथ धो 1x ।
    3. धो 5x 5 मिलीलीटर बाँझ, के साथ आसुत जल के कमरे के तापमान पर 10 मिनट प्रति धोने के लिए, शराबी अवशेषों को हटाने के लिए ।
    4. सूखी प्रवाह कैबिनेट के अंदर बाँझ कागज तौलिए पर रातोंरात निर्माण ।
    5. उपयोग जब तक उंहें बाँझ ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में स्टोर ।

2. सेल सीडिंग (Day-1)

  1. कोशिका बोने से पहले, PDMS को बाँझ करने के लिए साफ कर दिया जाता है और उन्हें पूर्ण नसबंदी सुनिश्चित करने के लिए 5 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश का पर्दाफाश करने के लिए स्थानांतरण ।
  2. तत्काल सेल बोने के लिए, एक ३५ mm सेल कल्चर प्लेट, या 6 अच्छी तरह से थाली के लिए प्रत्येक निर्माण हस्तांतरण ।
  3. Trypsinize हृदय ATDPCs की एक धाराप्रवाह T75 कुप्पी ।
    1. 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 5 मिलीलीटर के साथ T75 कुप्पी धो लें ।
    2. कोशिकाओं को अलग करने के लिए 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ०.०५% trypsin-EDTA और मशीन की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. trypsin-EDTA को निष्क्रिय करने के लिए पूर्ण माध्यम की 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने और किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ कुप्पी 2x धो लो ।
    5. 5 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर २३० x g पर केंद्रापसारक, supernatant को हटा दें, और उंहें hemocytometer चैंबर के साथ गिनती करने के लिए पूरा माध्यम के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।
  4. बीज २०० कार्डियक ATDPCs के µ l (२.५ x 105 कोशिकाओं/एमएल) के सेल पूल में 12 PDMS का निर्माण (चित्रा 1ए, ख) के लिए दिन के बाद कोशिकाओं द्वारा कवर बोने की सतह के ~ ८०% है, और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर मशीन ।
    नोट: 2 – 4 एच के बाद, कोशिकाओं को संलग्न किया जाना चाहिए । सेल के आकार और वृद्धि के अनुसार कोशिका इनोक्युलम तैयार की जाती है. छोटी कोशिकाओं के लिए, बीज बोने की सघनता बढ़ाई जानी चाहिए ।
  5. धीरे गरम पूर्ण मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें (α-मेम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% L-glutamine, और प्लेट प्रति 1% पेनिसिलिन-streptomycin) के साथ पूरक ।
  6. संस्कृति की स्थिति (आमतौर पर ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2) रातोंरात में निर्माण की मशीन ।

3. विद्युत उत्तेजना सेटअप (0 दिन)

  1. प्रक्रिया शुरू करने से पहले, विद्युत उत्तेजना और छह के रूप में उत्तेजित नियंत्रण के लिए छह निर्माण ले । प्रति उत्तेजना से कम छह प्लेट के साथ, एक ही मध्यम मात्रा के साथ खाली निर्माण का उपयोग करने के लिए उचित बिजली के क्षेत्र उत्तेजना सुनिश्चित करते हैं ।
  2. ७०% इथेनॉल के साथ उत्तेजना इकाई साफ और यह प्रवाह कैबिनेट में जगह है ।
  3. प्रवाह कैबिनेट के अंदर बाँझ इलेक्ट्रोड और चिमटी लाओ ।
  4. संस्कृति प्लेट से मीडिया के ९०% को दूर आसानी से इलेक्ट्रोड और निर्माण में हेरफेर करने के लिए । सबसे पहले, सही स्थिति में PDMS constructs जगह चुंबकीय आकर्षण सुनिश्चित करने के लिए (चुंबक की ओर संस्कृति की थाली के भीतर PDMS विस्थापन) दोनों फिक्स्ड और मोबाइल मैग्नेट के बीच । अगले, इलेक्ट्रोड connectors के लिए प्लैटिनम तार कनेक्ट और PDMS निर्माण में अपने निर्दिष्ट अंतरिक्ष में PTFE हिस्सा है ।
  5. प्रत्येक निर्माण के लिए ताजा गरम पूर्ण मध्यम के २.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: प्रक्रिया भर में बांझपन बनाए रखने और एक समय में एक निर्माण पर काम करते हैं । ३७ ° c और 5% सह2 पर मशीन में निर्माण के बाकी का उपयोग करें जब तक बनाए रखें ।
  6. एक बार सभी PDMS constructs रखा और बिजली के मंच से जुड़े हैं, ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर मशीन में वापस मंच ले आओ ।
  7. विद्युत और यांत्रिक स्रोत से कनेक्ट करें ।
  8. कॉंफ़िगर उत्तेजना कार्यक्रम । विद्युत और यांत्रिक उत्तेजना विद्युत उत्तेजित करता है और आवेदन है, जो यांत्रिक उत्तेजना नियंत्रण के उपयोगकर्ता इंटरफेस के माध्यम से शासन निर्दिष्ट करें । समकालिकता निम्नानुसार सेट करें ।
    1. विद्युत उत्तेजित करता है पर स्विच । मुख्य मेनू के प्रदर्शन में प्रकट होने के लिए प्रतीक्षा करें ।
      1. फिर, विकल्प 2: संपादन अनुक्रम + Enterका चयन करें ।
      2. अनुक्रम मेनू निम्नानुसार संपादित करें ।
        1. या तो वोल्टेज या वर्तमान का चयन करने के लिए मोड टैब का उपयोग करें । + क्लिक करके वर्तमान का चयन करें और enterदबाएँ.
        2. आयाम टैब के लिए, +/- के साथ 1 (mA) का चयन करें और enterदबाएँ ।
        3. पीरियड (T)के लिए, +/- और enterदबाएं के साथ १००० (ms) का चयन करें ।
        4. पल्स अवधि (Tw) को 2 (ms) +/- के साथ सेट करें और enterदबाएँ.
        5. ट्रिगर मोड टैब के लिए, सॉफ़्टवेयर द्वारा बाहरी का चयन करें और enterदबाएँ.
        6. वापस मुख्य मेनू में, विकल्प 4 का चयन करें : अनुक्रम उत्पन्न और प्रेस दर्जकरें.
          नोट: यह सीरियल पोर्ट के माध्यम से यांत्रिक उत्तेजक आवेदन से एक ट्रिगर आदेश प्राप्त होता है जब तक विद्युत उत्तेजित करता स्टैंडबाय में टिकी हुई है.
    2. नियंत्रण अनुप्रयोग कक्ष (चित्रा 2C) के यांत्रिक उत्तेजना अनुभाग में निम्न चरणों का पालन करें ।
      1. पल्स अवधि पाठ नियंत्रण में १,००० (ms) लिखें ।
      2. लिखें ५०० (ms) पर समय (Tw) पाठ नियंत्रण में यांत्रिक पल्स अवधि सेट करने के लिए ।
      3. भ्रमण पाठ नियंत्रण में २,००० (AU) लिखें एक 10% का निर्माण बढ़ाव उद्धार । यह रैखिक नियंत्रण मोटर में कदम की संख्या है ।
        ध्यान दें: उत्तेजना यहां लागू प्रोटोकॉल बारी के होते है-वर्तमान 2 ms monophasic स्क्वायर-1 हर्ट्ज पर ५० एमवी/सेमी की लहर दालों और 10% 7 दिनों के लिए खींच । वृद्धि और यांत्रिक नाड़ी के पतन के समय १०० ms पर सेट कर रहे हैं, मोटे तौर पर चूल्हा दबाव नाड़ी के आकार की नकल । इसके अलावा, दोहराव मोड निरंतर करने के लिए सेट है और दालों की संख्या प्रदर्शित करने के लिए एक काउंटर है ।
  9. मीडिया 2x एक सप्ताह (सोमवार और गुरुवार दोपहर) बदलें । सबसे पहले, पुराने मीडिया को हटा दें; अगला, PDMS समर्थन के पक्ष पर गर्म मीडिया जोड़ें, सीधे कभी नहीं सेल पूल पर ।
    नोट: यदि कोशिकाओं को एक उच्च विकास दर है, मीडिया 3x बदल जाना चाहिए एक सप्ताह (जैसे, सोमवार, बुधवार, और शुक्रवार) । यह डिस्कनेक्ट और सभी केबल जोड़ने के लिए आवश्यक है, लेकिन उनकी जगह से संस्कृति प्लेटों और इलेक्ट्रोड को दूर करने के लिए कोई जरूरत नहीं है.
  10. प्रयोग के बाद नमूनों को इकट्ठा किया जाता है ।

4. प्रयोग के अंत में नमूना संग्रह (7 दिवस)

  1. आरएनए विश्लेषण के लिए
    1. 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों के 3 मिलीलीटर के साथ निर्माण 2x धो कमरे के तापमान पर ।
    2. प्रत्येक प्लेट को ०.०५% trypsin-EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें (पूरे निर्माण को कवर करने के लिए पर्याप्त) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए रुको ।
    3. कोशिकाओं को अलग करने के बाद, trypsin-EDTA को निष्क्रिय करने के लिए पूर्ण माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने और किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ निर्माण 2x धोने ।
    5. 5 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर २३० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. supernatant निकालें और पंजाब के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
    7. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए सेल समाधान स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए २३० x g पर केंद्रापसारक ।
    8. supernatant निकालें और आगे आरएनए अलगाव के लिए lysis रिएजेंट के ७०० µ एल में-८० डिग्री सेल्सियस पर गोली की दुकान ।
    9. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर आरएनए अलग, निर्माता के निर्देशों का पालन.
    10. रिवर्स-अलग आरएनए किट और यादृच्छिक hexamers का उपयोग कर, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार टाइप ।
    11. छोटे शाही सेना सांद्रता के लिए, बढ़ाना और, फिर, बाद में वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) किया जाता है पहले RNase मुक्त पानी के साथ 1:5 पतला । रीयल-टाइम RT-पीसीआर के लिए मानक प्रोटोकॉल जारी रखें और मुख्य कार्डियक मार्कर की जांच करें ।
      नोट: ठेठ कार्डियक मार्करों विभिन्न श्रेणियों से जल्दी और देर मार्करों शामिल, जैसे हृदय प्रतिलेखन कारकों (myocyte-विशिष्ट बढ़ाने कारक 2a [MEF2A], गता-बंधन प्रोटीन 4 [गता-4]) और संरचनात्मक (कार्डियक ट्रोपोनिन I [cTnI], कार्डियक ट्रोपोनिन T [cTnT], α-actinin) और कैल्शियम नियमन (Connexin43 [Cx43], होती sarco-/endoplasmic जालिका Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. प्रोटीन अलगाव भी किया जा सकता है अगर जरूरत है । एक साथ आरएनए और प्रोटीन अलगाव नमूना मात्रा कम है, तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिएजेंट और किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर, एक ही नमूना के साथ किया जा सकता है ।
  2. immunostainings के लिए
    नोट: यह सीधे PDMS का निर्माण कक्ष पूल से अनुलग्न कक्षों पर किया जाता है । इसलिए, हम रखने की सिफारिश, हर बार, 1 सेमी एक्स सेल पूल के शीर्ष पर तेल फिल्म के 1 सेमी, अलग प्लेट ढक्कन से, के लिए मशीन समाधान के वाष्पीकरण को कम करने के लिए ।
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ निर्माण 2x धो लो ।
    2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 10% formalin के 2 मिलीलीटर के साथ निर्माण से जुड़ी कोशिकाओं को ठीक करें ।
    3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें । लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.१% सोडियम azide के साथ पंजाब में नमूने छोड़ दें ।
    4. Permeabilize की 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं + ०.५% डिटर्जेंट (3x, हर बार 5-10 मिनट, कमरे के तापमान पर) ।
    5. पंजाब के १०० µ एल के साथ कोशिकाओं को मशीन + 10% हार्स सीरम + ०.२% डिटर्जेंट + 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर, विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को ब्लॉक करने के लिए ।
    6. पंजाब के १०० µ एल के साथ कोशिकाओं की मशीन + 10% हार्स सीरम + ०.२% डिटर्जेंट + 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन + प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए कमरे के तापमान पर 1 एच. उदाहरण के लिए, Cx43 (1:100), sarcomeric α-actinin (1:100), गता-4 (1:50), MEF2 (1:25), और SERCA2 (1:50) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी ।
    7. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ 3x धो लें ।
    8. पंजाब के १०० µ एल के साथ कोशिकाओं की मशीन + 1 एच के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी
      नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित अलग fluorophores और एक counterstaining एजेंट के साथ इस्तेमाल किया गया ।
    9. 5 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर पंजाबियों के 3 मिलीलीटर के साथ उन्हें 3x धो लें ।
    10. 15 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर पंजाब में १०० µ एल परमाणु धुंधला (०.१ µ g/एमएल) के साथ कोशिकाओं को गर्मी ।
    11. 5 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर पंजाबियों के 3 मिलीलीटर के साथ उन्हें 3x धो लें ।
    12. अधिग्रहण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.१% सोडियम azide के साथ पंजाब के 3 मिलीलीटर में नमूनों की दुकान ।
      नोट: माइक्रोस्कोप अधिग्रहण लंबे समय से काम दूरी उद्देश्यों के साथ औंधा फ्लोरोसेंट और फोकल माइक्रोस्कोप पर संभव है क्योंकि निर्माण मोटाई के बारे में ०.५ mm है ।

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Representative Results

आरेख 2 कक्ष उत्तेजना के लिए फ़ॉलो की गई सामांय स्कीमा का प्रतिनिधित्व करता है । संक्षेप में, कोशिकाओं PDMS निर्माण पर वरीयता प्राप्त और विद्युत उत्तेजना के अधीन थे, एक मीडिया के परिवर्तन के साथ एक सप्ताह में दो बार प्रदर्शन किया । उत्तेजित कोशिकाओं विद्युत कंडीशनिंग के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । इसके अतिरिक्त, हम प्रयोग करने के लिए एक अतिरिक्त नियंत्रण जोड़ा, और चमड़े के नीचे ATDPCs कार्डियक ATDPCs के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । चमड़े के नीचे ATDPCs चमड़े के नीचे वसा ऊतक से प्राप्त कर रहे हैं, हृदय ATDPCs३३के लिए के रूप में एक ही अलगाव और संस्कृति प्रक्रियाओं के बाद । PDMS से जुड़ी कोशिकाओं के निर्माण से पहले और उत्तेजना के बाद एक ठेठ fusiform phenotype सबूत । इसके अलावा, पैटर्न सतह के अनुसार गठबंधन कोशिकाओं, इस मामले में ऊर्ध्वाधर पैटर्न के बाद ।

विद्युत और यांत्रिक उत्तेजना पहले व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित किया गया । पहला, electrostimulation एक पिछले अध्ययन पर आधारित था जिसमें बारी-वर्तमान 2 ms monophasic स्क्वायर-वेव दलहन की ५० mV/cm 1 हर्ट्ज पर कार्डियक ATDPCs10के लिए सबसे अच्छा पाया गया. हमने बताया कि विद्युत उत्तेजना कार्डियक ATDPCs में जल्दी कार्डियक मार्कर की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, जैसे MEF2A (पी = ०.०५०) और गता-4 (पी = ०.०३१), लेकिन संरचनात्मक और कैल्शियम से निपटने के जीन पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया गया (डेटा) .

दूसरा, mechanostimulation प्रोटोकॉल 10% खींच शामिल है और एक ५०% शुल्क चक्र के साथ एक 1 हर्ट्ज trapezoidal तरंग, १०० एमएस वृद्धि और गिरावट बार दिल में दबाव चक्र की नकल के साथ, के रूप में21से पहले पूर्ण में वर्णित है । यांत्रिक रूप से प्रेरित कार्डियक ATDPCs संरचनात्मक जीन की अभिव्यक्ति संवर्धित, जैसे α-actinin (p = ०.००१) या cTnI (p = ०.०४४), और जल्दी हृदय मार्करों के लिए एक बढ़ती हुई प्रवृत्ति दिखाया, गता-4 (पी = ०.०६८) और टी बॉक्स प्रतिलेखन कारक 5 (Tbx5; P = ०.०६५) (डेटा नहीं दिखाया गया है) । यांत्रिक उत्तेजना से व्युत्पंन प्रभाव नमूनों की सतह पर दृढ़ता से निर्भर थे ।

इसके बाद, दोनों प्रोटोकॉल कार्डियक ATDPCs की एक कुशल विद्युत उत्तेजना के लिए संयुक्त थे, निलय जैसी-रक्त से भरना । जिसके परिणामस्वरूप प्रोटोकॉल बारी शामिल-वर्तमान 2 ms monophasic स्क्वायर लहर दालों की ५० mV/cm पर 1 हर्ट्ज और 10% 7 दिनों के लिए खींच30. कुल मिलाकर, electromechanically प्रेरित कार्डियक ATDPCs अपनी cardiomyogenic क्षमता बढ़ाया । प्रेरित हृदय ATDPCs जल्दी और देर से हृदय जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई (चित्रा 3ए), अर्थात्, हृदय प्रतिलेखन कारक गता-4 (पी = ०.०५०), संरचनात्मक मार्कर β-मायोसिन भारी श्रृंखला (β-MHC; पी = ०.०००), और कैल्शियम से संबंधित जीन Cx43 (पी = ०.०२५) । जीन विद्युत उत्तेजना से उत्पंन मॉडुलन भी प्रोटीन स्तर (चित्रा 3बी-एम) में अनुवाद किया गया । Phalloidin actin फाइबर के खिलाफ दाग से पता चला कि कोशिकाओं के बहुमत ऊर्ध्वाधर पैटर्न के अनुसार गठबंधन किया और कि Cx43 वितरण कोशिका द्रव्य में और प्लाज्मा झिल्ली पर ज्यादातर था, अंतराल के माध्यम से सेलुलर संचार में योगदान करने के लिए जंक्शन (चित्रा 3बी-ई) । MEF2 और गता-4 प्रतिलेखन कारक कार्डियक ATDPCs में नाभिक पर स्थित थे; हालांकि, उपचर्म ATDPCs (चित्रा 3एफ एम) में गता-4 का पता नहीं था । cytoplasmic मार्करों SERCA2 और sarcomeric α-actinin एक परिपक्व sarcomere cardiomyocytes के लिए विशिष्ट संगठन नहीं दिखा था, और पिटाई नियंत्रण में नहीं देखा गया था और उत्तेजित सेल आबादी (चित्रा 3एफ एम) ।

Figure 2
चित्रा 2 : विद्युत उत्तेजना प्रक्रिया, इकाई, और उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस । (क) 0 दिन में उत्तेजित कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों के साथ विद्युत उत्तेजना स्कीमा और 7 दिन में उत्तेजित कोशिकाओं, दोनों ऊर्ध्वाधर सतह पैटर्न के साथ constructs । स्केल पट्टियां = १०० µm । (ख) विद्युत उत्तेजना इकाई: वरीयता प्राप्त PDMS निर्माण, इलेक्ट्रोड, और फिक्स्ड/ (ग) यांत्रिक उत्तेजना के लिए नियंत्रण आवेदन पैनल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 : हृदय और चमड़े के नीचे ATDPCs के विद्युत उत्तेजना के बाद मुख्य कार्डियक मार्कर के जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति । (क) कार्डिएक और चमड़े के नीचे ATDPCs में मुख्य कार्डियक जीन की वास्तविक समय पीसीआर । cardiomyogenic मार्करों के सापेक्ष अभिव्यक्ति में उत्तेजित बनाम बिना शर्त नियंत्रण कार्डियक और चमड़े के नीचे ATDPCs के लिए दिखाया गया है । मान glyceraldehyde-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत थे और छह स्वतंत्र प्रयोगों के लिए मतलब ± SEM के रूप में दिखाया जाता है । * P < ०.०५ (माहात्म्य) । (बी - एम) हृदय और चमड़े के नीचे ATDPCs में प्रोटीन अभिव्यक्ति नियंत्रण और उत्तेजित कोशिकाओं के लिए मुख्य कार्डियक मार्करों की एक ऊर्ध्वाधर पैटर्न सतह अभिव्यक्ति पर । Phalloidin दाग (actinF; लाल) और Cx43 अभिव्यक्ति (हरा), SERCA2 (लाल), MEF2 (हरा), sarcomeric α-actinin (लाल), और गता-4 (हरा) अभिव्यक्ति नियंत्रण में (पैनलों में बी, डी, एफ, एच, जे, और एल ) और उत्तेजित (पैनलों में सी, ई, जी, मैं, कश्मीर, और एम) कार्डिएक (बाएं) और चमड़े के नीचे (दाएं) ATDPCs । नाभिक DAPI (नीले; पैनलों बी - ई, एल, और एम) के साथ counterstained थे । स्केल बार्स = ५० µm । यह आंकड़ा Llucià-Valldeperas एट अल.30से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

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Discussion

विद्युत उत्तेजना एक शत्रुतापूर्ण हृदय पर्यावरण के लिए कोशिकाओं को तैयार करने और उनके हृदय की प्रतिबद्धता को बढ़ाने के लिए एक सुरक्षित विकल्प प्रतीत होता है । यहां, हृदय जनक कोशिकाओं के लिए वर्णित एक प्रोटोकॉल मुख्य हृदय मार्कर की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है और30मायोकार्डियम murine infarcted पर अपने अगले आरोपण के लिए फायदेमंद होने की सूचना दी थी । सामांय में, electromechanically हृदय ATDPCs प्रेरित जल्दी, संरचनात्मक, और कैल्शियम विनियमन है, जो पिछले बिजली या यांत्रिक उत्तेजना व्यक्तिगत रूप से कभी नहीं प्राप्त किया गया है से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति वृद्धि हुई है । वास्तव में, electromechanically हृदय ATDPCs को प्रेरित एक और पूरा प्रोफ़ाइल दिखाने के लिए और अधिक हृदय वंश के लिए प्रतिबद्ध से पहले की सूचना दी लग रहा था ।

कार्डिएक जीन अभिव्यक्ति विद्युत उत्तेजना के बाद दोनों प्रकार के कोशिका में संग्राहक था, विशेष रूप से हृदय ATDPCs के उल्लेखनीय वृद्धि के बाद चमड़े के नीचे ATDPCs की तुलना में । इस परिणाम वसा कोशिका अलगाव, अर्थात्, epicardial या चमड़े के नीचे वसा, क्रमशः के लिए इस्तेमाल किया ऊतक के मूल का परिणाम हो सकता है । epicardial वसा दोनों दिल और पेरीकार्डियम आसपास के ऊतक एक चयापचय सक्रिय अंग है और जनक कोशिकाओं का एक स्रोत है । ब्याज की, epicardial वसा मायोकार्डियम के साथ संरचनात्मक और कार्यात्मक निरंतरता है । सामांय परिस्थितियों में, epicardial वसा में जैव रासायनिक और thermogenic cardioprotective गुण होते हैं; इसके विपरीत, रोग की स्थिति के तहत, यह३९दिल को प्रभावित करने के लिए भड़काऊ साइटोकिंस स्रावित कर सकते हैं । वास्तव में, कार्डियक ATDPCs phenotype की तरह एक अंतर्निहित कार्डियक है और कार्डियक मार्कर की एक गठित अभिव्यक्ति प्रदर्शन, जैसे Cx43, sarcomeric α-actinin, SERCA2, और गता-4, चमड़े के नीचे ATDPCs, जो कि हृदय के लिए अनुकूलित नहीं कर रहे हैं की तुलना में पर्यावरण३४. इस प्रकार, विद्युत उत्तेजना से व्युत्पंन प्रभाव कार्डियक जनक कोशिकाओं के लिए अधिक से अधिक हो सकता है, जिसका आला के पास या रोधगलन वातावरण के भीतर है ।

अंतिम अवलोकन से जो में जीन मॉडुलन दृढ़ता से सेल जनसंख्या पर निर्भर करता है, प्रत्येक कोशिका जनसंख्या के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलन सलाह दी जाती है, और अनुमानित मूल्यों इस प्रोटोकॉल में वर्णित उन लोगों से निकाला जा सकता है. कोशिका विद्युत उत्तेजना में सबसे महत्वपूर्ण कदम कोशिका लगाव और उत्तेजना शासनों (तीव्रता, अवधि, आवृत्ति) हैं ।

उदाहरण के लिए, बिजली के मापदंडों महत्वपूर्ण हैं । दरअसल, विद्युत क्षेत्र तीव्रता लागू एक बिजली के सेल के लिए इष्टतम था, तो मूल्यों में वृद्धि हुई है और अधिक बिजली की गतिविधियों के साथ कोशिकाओं के लिए उपयुक्त होगा, जैसे अपरिपक्व pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पंन cardiomyocytes४०,४१ . कार्डिएक ATDPC electrostimulation के लिए प्रारंभिक प्रयोग का प्रदर्शन किया है कि एक प्रत्यक्ष वर्तमान और एक उच्च वोल्टेज प्रेरित सेल विकास की गिरफ्तारी और सेल मौत10। इन परिणामों से, बारी-वर्तमान और कम वोल्टेज प्रोटोकॉल आगे प्रयोग के लिए अपनाया गया था ।

इसके अतिरिक्त, कुछ कोशिका वंश PDMS सतह के लिए एक कम लगाव मौजूद है, तो एक कोटिंग या एक प्लाज्मा उपचार बोने की क्षमता४२को समृद्ध करने के लिए सुझाव दिया है । इसके अलावा, सेल सीडिंग प्रत्येक कोशिका आकार और विकास के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, अत्यधिक प्रफलन कोशिकाओं के लिए मूल्यों को कम करने या छोटे कोशिकाओं के लिए उन्हें बढ़ाने; इस प्रकार, कुछ परीक्षण PDMS निर्माण पर कई घनत्व सीडिंग की सिफारिश कर रहे हैं । अंत में, प्रोटोकॉल एक सेल monolayer पर किया गया था, और मान एक तीन आयामी परिदृश्य (यानी, कोशिका घनत्व) के लिए थोड़ा अलग हो सकता है ।

इसके अलावा, सतह पैटर्न यांत्रिक सेल प्रशिक्षण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यह दिखाया गया है कि पैटर्न के अनुसार गठबंधन कोशिकाओं, और यांत्रिक उत्तेजना के बाद उनके प्रदर्शन अलग सतहों के बीच ही नहीं था । उदाहरण के लिए, यांत्रिक रूप से उत्तेजित हृदय ATDPCs खड़ी पैटर्न सतहों पर वरीयता प्राप्त (खींच बल के लिए सीधा) रोधगलन और extracellular मैट्रिक्स remodeling रूपांकनों के साथ जुड़े प्रोटीन स्रावित । Mechanostimulated कार्डिएक ATDPCs पर वरीयता प्राप्त-patterned सतहों हृदय पुनर्जनन21के साथ जुड़े प्रोटीन स्रावित ।

इस विधि की मुख्य विशेषताएं ऊपर बताई गई हैं । हालांकि, यह इन सुविधाओं को प्राप्त करने के लिए अद्वितीय तरीकों में से एक के रूप में खींच सेल के इनवेसिव दृष्टिकोण को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है । ब्याज की, क्योंकि एक ही उपकरण बिजली और/या यांत्रिक उत्तेजनाओं प्रस्तुत कर सकते हैं, अलग उत्तेजना और कोशिकाओं से परिणामी प्रभाव की एक सीधी तुलना संभव है । इसके अलावा, निर्माण पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के दृश्य, पारदर्शिता और ओट के लिए धन्यवाद, पहले सेल स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक स्पष्ट लाभ है, के दौरान, और उत्तेजना के बाद.

डिवाइस और प्रोटोकॉल कुछ सीमाएं हैं, उनमें से कुछ पहले से ही उल्लेख किया । पहले, यह डिजाइन किया गया था और एक monolayer सेल संस्कृति के लिए अनुकूलित नहीं है और एक तीन आयामी कोशिका संस्कृति के लिए । विशेष रूप से, केवल अनुयाई कक्षों monolayer सेटिंग में उपयोग किया जा सकता है । nonadherent कोशिकाओं के लिए, एक तीन आयामी दृष्टिकोण लागू किया जाना चाहिए । दूसरा, आकार के निर्माण की सीमा बोने की सतह; इस प्रकार, उत्तेजित कोशिकाओं की संख्या छोटी है, और हर प्रयोगात्मक सेट आगे जीन या प्रोटीन विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूने एकत्र करने के लिए कई दोहराने की आवश्यकता है । बड़े पशु प्रयोग या नैदानिक अनुवाद के लिए स्केल-अप अनिवार्य है, जिसमें उच्च कोशिका खुराक की आवश्यकता होती है; ऐसे मामलों में, बड़ी उत्तेजना सतहों पर विचार किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल के मुख्य अनुप्रयोगों सेल कंडीशनिंग, रोग मॉडलिंग, और दवा स्क्रीनिंग शामिल हैं । इस उत्तेजना कोशिका परिपक्वता को बढ़ाता है, और अपने आवेदन को प्राप्त करने और एक अधिक परिपक्व phenotype को बनाए रखने के लिए उपयोगी होगा । एक तरफ, कोशिकाओं है कि कार्यात्मक phenotype वयस्क मायोकार्डियम में मौजूद नकल रोग मॉडलिंग और अंग पर एक चिप प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं । वास्तव में, मानव बायोप्सी रोग की प्रगति का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते क्योंकि वे आम तौर पर अंत चरण या पोस्टमार्टम के नमूने हैं, जबकि पशु मॉडल हमेशा मानव शरीर क्रिया विज्ञान और लक्षण दोहराऊंगा नहीं है । फिर भी, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल का उपयोग तंत्र को खंडित पैथोलॉजी विकास४३के लिए एक वैकल्पिक मॉडलिंग पद्धति के रूप में उभरा है । इसके अलावा, अंगों पर एक चिप लघु ऊतकों और अंगों कि मानव (पैथो) फिजियोलॉजी की मॉडलिंग और तीन आयामी संरचनाओं की नकल की अनुमति देने में उगाया जाता है । उनका उद्देश्य एक ंयूनतम कार्यात्मक इकाई है कि एक नियंत्रित और सरल तरीके से मानव शरीर क्रिया विज्ञान और रोग के कुछ पहलुओं को दोहराऊंगा और मौजूदा सेल और पशु मॉडल४४की सीमाओं का पता कर सकते है स्थापित है ।

दूसरी ओर, ड्रग स्क्रीनिंग संस्कृति प्लेटफार्मों कि एक उच्च प्रवाह, cardiomyocyte प्रतिक्रिया के माध्यम से सुरक्षा और दवाओं की प्रभावकारिता के परीक्षण के लिए लघुकृत प्रणाली में वर्तमान in vivo की नकल की आवश्यकता है । परिपक्व कोशिकाओं को एक उच्च प्रवाह परख में एक नैदानिक प्रासंगिक readout (दोहराऊंगा, सिकुड़ा कैनेटीक्स) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, स्पष्ट रोग तंत्र के लिए और उपंयास चिकित्सकीय लक्ष्य४५की पहचान ।

कार्डिएक क्षेत्र इस प्रोटोकॉल की मुख्य गुंजाइश थी, लेकिन यह आसानी से ंयूरॉंस या कंकाल डोमेन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है क्योंकि इन वातावरणों बिजली और यांत्रिक उत्तेजनाओं की विशेषता है । शारीरिक उत्तेजना के साथ पिछले अध्ययनों लाभकारी परिणाम४६,४७,४८,४९,५०संकेत दिया है ।

अंत में, कार्डियक ATDPCs की तुल्यकालिक विद्युत कंडीशनिंग के लिए एक नया प्रोटोकॉल बताया गया है । जिसके परिणामस्वरूप प्रोटोकॉल और डिवाइस बड़े पैमाने पर परीक्षण किया गया है और व्यक्तिगत और सिंक्रनाइज़ उत्तेजनाओं के लिए मांय । ATDPCs की तुल्यकालिक विद्युत कंडीशनिंग उनकी cardiomyogenic क्षमता को बढ़ाती है और सेल थेरेपी, रोग मॉडलिंग, और ड्रग स्क्रीनिंग के लिए एक होनहार रणनीति के रूप में उभर रही है ।

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Disclosures

लेखकों को कुछ भी नहीं खुलासा है, सिवाय इसके कि उत्तेजना उपकरण और प्रोटोकॉल पहले पेटेंट (हाय-२०१३१८५८१८-a1, हाय-२०१७१२५१५९-a1) थे ।

Acknowledgments

लेखक ICREC रिसर्च प्रोग्राम (IGTP, Badalona) और इलेक्ट्रॉनिक और बायोमेडिकल इंस्ट्रूमेंटेशन समूह (UPC, बार्सिलोना), विशेष रूप से प्रो जे Rosell-फेरर के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं । इसके अलावा, लेखक पहले से प्रकाशित आंकड़ों के अनुकूलन की अनुमति के लिए स्टेम सेल शोधों मेडिसिन जर्नल और AlphaMed प्रेस स्वीकार करते है (Llucià-Valldeperas, एट अल । 30). इस प्रोटोटाइप के विकास और प्रोटोकॉल के डिजाइन का समर्थन किया गया Ministerio de Educación y Ciencia (एसएएफ 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (एसएएफ 2014-59892), यूरोपीय आयोग सातवां ढांचा कार्यक्रम ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació ला Marató de TV3 (०८०३३०, २०१५१६, २०१५०२), और Fundación पैरा ला Innovación y ला Prospectiva en Salud en España (fips; 06-00001396-15) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stimulator
nickel plated neodymium magnets Supermagnete Q-10-10-05-N
nickel-plated neodymium magnets Supermagnete Q-06-04-02-HN
polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Corp 184
ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) Newport 05RG150-1250-2
Motor controller Faulhaber MCLM-3006-S
Labview National Instruments
Cell culture
phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 70013-065
0.05% trypsin-EDTA Gibco 25300-120
35 mm cell culture dish BD Falcon 45353001
fetal bovine serum (FBS) Gibco 10270-106
L-Glutamine 200 mM, 100x Gibco 25030-024
Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL Gibco 15140-122
Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) Sigma M4526-24x500ML
Protein & RNA analyses
protease inhibitor cocktail Sigma P8340
QIAzol Lysis Reagent Qiagen 79306
AllPrep RNA/Protein Kit Qiagen 50980404
Rneasy mini kit Qiagen 74104
iTaq Universal Probes One-Step Kit Bio-Rad Laboratories 172-5140
Random hexamers Qiagen 79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2x Applied Biosystems 4391128
TaqMan Universal PCR MasterMix Applied Biosystems 4324018
Immunostaining
10% formalin Sigma HT-501128-4L
horse serum Sigma H1138
Triton X-100 Sigma X100-500ML
Bovine Serum Albumina (BSA) Sigma A7906-100G
PARAFILM Sigma P6543
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9542
Phalloidin Alexa 568 Invitrogen A12380
sodium azide Sigma S8032-100g
Hoechst 33342 Sigma 14533
Connexin-43 rabbit primary antibody Sigma C6219 lot#061M4823
sarcomeric α-actinin mouse primary antibody Sigma A7811 lot#080M4864
GATA-4 goat primary antibody R&D AF2606 VAZ0515101
MEF2 rabbit primary antibody Santa Cruz sc-313 lot#E0611
SERCA2 goat primary antibody Santa Cruz sc-8095 lot#D2709
Cy3 secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-165-152
Cy3 secondary antibody Jackson ImmunoResearch 715-165-151
Cy3 secondary antibody Jackson ImmunoResearch 712-165-150
Cy2 secondary antibody Jackson ImmunoResearch 715-225-150
Cy2 secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-225-152
Cy2 secondary antibody Jackson ImmunoResearch 705-225-147

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References

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समस्या १४३ विद्युत उत्तेजना विद्युत उत्तेजना यांत्रिक उत्तेजना विद्युत प्रणाली कार्डियक जनक कोशिकाओं कार्डियक ATDPCs सेल कंडीशनिंग कार्डियक टिशू इंजीनियरिंग कोशिका परिपक्वता रोग मॉडलिंग ड्रग स्क्रीनिंग
एक साथ विद्युत और यांत्रिक उत्तेजना कोशिकाओं ' Cardiomyogenic क्षमता बढ़ाने के लिए
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Llucià-Valldeperas, A., Bragós, R., Bayés-Genís, A. Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential. J. Vis. Exp. (143), e58934, doi:10.3791/58934 (2019).

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