Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 训练细胞群使用电子和机械刺激模拟心脏生理。这种机电刺激增强了治疗细胞的心肌潜能, 是进一步进行细胞治疗、疾病建模和药物筛选的有希望的策略。
Abstract
心血管疾病是发达国家的主要死因。因此, 对有效的心脏细胞疗法的需求促使干细胞和生物工程领域的研究人员在体外开发高保真的人心肌, 用于基础研究和临床应用。然而, 心脏细胞的未成熟表型是获得功能模仿成人心肌的组织的一个限制, 而成年心肌主要以机械和电信号为特征。因此, 该协议的目的是通过机电刺激、重述生理参数来制备和成熟靶细胞群。心脏组织工程正在向更多的生物方法发展, 因此, 基于生物物理刺激的策略正在获得动力。为此目的开发的设备是独特的, 允许单独或同时进行电气和机械刺激, 经过仔细的表征和验证。此外, 尽管该方法已针对这种刺激器和特定的细胞群进行了优化, 但它可以很容易地适应其他设备和细胞系。这里的结果提供了在机电刺激后细胞群心脏承诺增加的证据。运动刺激细胞表现出增加的主要心脏标记表达, 包括早期, 结构, 和钙调节基因。这种细胞调理可用于进一步再生细胞治疗、疾病建模和高通量药物筛选。
Introduction
心功能是基于电激励和机械收缩的耦合。简单地说, 心肌细胞间的连接允许电信号的传播产生几乎同步收缩的心脏, 泵血系统和通过肺系统。因此, 心脏细胞经历了调节基因表达和细胞功能的电和机械力。因此, 许多团体试图开发模仿心脏生理环境的培养平台, 以了解机械和电刺激对心脏发育、功能和成熟的作用。体外电和机械刺激在心脏组织工程中得到了广泛的应用, 以增强功能特性, 提高细胞成熟, 或改善细胞细胞耦合和钙处理1,2,3 个,4 个,5,6,7.,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. 然而, 由于开发刺激器和协议的挑战, 以及由于强制性优化 22, 同步机电调节仍未得到开发22。
初步工作将机电刺激作为电刺激和介质灌注的结合;然而, 流动不涉及应变为基础的变形典型的心室充盈 23,24,25。后来, 更多的生理方法结合电刺激与物理变形或拉伸, 以模仿等体积收缩 26,27,28,29,30 ,31。feng 等人介绍了2005年首次演示机电刺激, 报告心肌细胞大小和收缩特性增强26。wang 等人接受了 5-azacytidine 预处理的间充质干细胞, 并同时进行了电气和机械调理, 改善了再细胞化、细胞活力、心脏分化和组织重塑27。自这些出版物以来, 更多的团体报告了细胞单层或工程组织的机电刺激情况 (例如, black28、vunjak-novakovic29、31和我们的第30组)。第一个被适应的细胞在体内测试 30。简单地说, 摩根和布莱克测试了几种电气和机械刺激的组合, 报告说, 刺激之间的时间是至关重要的, 因为延迟联合机电刺激产生了最好的结果28。接下来, godier-fufurnémont 和合作者从新生大鼠心脏细胞中优化了工程心脏肌肉结构的机电刺激协议, 并首次实现了正力频率关系29。随后, 我们的研究小组报告说, 机电预处理细胞在体外增加了主要心脏标记物的表达, 并在体内产生了广泛的有益作用, 如心脏功能的改善或梗死血管密度的增加边境地区30。最近的出版物表明, 干细胞衍生心肌细胞的心脏组织在机电条件下达到了接近成人成人心脏结构和功能31的成熟水平.此外, 替代的三维刺激平台包括电活性支架, 为所附单元提供电气、机械和地形提示 32.此外, 机械变形 (细胞单层拉伸和压缩) 也可以通过模仿正常生理条件以及极端条件33的可拉伸电极引起。
因此, 其基本原理是, 基于生理条件的体外机电刺激可以增强细胞的心肌潜能。事实上, 这种刺激可以有利于进一步整合治疗细胞到心肌在临床情况下, 或增加组织成熟的药物筛选应用。
此外, 我们分离并鉴定了人类脂肪组织源性心脏祖细胞 (心脏 atdpc)34。这些细胞位于心外膜脂肪中。这些细胞在心肌梗死治疗中表现出有益的组织病理学和功能作用, 同时也保持心脏和内皮分化的潜力。30,35. 我们假设, 在生物物理刺激之后, 这些好处会增加。
因此, 我们为感兴趣的细胞群开发了一种装置和刺激机制, 并对其影响进行了调查。与以前的出版物36相比, 这种机电协议是以无菌和非侵入性的方式诱导主动细胞拉伸的新策略。这里报道的技术详细说明了用于细胞的电气、机械和机电刺激的装置和方法。
该装置可以独立或同时提供电和机械刺激。刺激是用一种非侵入性和无菌的新方法进行的, 该方法包括预灭菌的细胞支架、放置在标准培养板内的电极以及诱导机械和电力的平台 (图 1)。
该平台最多可容纳六个培养板, 由激光切割聚 (甲基丙烯酸甲酯) 和印刷电路板件组成。该平台原型依靠的组合单相可编程计算机控制的电刺激器, 印刷电路板的强大连接的电极, 和 6 10 毫米 x 10 毫米镍镀镍固定的磁铁放置附近的一面的培养板。也有一个铝棒与六个驱动磁铁 (同一模型) 放置在前面的另一侧的培养板, 并移动与线性伺服马达。电机由电机控制器驱动, 通过 rs-232 端口由商业软件操作 (见材料表)。通过用户界面和可编程刺激器, 可以对电强度、脉冲持续时间和频率、机械刺激频率、占空比、脉冲数、脉冲振幅 (磁体偏移) 进行编程,和斜坡。
图 1: 机电刺激器.(a) 用于细胞调理的 pdms 构造。(b) 绘制 pdms 结构, 包括电极和磁铁。(c) 用于执行机电调理的印刷电路板 (平台) 的详细情况。该面板已从 llucia-valdeperas 等人30 人处进行了改装。(d) 机电刺激平台和用户界面 (计算机) 的图片。请点击这里查看此图的较大版本.
在两项国际专利中都充分介绍了刺激装置和机电调理方法, 即 wo-2013185818-a137和 wo-201725159-a138。
生物兼容型有机硅结构旨在为电池、电极和磁体提供结构支持, 此前已有 10、21 种。简单地说, 它们由聚二甲基硅氧烷 (pdms) 组成, 在室温下成型和固化, 杨氏模量为 1.3 mpa, 接近生理水平。该结构包含一个灵活区域 (10 毫米 x 10 毫米 x 2 毫米) 中的细胞培养池、两个固定电极的内部横向插槽和两个嵌入的6毫米 x2 毫米 x4 mm 镀镍的磁铁。电极是由0.2 毫米铂线扭曲周围的2毫米 x 3 毫米 x 12 毫米聚四氟乙烯 (ptfe) 核心酒吧 (21 厘米每个电极, 约23转), 并放置在对面的灵活区域, 以创建一个电场诱导电刺激。机械拉伸是通过在支撑中嵌入的磁体和放置在培养板旁边的外部磁体之间以及在移动的铝臂上的磁吸引来实现的。这样, 细胞支持可以在不打破无菌屏障的情况下扩展。这种方法适用于细胞单层, 但也可以适应三维结构。
此外, 使用规则衍射光栅 (1, 250 声), 可以在细胞播种的地方印上规则图案。由于其透明度和 0.5 mm 的厚度, 在明亮场和荧光显微镜下的 pdms 结构下培养的细胞是可能的直接可视化。在目前的情况下, pdms 培养池具有垂直的表面图案, 垂直于拉伸力, 以将细胞垂直地与电场对齐, 从而最大限度地减少整个细胞的电场梯度。
图 1显示了用于刺激的构造和设备的详细说明。pdms 结构和特性针对细胞拉伸进行了优化 (图 1a. b)。该刺激器的开发和验证是为了有效地应用所需的电和机械刺激的细胞连接到 pdms 结构。此过程包括通过软件界面确保良好的连接性和用户可操作性 (图 1C,D)。
协议部分介绍了使用此定制设备进行细胞刺激的过程。
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Protocol
本研究使用患者样本中的人心脏 atdpc。它们的使用已得到当地道德委员会的批准, 所有患者都给予了知情同意。研究议定书符合《赫尔辛基宣言》概述的原则。
1. 准备工作
- 高压灭菌器两个推子, 12个用于电刺激的铂金 ptfe 电极, 以及一些纸巾, 在121°c 下20分钟。
-
消毒 12个 pdms 自定义构造 (图 1a)。
- 用5毫升的无菌蒸馏水在室温下用磁性搅拌清洗每件材料15分钟。
- 用5毫升的70% 乙醇在室温下用磁搅拌清洗 1x 5分钟。
- 用5毫升无菌蒸馏水在室温下搅拌10分钟每次清洗清洗 5倍, 以去除酒精残留物。
- 在流动柜内的无菌纸巾上擦干结构一夜。
- 将它们存放在无菌的50毫升离心管中, 直至使用。
2. 细胞播种 (第1天)
- 在细胞播种之前, 将清洁后的 pdms 结构转移到无菌板, 并将其暴露在紫外线下 5分钟, 以确保完全灭菌。
- 将每个构造转移到一个35毫米的细胞培养板, 或6孔板, 立即进行细胞播种。
-
胰蛋白酶--心脏 atdpc 的融合 t75 瓶。
- 用1毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗 t75 烧瓶。
- 加入1毫升0.05% 的胰蛋白酶 edta, 在37°c 孵育 5分钟, 分离细胞。
- 添加5毫升的完整介质, 以灭活胰蛋白酶 edta。
- 收集15毫升管中的所有细胞, 用5毫升的 pbs 清洗烧瓶 2x, 收集任何剩余的细胞。
- 在22°c 下, 以 230 x g离心 5分钟, 取出上清液, 并将细胞重新悬浮在完整介质的2毫升中, 用血细胞仪室计数。
- 种子200μl 的心脏 atdpc (2.5 x10 5细胞/ml) 到细胞池的 12个 pdms 结构 (图 1a, b) 有 ~ 80% 的种子表面覆盖的细胞后一天, 并在37°c 和 5% co 2 孵育.
请注意:2-4小时后, 应连接细胞。细胞接种是根据细胞的大小和生长情况制备的。对于较小的细胞, 应增加播种密度。 - 每片轻轻加入2毫升的预热培养基 (α-mL, 补充10% 的胎牛血清、1% 的 l-谷氨酰胺和1% 的青霉素链霉素)。
- 在培养条件下 (通常为37°c 和 5% co2) 隔夜孵化结构。
3. 机电刺激设置 (第0天)
- 在开始这个过程之前, 采取六个结构的机电刺激和六个作为非受刺激的控制。每次刺激少于六个板块, 使用具有相同介质体积的空结构, 以确保适当的电场刺激。
- 用70% 乙醇清洗刺激装置, 并将其放置在流动柜中。
- 将无菌电极和推子放入流柜内。
- 从培养板中取出90% 的介质, 以轻松操作电极和结构。首先, 将 pdms 构造放置在正确的位置, 以确保固定磁体和移动磁体之间的磁吸引 (培养板内的 pdms 位移)。接下来, 将铂金丝连接到 pdms 结构中指定空间中的电极连接器和 ptfe 部件。
- 在每个结构中加入2.5 毫升新鲜预热的完整介质。
请注意:在整个过程中保持无菌状态, 并一次在一个构造上操作。将其余结构保存在孵化器中的37°c 和 5% co 2 中, 直至使用 。 - 一旦所有 pdms 结构都被放置并电连接到平台, 将平台带回37°c 和 5% co 2 的孵化器.
- 连接电气和机械源。
-
配置刺激程序。通过电刺激器的用户界面和控制机械刺激的应用程序, 指定电气和机械刺激机制。设置同步, 如下所示。
- 打开电刺激器。等待主菜单显示在显示屏中。
- 然后, 选择选项 2: 编辑序列 + 输入。
- 编辑序列菜单, 如下所示。
- 使用"模式" 选项卡选择电压或电流。通过单击"+"选择 "当前", 然后按enter.
- 对于 "振幅" 选项卡, 选择带+/的1 (ma) , 然后按enter。
- 对于"期间 (t)", 选择 " 1000 (ms) " + /- ", 然后按enter。
- 用+/将脉冲持续时间 (tw)设置为 2 (ms) , 然后按enter。
- 对于 "触发模式" 选项卡, 选择 "软件外部" , 然后按enter。
- 返回主菜单, 选择选项 4: 生成序列,然后按enter。
注: 电气刺激器处于待机状态, 直到通过串行端口从机械刺激器应用程序收到触发命令。
- 在控制应用程序面板的机械刺激部分执行以下步骤 (图 2c)。
- 在脉冲周期文本控件中写入 1, 000 (ms)。
- 在on time (tw)文本控件中写入 500 (ms), 以设置机械脉冲持续时间。
- 在"游览" 文本控件中写入 2, 000 (au), 以提供10% 的构造伸长率。这是直线控制电机中的步数。
注: 这里应用的刺激协议包括交流电流2毫秒单相方波脉冲 50 mvcm 在1赫兹和10% 拉伸7天。机械脉冲的上升和下降时间设置为100毫秒, 以大致模拟炉膛压力脉冲的形状。此外, 重复模式设置为"连续", 并有一个计数器显示脉冲数。
- 打开电刺激器。等待主菜单显示在显示屏中。
- 每周更换2倍媒体 (周一和周四下午)。首先, 删除旧媒体;接下来, 在 pdms 支持的两侧添加温暖的媒体, 绝不直接在单元格池上。
请注意:如果细胞的生长速度很高, 则媒体应每周更换 3倍 (例如, 星期一、星期三和星期五)。有必要断开并重新连接所有电缆, 但没有必要将培养板和电极从它们的位置移开。 - 在进行实验后收集样品。
4. 实验结束时的样本收集 (第7天)
-
用于 rna 分析
- 用 1x pbs 的3毫升清洗结构 2x 5分钟, 在室温下。
- 在每个板材中加入3毫升0.05% 的色氨酸 edta (足以覆盖整个结构), 在37°c 下等待5分钟。
- 分离细胞后, 添加2毫升的完整培养基, 以灭活胰蛋白酶 edta。
- 收集15毫升管中的所有细胞, 用3毫升的 pbs 清洗结构 2x, 以收集任何剩余的细胞。
- 在220°c 下, 以 230 x g离心5分钟。
- 取出上清液, 重新悬浮 pbs 1 毫升中的颗粒。
- 将电池溶液以 230 x g 的速度转移到 1.5 ml 管和离心机上5分钟。
- 取出上清液, 将颗粒储存在-80°c 的700μl 裂解试剂中, 以便进一步分离 rna。
- 按照制造商的说明, 使用商业试剂盒隔离 rna。
- 根据制造商的协议, 使用试剂盒和随机六分体反向转录分离的 rna。
- 对于小 rna 浓度, 在进行随后的实时逆转录聚合酶链反应 (rt-pcr) 之前, 用无 rnase 的水进行预扩, 然后用 1: 5 稀释。继续使用实时 rt-pcr 的标准协议, 并检查主要心脏标记。
注: 典型的心脏标记包括来自不同类别的早期和晚期标记, 如心脏转录因子 (亚粒特定增强因子 2 a [mef2a]、gat 结合蛋白 4 [gaca-4]) 和结构 (心肌肌钙蛋白 i [ctni], 心脏肌钙蛋白 t [ctnt]、α-放香素) 和钙调节 (Connexin43 [cx43], sarco/内质网 ca2 +-atpase [serca2])30。如有需要, 也可以进行蛋白质隔离。如果样品数量较少, 可以使用市售试剂和试剂盒 (材料表), 使用同一样品同时进行 rna 和蛋白质分离。
-
用于免疫染色
请注意:这直接在连接到 pdms 构造的单元格池的单元格上执行。因此, 我们建议每次将1厘米 x 1 厘米的石蜡膜放置在细胞池顶部, 除了板盖, 以最大限度地减少孵育溶液的蒸发。- 用3毫升的 pbs 清洗结构 2x 5分钟, 在室温下。
- 将连接在结构上的细胞与2毫升的10% 福尔拉林固定 15分钟, 在室温下。
- 用3毫升的 pbs 清洗细胞 3x 5分钟, 在室温下。对于长期储存, 请在4°c 下, 用0.1% 的氮化钠将样品留在 pbs 中。
- 用3毫升的 pbs + 0.5% 的洗涤剂对细胞进行渗透 (3倍, 每次 5–10分钟, 室温下)。
- 在室温下将100μl 的 pbs + 10% 马血清 + 0.2% 洗涤剂 + 1% 牛血清白蛋白培养 1小时, 阻断非特异性抗体结合。
- 在室温下用100μl 的 pbs + 10% 马血清 + 0.2% 洗涤剂 + 1% 的牛血清白蛋白 + 初级抗体对细胞进行1年的培养。例如, 针对 cx43 (1:100)、肉瘤α-放线素 (1:100)、gata-4 (1:100)、mef2 (1:100) 和 serca2 (1:100) 的主要抗体。
- 用3毫升的 pbs 在室温下清洗 3x 5分钟。
- 在室温下, 在黑暗中将细胞在 100μl pbs + 二级抗体中培养1小时。
请注意:采用不同荧光剂和对染剂结合的二级抗体。 - 在室温下在室温下清洗 3x 3 毫升的 pbs 5分钟。
- 在室温下在黑暗中将细胞在 pbs 中进行 100μl (0.1μg/ml) 的培养, 时间为15分钟。
- 在室温下在室温下清洗 3x 3 毫升的 pbs 5分钟。
- 将样品储存在3毫升的 pbs 中, 在4°c 下使用0.1% 的氮化钠, 直至采集。
请注意:由于结构厚度约为 0.5 mm, 因此可以在具有长工作距离目标的倒置荧光和共聚焦显微镜上进行显微镜采集。
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Representative Results
图 2表示单元刺激所遵循的一般架构。简单地说, 细胞播种在 pdms 结构上, 并接受机电刺激, 每周进行两次介质改变。非受激细胞被用作机电调理的控制。此外, 我们在实验中添加了额外的控制, 并使用皮下 atdpc 作为心脏 atdpc 的对照。皮下 atdpc 是通过皮下脂肪组织获得的, 经过与心脏 atdpc33相同的隔离和培养过程。连接到 pdms 结构的细胞证明了一个典型的纺锤形表型前后的刺激。此外, 细胞根据图案表面对齐, 在这种情况下遵循垂直图案。
电气和机械刺激首先单独优化。首先, 电刺激是基于先前的一项研究, 在这项研究中, 交流电流2毫秒单相方波脉冲 50 mvcm 在1赫兹被发现是最好的心脏 atdpc10。我们报告说, 电刺激增加了心脏 atdpc 中早期心脏标记的表达, 如 MEF2A (p = 0.050) 和 gata-4 (p = 0.050), 但没有观察到对结构和钙处理基因的影响 (未显示数据).
其次, 机械刺激协议由10% 的拉伸和具有50% 占空比的 1 hz 梯形波形组成, 具有100毫秒的上升和下降时间来模拟心脏中的压力循环, 如21之前的完整描述。机械刺激的心脏 atdpc 增强了表链素 (p = 0.001) 或 ctni (p = 0.044) 等结构基因的表达, 早期心脏标记物 gata-4 (p = 0.044) 和 t 盒的表达呈增加趋势转录因子 5 (tbx5;p = 0.65) (未显示数据)。机械刺激产生的影响在很大程度上取决于图案表面。
随后, 这两个方案结合起来, 有效的机电刺激心脏 atdpc, 类似于血液填塞。由此产生的协议包括交流电流2毫秒单相方波脉冲, 在1赫兹为 50 mvcm, 在 7天30内拉伸10%。总体而言, 机电刺激的心脏 atdpc 增强了其心肌潜能。刺激心脏 atdpc 增加了早期和晚期心脏基因的表达 (图 3a), 即心脏转录因子 gata-4 (p = 0.050), 结构标记β-肌球蛋白重链 (β-mhc;p = 0.000), 和钙相关基因 cx43 (p = 0.025)。机电刺激引起的基因调控也被翻译在蛋白质水平 (图 3b-m)。针对肌动蛋白纤维的 phalloidin 染色表明, 大多数细胞根据垂直模式排列, cx43 的分布主要是在细胞质和质膜上, 通过间隙促进细胞间的交流(图 3b-e)。mf2 和 gata-4 转录因子位于心脏 atdpc 的细胞核中;然而, 在皮下 atdpc 中没有检测到 gata-4 (图 3f-m)。细胞质标记 serca2 和肉瘤α-放线素没有显示出一种典型的心肌细胞成熟肉瘤组织, 在控制和刺激细胞群中也没有观察到跳动 (图 3f-m)。
图 2: 机电刺激程序、单元和用户界面.(a) 机电刺激模式与代表性图像的非受激细胞在第0天和被激发细胞在第7天, 都在构造与垂直表面样式。刻度杆 = 100μm (b) 机电刺激单元: 种子 pdms 结构、电极和固定移动磁体。(c) 控制应用面板的机械刺激。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:心脏和皮下 atdpc 的机电刺激后主要心脏标志物的基因和蛋白质表达.(a) 心脏和皮下 atdpc 主要心脏基因的实时 pcr。心脏和皮下 atdpc 在受激对照组和非条件对照组中的相对表达。将值归一化为甘油-3-磷酸脱氢酶表达, 并在六个独立实验中显示为平均±sem。* p < 0.05 (显著性)。( B-M )在控制和刺激细胞的主要心脏标记物垂直图案表面表达上的心脏和皮下 atdpc 中的蛋白质表达。控制中的非光素染色 (放丁f; 红色) 和 cx43 表达 (绿色)、serca2 (红色)、mef2 (绿色)、肉瘤α-放线素 (红色) 和 gata-4 (绿色) 表达 (在b、 d、 f、 h、j 和 l 中)) 和刺激 (在面板 c, e, g, i, k和 m ) 心脏 (左) 和皮下 (右) atdpc. 核子被 dapi (蓝色; b-e 、 l和 m) 作了反染色。刻度柱 = 50μm。这一数字已从 llucia-valdeperas 等人30 人处修改。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
机电刺激似乎是一个安全的选择, 准备细胞的敌对心脏环境, 并提高他们的心脏承诺。在这里, 描述的心脏祖细胞的协议增加了主要心脏标记的表达, 并被报道是有益的, 他们的下一个植入梗死小鼠心肌 30.一般来说, 机电刺激的心脏 atdpc 增加了与早期、结构和钙调节相关的基因表达, 而这在以前的电气或机械刺激中从未单独实现过。事实上, 机电刺激的心脏 atdpc 显示出一个更完整的轮廓, 似乎比以前报告更致力于心脏血统。
在机电刺激后, 尤其是在心脏 atdpc 明显增强后, 与皮下 atdpc 相比, 这两种细胞类型的心脏基因表达均得到调节。这一结果可能是用于细胞分离的脂肪组织的起源, 即心外膜或皮下脂肪的起源。心外膜脂肪组织是心脏和心包周围的代谢活性器官, 也是祖细胞的来源。令人感兴趣的是, 心外膜脂肪与心肌具有解剖和功能的连续性。在正常情况下, 心外膜脂肪具有生化和热原心保护特性;相反, 在病理条件下, 它可以分泌促炎细胞因子影响心脏39。事实上, 心脏 atdpc 具有固有的心样表型, 并表现出心脏标记的本构表达, 如 cx43, 肉瘤α-放线素, serca2 和 gata-4, 与皮下 atdpc, 这不是适应心脏环境34。因此, 对心脏祖细胞, 其生态位接近或在心肌环境内, 机电刺激产生的影响可能更大。
从基因调控在很大程度上取决于细胞群的最后一次观察中, 建议对每个细胞群进行协议优化, 并从该协议中描述的数据中提取近似值。细胞机电刺激中最关键的步骤是细胞连接和刺激机制 (强度、持续时间、频率)。
例如, 电气参数是至关重要的。事实上, 所施加的电场强度对于非电细胞来说是最佳的, 因此增加值更适合有电活动的细胞, 例如不成熟的多能干细胞衍生心肌细胞40,41.心脏 atdpc 电刺激的初步实验表明, 直流电电流和高压诱导细胞生长停止和细胞死亡10。根据这些结果, 采用了交流电流和低压协议进行进一步的实验。
此外, 一些细胞谱系对 pdms 表面的连接较低, 因此建议进行涂层或等离子体处理, 以丰富播种效率 42.此外, 细胞播种应适应每个细胞的大小和生长, 降低高增殖细胞的值或增加较小的细胞;因此, 建议在 pdms 结构上播种几种密度的一些试验。最后, 在单元格单层上执行协议, 对于三维场景 (即单元格密度), 值可能略有不同。
此外, 表面模式在机械细胞训练中发挥着关键作用。结果表明, 细胞根据模式对齐, 不同表面机械刺激后的表现不一样。例如, 机械刺激心脏 atdpc 播种在垂直图案的表面 (垂直于拉伸力) 分泌的蛋白质与心肌梗死和细胞外基质重塑图案。机械化的心脏 atdpc 播种在非图案表面分泌的与心脏再生相关的蛋白质21。
上述已介绍了此方法的主要功能。然而, 重要的是要强调无创方法的细胞拉伸作为一个独特的方法来实现这些功能。有趣的是, 因为同一装置可以提交电气和机械刺激, 直接比较不同刺激和细胞产生的影响是可能的。此外, 由于透明性和稀薄性, 在结构上播种的细胞的可视化是评估细胞在刺激之前、期间和之后的状态的明显优势。
设备和协议有一些限制, 其中一些已经注意到。首先, 它是为单层细胞培养而设计和优化的, 而不是为三维细胞培养而设计和优化的。具体来说, 只有粘附细胞可以在单层设置中使用。对于不粘附细胞, 应采用三维方法。二是结构尺寸限制播种面;因此, 受激细胞的数量是小的, 每个实验集需要几个复制来收集足够的样本, 以进一步的基因或蛋白质分析。对于需要更高的细胞剂量的大型动物实验或临床翻译, 必须进行扩大规模;在这种情况下, 可以考虑较大的刺激表面。
该协议的主要应用包括细胞调理、疾病建模和药物筛选。这种刺激增强细胞成熟, 其应用将有助于实现和保持一个更成熟的表型。一方面, 模仿成人心肌中的功能表型的细胞对于疾病建模和片上器官实验至关重要。事实上, 人类活检不能代表疾病的进展, 因为它们通常是终末期或尸检样本, 而动物模型并不总是重述人类的生理和症状。然而, 人类诱导多能干细胞的使用已成为一种替代的建模方法, 以解开病理发展的机制 43.此外, 片上器官是在体外生长的微型组织和器官, 可以模拟人体 (patho) 生理, 并模仿三维结构。其目的是建立一个功能最低的单元, 能够以可控和直接的方式重述人类生理和疾病的某些方面, 并解决现有细胞和动物模型的局限性。
另一方面, 药物筛选需要在高通量、小型化系统中模拟体内生物物理环境的培养平台, 通过心肌细胞反应来测试药物的安全性和有效性。成熟的细胞可用于在高通量分析中重述与临床相关的读数 (即收缩动力学), 阐明疾病机制并确定新的治疗靶点 45.
心脏场是该协议的主要范围, 但它可以很容易地适应神经元或骨骼域, 因为这些环境的特点是电气和机械刺激。以前关于物理刺激的研究表明了有益的结果46,47,48,49, 50.
最后, 介绍了一种新的心脏 atdpc 同步机电调理方案。由此产生的协议和设备已被广泛测试和验证的个人和同步刺激。atdpc 的同步机电调理增强了其心肌潜能, 并成为细胞治疗、疾病建模和药物筛选的一种有前途的策略。
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Disclosures
提交人没有什么可透露的, 只是刺激装置和协议以前获得了专利 (wo-201201185818-a1, wo-201711259-a1)。
Acknowledgments
作者要感谢 icrec 研究项目 (igtp, badalona) 和电子和生物医学仪器仪表组 (upc, 巴塞罗那) 的成员, 特别是 j. rocel-ferrer 教授。此外, 作者还承认 stem cels 转化医学杂志和 alphamed 出版社允许改编以前发表的数字 (llucia-valldeperas 等).30). 这一原型的开发和议定书的设计得到了欧洲联盟委员会第7个框架方案 (saf 2014-59892)、经济和竞争事务部 (saf----第7个框架方案) 的支持。Marató, nmp3-sl-2009-29239)、fundacióla maratóde tv3 (080330, 201516, 201516) 和 fundación para la Prospectiva y la prospectivión en salud en españa (fipse; 06-00001396-15)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2x | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
References
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