Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utbilda en cell befolkningen som använder elektriska och mekaniska stimuli efterlikna hjärtats fysiologi. Denna elektromekaniska stimulering förbättrar cardiomyogenic potentialen hos de behandlade cellerna och är en lovande strategi för ytterligare cellterapi, sjukdom modellering och drogkontroll.
Abstract
Hjärt-och kärlsjukdomar är den vanligaste dödsorsaken i utvecklade länder. Efterfrågan på effektiv hjärt cellterapi har följaktligen motiverat forskare i bioteknik fälten och stamceller att utveckla in vitro- HiFi-mänskliga myokardiet för både grundforskning och kliniska tillämpningar. Omogna fenotypen av hjärtats celler är dock en begränsning på att erhålla vävnader som funktionellt härmar vuxna hjärtmuskeln, som kännetecknas främst av mekaniska och elektriska signaler. Syftet med detta protokoll är således att förbereda och mogen cell målpopulationen genom elektromekaniska stimulering, går igenom fysiologiska parametrar. Hjärt vävnadsteknik utvecklas mot mer biologiska metoder och strategier utifrån biofysiska stimuli, således fart. Enheten för detta ändamål är unik och tillåter enskilda eller samtidiga elektrisk och mekanisk stimulering, noggrant kännetecknas och valideras. Dessutom, även om metoden har optimerats för denna stimulator och en viss cell befolkningen, kan det enkelt anpassas till andra enheter och cellinjer. Resultatet här erbjuda bevis på ökad hjärt engagemang i cell befolkningen elektromekaniska stimulation. Elektromekaniskt stimuleras cellerna visar ett ökat uttryck av huvudsakliga kardiella markörer, inklusive tidiga, strukturella och kalcium-reglerande gener. Denna cell konditionering kan vara användbar för ytterligare regenerativ cellterapi, sjukdom modellering och hög genomströmning drogkontroll.
Introduction
Hjärtats funktion är baserad på kopplingen av elektrisk magnetisering och mekaniska kontraktion. Kort, tillåta hjärtmuskelcellen intercellulära junctions elektriska signalen förökning producera nästan synkron sammandragningar av hjärtat att pumpa blod systemiskt och via systemets pulmonell. Hjärtats celler, genomgå således både elektriska och mekaniska krafter som reglerar geners uttryck och cellulär funktion. Följaktligen har många grupper försökte utveckla kultur plattformar som efterliknar hjärt fysiologiska miljön för att förstå rollen av mekanisk och elektrisk stimulering på hjärt utveckling, funktion och mognad. In vitro elektriska och mekaniska stimuli har individuellt tillämpats i stor utsträckning hjärt vävnadsteknik att förbättra funktionella egenskaper, öka cell mognad eller förbättra cell cell koppling och kalcium hantering1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. dock synkron elektromekaniska luftkonditionering förblir outnyttjade på grund av utmaningen att utveckla en stimulator och protokoll, och den obligatoriska optimering22.
Förberedande arbetet behandlas elektromekaniska stimulering som en kombination av elektrisk stimulering och media perfusion; dock innebär inte flödet stam-baserade deformation typiska ventrikulära fyllning23,24,25. Senare, kombinerat mer fysiologiska metoder elektriska stimuli med fysiska deformering eller stretch att efterlikna isovolumetric sammandragning26,27,28,29,30 ,31. Feng et al. beskrivs den första demonstrationen av elektromekaniska stimulering i 2005, rapportering enhanced hjärtmuskelcellen storlek och kontraktila egenskaper26. Wang et al. förbehandlats mesenkymala stamceller med 5-azacytidine och tillämpas samtidig elektriska och mekaniska luftkonditionering, förbättra recellularization, cellernas viabilitet, hjärt differentiering och vävnad remodeling27. Sedan dessa publikationer, fler grupper har rapporterats på elektromekaniska stimulering av cell enskiktslager eller konstruerad vävnader (t.ex. svart28, Vunjak-Novakovic29,31och vår grupp30) med den första luftkonditionerade celler testade i vivo30. Kort, Morgan och svart testade flera kombinationer av elektriska och mekaniska stimuli, rapportering att tajmingen mellan stimuli var avgörande eftersom försenade kombinerade elektromekaniska stimulering gav den bästa results28. Nästa, Godier-Furnémont och medarbetare optimerad en elektromekanisk stimulering protokoll för bakåtkompilerade hjärtat muskler konstruktioner från neonatal råtta hjärtats celler och uppnås, för första gången, en positiv kraft-frekvens relation29. Efteråt, rapporterade vår grupp att elektromekaniskt betingade celler ökat uttryck av huvudsakliga kardiella markörer i vitro och bred välgörande effekter in vivo, såsom förbättrad hjärtfunktion eller ökade fartyget täthet i infarct gränsen region30. Senaste publikationen visade att hjärt vävnader från stem-cell-derived hjärtmuskelcellerna utsätts för elektromekaniska luftkonditionering nått en mognad nivå närmare mänskliga vuxen hjärt struktur och funktion31. Dessutom alternativa tredimensionella stimulering plattformar omfattar elektroaktiva ställningar som ger elektriska, mekaniska och topografiska ledtrådar till cellerna fäst32. Dessutom kan mekanisk deformation (cell enskiktslager stretching och komprimering) också induceras med töjbart elektroder härma normala fysiologiska förhållanden samt extrema förhållanden33.
Syftet är därför att in vitro-elektromekaniska stimuli utifrån fysiologiska förhållanden skulle kunna öka cardiomyogenic potentialen i en cell. Denna stimulering kunde faktiskt gynna ytterligare integrationer av terapeutiska celler i hjärtmuskeln i kliniska scenario eller öka vävnad mognad för drogkontroll applikationer.
Dessutom vi isolerade och kännetecknas en befolkning av mänsklig fettvävnad-derived stamceller av hjärt ursprung (hjärt ATDPCs)34. Dessa celler är belägna i epikardiell fettet. Dessa celler Visa positiva histopatologiska och funktionella effekter i behandling av hjärtinfarkt och även underhålla hjärt- och endotelceller differentiering potentiella. 30 , 35. vi hypotesen att dessa fördelar skulle öka biofysiska stimulation.
Därför vi utvecklat en enhet och en stimulering regim för cell befolkningen av intresse och undersökt effekterna. Detta elektromekaniska protokoll är en ny strategi att inducera aktiv cell sträcker sig i ett sterilt sätt och jämfört noninvasivt med tidigare publikationer36, i kombination med elektriskt fält stimulering. Den teknik som redovisas här förklarar i detalj enheten och metod som används för elektriska, mekaniska och elektromekaniska stimulering av celler.
Denna enhet kan ge både elektrisk och mekanisk stimulering, självständigt eller samtidigt. Stimulering utförs med en icke-invasiv och aseptiska ny metod som inkluderar presterilized cell support, elektroder placeras inuti en standard kultur-tallrik och en plattform som inducerar de mekaniska och elektriska krafterna (figur 1).
Plattformen rymmer upp till sex kultur plattor och består av en smörgås struktur av laserskuren poly(methyl methacrylate) och kretskort bitar. Plattformen prototypen bygger på en kombination av en monofasiska programmerbara datorstyrda elektrisk stimulator, ett tryckt kretskort för robust anslutning av elektroder och sex 10 x 10 mm x 5 mm förnicklat neodymium-fasta magneter placeras nära en sida om kultur plattorna. Det finns också en aluminium bar med sex drivande magneter (samma modell) placeras framför den andra sidan av kultur plattorna och flyttade med en linjär servomotor. Motorn drivs av en motor controller, drivs via en RS-232 port av kommersiell programvara (se Tabell för material). Genom användargränssnittet och programmerbara stimulator är det möjligt att programmera elektriska intensiteten, puls varaktighet och frekvens, frekvensen av mekanisk stimulering, dess arbetscykel, antalet pulser, puls amplituden (magnet utflykt), och lutningen.
Figur 1 : Elektromekaniska stimulator. (A), PDMS konstruktion används för cellen att villkora. (B) ritning av den PDMS bygga, inklusive elektroder och magneter. (C) detalj av kretskortet (plattform) används för att utföra de elektromekaniska konditionering. Denna panel har ändrats från Llucià-Valldeperas et al.30. (D) bild av det elektromekaniska stimulering plattform och användargränssnittet (dator). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Både stimulatorn och metoden för elektromekaniska luftkonditionering beskrivs fullt i två internationella patent, WO-2013185818-A137 och WO-2017125159-A138.
Biokompatibelt silikon konstruktioner avsedda att ge strukturellt stöd till celler, elektroder och magneter har beskrivits tidigare10,21. Kort, de består av Polydimetylsiloxan (PDMS), gjutna och härdas vid rumstemperatur, med Youngs modulus av 1.3 MPa, nära fysiologiska nivåer. Konstruktionen innehåller en cell kultur pool i ett flexibelt område (10 x 10 x 2 mm), två inre tvärgående slots att hålla elektroderna och två inbäddade 6 x 2 mm x 4 mm förnicklat neodymiummagneter. Elektroderna är byggda med 0,2 mm platina tråd vriden runt en 2 x 3 mm 12 mm polytetrafluoreten (PTFE) core bar (21 cm per elektrod, cirka 23 varv) och placerade på motsatta sidor av flexibla området för att skapa ett elektriskt fält för att inducera elektrisk stimulering. Mekaniska stretching uppnås genom magnetisk attraktion mellan magneter inbäddade i stöd och yttre magneter som placeras bredvid kultur plattan och på de rörliga aluminium-arm. På detta sätt kan cellen stödet förlängas utan att bryta den sterila barriären. Denna metod är lämplig för en cell enskiktslager men kan anpassas till tredimensionella konstruktioner, samt.
Dessutom kan ett regelbundet mönster vara präglade där cellerna är seedade, använder styrde diffraktion galler (1,250 räfflor/mm). Direkt visualisering av celler odlade på den PDMS bygga under brightfield och fluorescerande Mikroskop är möjligt på grund av dess öppenhet och 0,5 mm tjocklek. I det aktuella fallet har PDMS kultur poolen en vertikal ytmönster, vinkelrätt mot den stretching kraften, att anpassa cellerna vinkelrätt till det elektriska fältet, vilket minimerar elektriska fältet övertoningen över cellen.
Figur 1 visar en detaljerad beskrivning av konstruktion och enhet som används för att stimulera. PDMS konstruera och egenskaper är optimerade för cell stretching (figur 1A, B). Stimulatorn är utvecklats och validerats för en effektiv tillämpning av önskad elektrisk och mekanisk stimulering till celler som bifogas den PDMS konstruktion. Denna process omfattar att säkerställa bra anslutningsmöjligheter och användaren användbarhet genom programvarugränssnitt (figur 1 c, D).
Förfarandet för cell stimulering använder denna specialtillverkade enhet beskrivs i avsnittet protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie använder mänskliga hjärt ATDPCs från patientprover. Deras användning har godkänts av den lokala etiska kommittén, och alla patienter gav informerat samtycke. Studieprotokollet överensstämmer med principerna i Helsingforsdeklarationen.
1. förberedelser
- Autoklav två pincett, 12 platina PTFE elektroder för elektrisk stimulering, och några pappershanddukar, vid 121 ° C i 20 min.
-
Sterilisera 12 PDMS skräddarsydda konstruktioner (figur 1A).
- Tvätta varje konstruktion med 5 mL steril, destillerat vatten med magnetiska agitation i rumstemperatur i 15 min.
- Tvätta 1 x 5 ml 70% etanol med magnetiska agitation i rumstemperatur i 5 min.
- Tvätta 5 x med 5 mL steril, destillerat vatten med magnetiska agitation i rumstemperatur i 10 min per tvätt, ta bort alkoholhaltiga rester.
- Torra konstruktioner på sterila hushållspapper inuti skåp över natten i flödet.
- Förvara dem i sterila 50 mL centrifugrör fram till användning.
2. cellen sådd (dag -1)
- Innan cellen sådd, överföra de rengjorda PDMS-konstruktioner till sterila plattor och utsätta dem för ultraviolett ljus för 5 min att säkerställa fullständig sterilisering.
- Överföra varje konstruera en 35 mm cell kultur plattan, eller 6-well platta, för omedelbar cell sådd.
-
Trypsinize en konfluenta T75 kolv med hjärt ATDPCs.
- Tvättas T75 kolven med 5 mL av 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 1 mL 0,05% trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C i 5 min till lossa cellerna.
- Tillsätt 5 mL av komplett medium att inaktivera den trypsin-EDTA.
- Samla alla celler i en 15 mL tub och tvätta kolven 2 x 5 ml PBS att samla alla resterande celler.
- Centrifugera vid 230 x g under 5 minuter vid 22 ° C, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 2 mL komplett medium att räkna dem med hemocytometer kammare.
- Utsäde 200 µL hjärt ATDPCs (2,5 x 105 celler/mL) i cell poolen av 12 PDMS konstruktioner (figur 1A, B) att ~ 80% av sådd ytan täckt av celler dagen efter och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: Efter 2 – 4 h, ska cellerna bifogas. Cell inokulum är upprättad enligt Cellstorlek och tillväxt. För mindre celler höjas sådd densiteten. - Försiktigt och tillsätt 2 mL av förvärmd komplett medium (α-MEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 1% L-glutamin och 1% penicillin-streptomycin) per platta.
- Inkubera konstruktioner på odlingsbetingelser (oftast 37 ° C och 5% CO2) över natten.
3. elektromekaniska stimulering Setup (dag 0)
- Innan du startar proceduren, ta sex konstruktioner för elektromekaniska stimulering och sex som nonstimulated kontroller. Med färre än sex plattor per stimulering, använda tomma konstruktioner med samma medium volym för att säkerställa korrekt elektriskt fält stimulering.
- Rengöra enheten stimulering med 70% etanol och placera den i flödet skåp.
- Sätta de sterila elektroder och pincett inuti skåpet flöde.
- Ta bort 90% av media från kultur plattan till enkelt manipulera elektroder och konstruktioner. Först placera PDMS konstruktioner i rätt position att säkerställa magnetiska attraktion (PDMS förskjutning inom kultur plattan mot magneten) mellan både fasta och mobila magneter. Anslut den platina tråden till elektroden kontakterna och PTFE delen i dess avsedda utrymmet i den PDMS konstruktion.
- Tillsätt 2,5 mL färska förvärmd komplett medium till varje konstruktion.
Obs: Provbehållarna under hela förfarandet och verka på en konstruktion på en gång. Behålla resten av konstruktioner i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 fram till användning. - När alla PDMS konstruktioner är placerade och elektriskt ansluten till plattformen, återföra plattformen till inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
- Anslut den elektriska och mekaniska källan.
-
Konfigurera programmet stimulering. Ange elektrisk och mekanisk stimulering regimer genom användargränssnitten i den elektriska stimulatorn och programmet som styr mekanisk stimulering. Så här anger du SYNKRONISM.
- Slå på den elektriska stimulatorn. Vänta tills huvudmenyn visas i displayen.
- Markera Alternativ 2: redigera sekvens + retur.
- Så här redigerar du sekvensen menyn .
- Använd fliken Mode för att välja antingen spänning eller ström. Välj aktuell genom att klicka + och tryck på RETUR.
- 1 (mA) med +/- för fliken amplitud och tryck på Enter.
- För Perioden (T), 1000 (ms) med +/- och tryck på Enter.
- Ange pulslängd (Tw) till 2 (ms) med +/- och tryck på RETUR.
- Fliken Trigger-läge Välj externa program och tryck på RETUR.
- Tillbaka i huvudmenyn, Välj alternativ 4: generera sekvens och tryck på RETUR.
Obs: Den elektriska stimulatorn vilar i vänteläge tills den får ett trigger-kommando från den mekaniska stimulator för via den seriella porten.
- Utför följande steg i avsnittet mekanisk stimulering av ansökan Kontrollpanelen (figur 2C).
- Skriv 1000 (ms) i kontrollen Puls Period text.
- Skriv 500 (ms) i kontrollen om tid (Tw) text ställa den mekaniska pulslängd.
- Skriv 2,000 (AU) i kontrollen utflykt text att leverera en 10% konstruera töjning. Detta är antalet steg i den linjära Reglermotor.
Obs: Stimulering protokollet tillämpas här består av omväxlande-nuvarande 2 ms monofasiska kvadratiska våg pulser av 50 mV/cm vid 1 Hz och 10% stretching för 7 dagar. Tidens uppgång och fall av mekaniska puls ställs in på 100 ms, att imitera ungefär formen av härden trycket pulsen. Även funktionen repetition är inställd på kontinuerlig och det finns en räknare som visar antalet pulser.
- Slå på den elektriska stimulatorn. Vänta tills huvudmenyn visas i displayen.
- Ändra media 2 x per vecka (måndag och torsdag eftermiddag). Ta först bort det gamla mediet; Lägg det varma mediet på sidorna av PDMS stöd, aldrig direkt på cell poolen.
Obs: Om cellerna har en hög tillväxttakt, bör media ändrade 3 x per vecka (t.ex. måndag, onsdag och fredag). Det är nödvändigt att koppla från och återanslut alla kablar, men det finns ingen anledning att avlägsna kultur plattor och elektroder från sin plats. - Samla in proverna efter experimenterandet utförs.
4. provtagning i slutet av experimenterandet (dag 7)
-
För RNA analyser
- Tvätta bygga 2 x med 3 mL 1 x PBS för 5 min i rumstemperatur.
- Tillsätt 3 mL 0,05% trypsin-EDTA till varje tallrik (tillräckligt för att täcka den hela konstruktionen) och vänta 5 min vid 37 ° C.
- När cellerna är fristående, tillsätt 2 mL av komplett medium att inaktivera den trypsin-EDTA.
- Samla alla celler i en 15 mL röret och tvätta bygga 2 x med 3 mL PBS att samla alla resterande celler.
- Centrifugera vid 230 x g under 5 minuter vid 22 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL PBS.
- Överföra den cell lösningen i en 1,5 mL rör och centrifugera vid 230 x g under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och lagra pelleten vid-80 ° C i 700 µL lysis reagens för ytterligare RNA isolering.
- Isolera RNA med hjälp av ett kommersiellt kit, följa tillverkarens instruktioner.
- Omvänd-transkribera isolerade RNA med hjälp av kit och slumpmässiga hexamers, enligt tillverkarens protokollet.
- För små RNA koncentrationer, preamplify och späd sedan, 1:5 med RNase-fritt vatten innan efterföljande realtid omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) utförs. Fortsätta med standardprotokollet för realtid RT-PCR och markera viktiga kardiella markörer.
Obs: Typiska kardiella markörer omfatta tidiga och sena markörer från olika kategorier, såsom hjärt transkriptionsfaktorer (myocyt-specifika enhancer faktor 2A [MEF2A], GATA-bindande protein 4 [GATA-4]) och strukturella (hjärt troponin jag [cTnI], hjärt Troponin T [cTnT], α-actinin) och kalcium förordning (Connexin43 [Cx43], sarco-/ endoplasmatiska retiklet Ca2 +-ATPas [SERCA2])30. Protein isolering kan också utföras om det behövs. Samtidiga RNA och protein isolering kan utföras med samma prov, använder kommersiellt tillgängliga reagens och Kit (Tabell för material) om antalet prov är mindre.
-
För immunostainings
Obs: Detta utförs direkt på cellerna kopplad till cell av den PDMS konstruktion. Därför rekommenderar vi att placera, varje gång, 1 x 1 cm av paraffin film på toppen av cell poolen, förutom plattan locket för att minimera avdunstningen av inkubering lösningar.- Tvätta bygga 2 x med 3 mL PBS för 5 min i rumstemperatur.
- Fixa de celler som bifogas konstruktionen med 2 mL 10% formalin för 15 min i rumstemperatur.
- Tvätta cellerna 3 x med 3 mL PBS för 5 min i rumstemperatur. För långsiktig lagring, lämna proverna i PBS med 0,1% natriumazid vid 4 ° C.
- Permeabilize cellerna med 3 mL PBS + 0,5% tvättmedel (3 x, varje tid 5-10 min, i rumstemperatur).
- Inkubera cellerna med 100 µL av PBS + 10% häst serum + 0,2% tvättmedel + 1% bovint serumalbumin i rumstemperatur i 1 h, för att blockera ospecifik antikropp bindande.
- Inkubera cellerna med 100 µL av PBS + 10% häst serum + 0,2% tvättmedel + 1% bovint serumalbumin + primär antikropp i rumstemperatur i 1 h. Till exempel primär antikroppar mot Cx43 (1: 100), sarcomeric α-actinin (1: 100), GATA-4 (1:50), MEF2 (1:25), och SERCA2 (1:50).
- Tvätta 3 x med 3 mL PBS i rumstemperatur i 5 min.
- Inkubera cellerna med 100 µL av PBS + sekundär antikropp i rumstemperatur i mörkret för 1 h.
Obs: Sekundära antikroppar konjugerat med olika fluorophores och en counterstaining agent användes. - Tvätta dem 3 x med 3 mL PBS vid rumstemperatur i mörkret för 5 min.
- Inkubera cellerna med 100 µL av nukleär färgning (0.1 µg/mL) i PBS vid rumstemperatur i mörkret i 15 min.
- Tvätta dem 3 x med 3 mL PBS vid rumstemperatur i mörkret för 5 min.
- Lagra proverna i 3 mL PBS med 0,1% natriumazid vid 4 ° C fram till förvärvet.
Obs: Mikroskopet förvärv är möjligt på omvänt lysrör och confocal Mikroskop med lång arbetande avståndet mål eftersom konstruera tjockleken är ca 0,5 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 representerar allmänna schemat följt för cell stimulering. Kortfattat, celler var seedade på den PDMS konstruktionen och genomgå elektromekaniska stimulering, med en media förändring utförs två gånger i veckan. Nonstimulated celler användes som kontroll för elektromekaniska konditionering. Dessutom har vi lagt en extra kontroll till experimentet och subkutan ATDPCs användes som en kontroll för hjärt ATDPCs. Subkutana ATDPCs erhålls från subkutan fettvävnad, efter samma isolering och kultur förfaranden när det gäller hjärt ATDPCs33. Celler som bifogas den PDMS konstruktionen framgår en typisk spolformade fenotyp före och efter stimulering. Dessutom cellerna justerad enligt den mönstrade ytan, i detta fall efter det vertikala mönstret.
Elektriska och mekaniska stimuli var först individuellt optimerade. Först, elektrostimulering baserades på en tidigare studie i vilken Alternerande ström 2 ms monofasiska kvadratiska våg pulser av 50 mV/cm vid 1 Hz befanns vara bäst för hjärt ATDPCs10. Vi rapporterade att elektrisk stimulering ökat uttryck av tidiga kardiella markörer i hjärtats ATDPCs, såsom MEF2A (P = 0,050) och GATA-4 (P = 0,031), men observerades inga effekter på strukturella och kalcium-hantering gener (inga data anges) .
Andra protokollet mechanostimulation bestod av 10% stretching och 1 Hz Trapetsformat waveform med en månadskapacitet på 50%, med 100 ms stiga och falla cykeltider att imitera trycket i hjärtat, som beskrivs i full innan21. Mekaniskt stimuleras hjärt ATDPCs augmented uttrycket av strukturella gener, såsom α-actinin (P = 0,001) eller cTnI (P = 0,044), och visade en ökande trend för tidiga kardiella markörer, GATA-4 (P = 0.068) och T-box transkriptionsfaktor 5 (Tbx5; P = 0,065) (inga data anges). Effekter som härrör från mekanisk stimulering var starkt beroende av den mönstrade ytan.
Därefter kombinerades båda protokollen för en effektiv elektromekanisk stimulering av hjärtats ATDPCs, som liknar ventrikeln-fyllning av blod. Resulterande protokollet består omväxlande-nuvarande 2 ms monofasiska kvadratiska våg pulser av 50 mV/cm vid 1 Hz och 10% stretching för 7 dagar30. Sammantaget förbättrade elektromekaniskt stimuleras hjärt ATDPCs sina potentiella cardiomyogenic. Stimulerad hjärt ATDPCs ökade uttrycket av tidiga och sena hjärt gener (figur 3A), nämligen den kardiella transkriptionsfaktor GATA-4 (P = 0,050), den strukturella markör β-myosin tunga kedjan (β-MHC; P = 0.000), och kalcium-relaterade genen Cx43 (P = 0,025). Gen modulationer följd av elektromekaniska stimulering översattes också på proteinnivå (figur 3B-M). Phalloidin färgning mot aktin fibrer visade att flertalet celler justerade enligt det vertikala mönstret och att den Cx43 fördelningen var mestadels i cytoplasman och på plasmamembranet, att bidra till kommunikationen genom gap korsningar (figur 3B-E). MEF2 och GATA-4 transkriptionsfaktorerna var belägna på kärnorna i hjärt ATDPCs; GATA-4 påvisades dock inte i subkutan ATDPCs (figur 3F-M). Den cytoplasmiska markörer SERCA2 och sarcomeric α-actinin visade inte en mogen sarcomere organisation typiska för hjärtmuskelceller och stryk observerades inte i kontroll och stimuleras cellpopulationer (figur 3F-M).
Figur 2 : Elektromekaniska stimulering förfarande, enhet, och användargränssnitt. (A) elektromekaniska stimulering schemat med representativa bilder av nonstimulated på dag 0 och stimulerade celler på dag 7, både på konstruktioner med den vertikala ytmönster. Skala barer = 100 µm. (B) elektromekaniska stimulering enheten: seedade PDMS konstruera, elektroder och fast/mobil magneter. (C) ansökan kontrollpanel för mekanisk stimulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Gen och protein uttryck för de huvudsakliga kardiella markörerna efter elektromekaniska stimulering av hjärt- och subkutan ATDPCs. (A) Real-time PCR av huvudsakliga hjärt gener i hjärt- och subkutan ATDPCs. Det relativa uttrycket av cardiomyogenic markörer i stimulerade kontra nonconditioned kontroller visas för hjärt- och subkutan ATDPCs. Värden var normaliserade till glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas uttryck och visas som ± SEM av sex oberoende experiment. P < 0,05 (betydelse). (B - M) Proteinuttryck i hjärt- och subkutan ATDPCs på en vertikal-mönstrad yta uttryck av huvudsakliga kardiella markörer för kontroll och stimuleras cellerna. Phalloidin färgning (actinF; röd) och Cx43 uttryck (grön), SERCA2 (röd), MEF2 (grön), sarcomeric α-actinin (röd) och GATA-4 (grön) uttryck i kontrollen (i paneler B, D, F, H, Joch L ) och stimuleras (i paneler C, E, G, I, Koch M) hjärt (vänster) och subkutan (höger) ATDPCs. Atomkärnor var counterstained med DAPI (blå; paneler B - E, Loch M). Skala barer = 50 µm. Denna siffra har ändrats från Llucià-Valldeperas et al.30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektromekaniska stimulering verkar vara ett säkert alternativ för att förbereda celler för en fientlig hjärt miljö och förbättra deras kardiella engagemang. Här, rapporterade ett protokoll som beskrivs för hjärt stamceller ökat uttryck av huvudsakliga kardiella markörer och för att vara till nytta för deras nästa implantation på infarcted murina myokardiet30. Generellt ökade elektromekaniskt stimuleras hjärt ATDPCs uttrycket av gener besläktade med tidigt, strukturella och kalcium-förordningen, som aldrig har uppnåtts med föregående elektriska eller mekaniska stimuli individuellt. I själva verket elektromekaniskt stimuleras hjärt ATDPCs Visa en mer komplett profil och verkade vara mer engagerad till hjärt släktlinje än tidigare rapporterat.
Hjärt genuttryck var moduleras i båda celltyper elektromekaniska stimulation, särskilt efter den anmärkningsvärda förstärkning av hjärt ATDPCs jämfört med subkutan ATDPCs. Detta resultat kan ha varit en följd av fettvävnaden används för cell isolering, nämligen epikardiell eller subkutant fett, respektive ursprung. Epikardiell fettvävnad kring både hjärta och hjärtsäck är ett metaboliskt aktiva orgel och en källa av stamceller. Av intresse har epikardiell fettet anatomiska och funktionella kontinuitet med hjärtmuskeln. Under normala omständigheter har epikardiell fettet biokemiska och termogena hjärtskyddande egenskaper; under sjukdomstillstånd, kan det däremot utsöndrar proinflammatoriska cytokiner påverkar hjärtat39. I själva verket hjärt ATDPCs har en inneboende hjärt-lik fenotyp och uppvisar ett konstitutivt uttryck av kardiella markörer, såsom Cx43, sarcomeric α-actinin, SERCA2 och GATA-4, jämfört med subkutan ATDPCs, vilket inte är så anpassad till hjärtat miljö34. Effekter som härrör från elektromekaniska stimulering kan således vara större för hjärt progenitorceller, vars nisch är nära eller inom den hjärtinfarkt miljön.
Från den sista observationen i vilken gen modulering starkt beroende cell befolkningen, ett protokoll optimering för varje cell befolkningen är tillrådligt och ungefärliga värden kan extraheras från de som beskrivs i detta protokoll. De viktigaste stegen i cell elektromekaniska stimulering är cell fastsättning och stimulering regimer (intensitet, varaktighet, frekvens).
Till exempel är elektriska parametrarna avgörande. Elektriska fältet intensiteten tillämpas var verkligen optimalt för en nonelectric cell, så ökade värden skulle vara lämpligare för celler med elektrisk aktivitet, exempelvis omogna pluripotenta stamceller-cell-derived hjärtmuskelcellerna40,41 . Preliminära experiment för hjärt ATDPC elektrostimulering visat att en likström och en hög spänning induceras cell tillväxt gripandet och cell död10. Från dessa resultat antogs Alternerande-ström och låg-spänning protokoll för ytterligare experiment.
Dessutom presentera några cell härstamningar en låg anknytning till PDMS ytan, så en beläggning eller plasmabehandling föreslås för att berika den sådd effektivitet42. Dessutom bör cell sådd anpassas till varje Cellstorlek och tillväxt, minska värdena för mycket proliferativ cellerna eller öka dem för mindre celler; Således rekommenderas några prövningar sådd flera tätheter på den PDMS bygga. Slutligen, protokollet utfördes på en cell enskiktslager och värden kan vara något annorlunda för en tredimensionell scenario (dvs cell densiteten).
Dessutom spelar ytmönster en nyckelroll i mekaniska cell utbildning. Det visades att cellerna justerad enligt mönstret, och deras prestanda efter mekanisk stimulering inte var samma bland olika ytor. Exempelvis mekaniskt stimuleras hjärt ATDPCs seedade på vertikal-mönstrade ytor (vinkelrät mot den stretching kraften) utsöndras proteiner associerade med hjärtinfarkt och extracellulär matrix remodeling motiv. Mechanostimulated hjärt ATDPCs seedade på nonpatterned ytor utsöndrade proteiner associerade med hjärtats förnyelse21.
Huvuddragen i denna metod har beskrivits ovan. Det är dock viktigt att belysa metoden noninvasiv cellens stretching som en av de unika metoderna för att uppnå dessa funktioner. Av intresse, eftersom samma enhet kan skicka elektriska eller mekaniska stimuli, är en direkt jämförelse av de resulterande effekterna från olika stimuli och celler möjligt. Visualisering av cellerna seedade på konstruktionen, för öppenhet och tunnhet, är dessutom en klar fördel att utvärdera cell status före, under och efter stimulering.
Enheten och protokollet har vissa begränsningar, vissa av dem redan noterat. Först var det utformade och optimerade för en enskiktslager cellkultur och inte för en tredimensionell cellkultur. Specifikt, kan endast vidhäftande celler användas i inställningen enskiktslager. För nonadherent celler, bör en tredimensionell strategi genomföras. För det andra, bygga storlek begränsar sådd ytan; således antalet stimulerade celler är liten, och varje experimentell uppsättning kräver flera replikat att samla tillräckligt många prover för ytterligare genen eller protein analyser. En uppskalning är obligatoriskt för stora djurförsök eller kliniska översättning, där det krävs högre cell doser; i sådana fall kan större stimulering ytor övervägas.
De huvudsakliga tillämpningarna av detta protokoll inkluderar cell luftkonditionering, sjukdom modellering och drogkontroll. Denna stimulering förbättrar cell mognad och dess tillämpning skulle vara användbart för att uppnå och bibehålla en mer mogen fenotyp. Å ena sidan är celler som efterliknar den funktionella fenotypen närvarande i vuxen myokardiet avgörande för sjukdom modellering och organ-på-ett-chip experiment. Faktiskt kan inte mänskliga biopsier representera progression av sjukdomen eftersom de vanligtvis är slutstadiet eller postmortala prover, medan djurmodeller inte alltid sammanfatta människans fysiologi och symtomatologi. Dock användningen av mänskliga-inducerade pluripotenta stamceller har vuxit fram som en alternativ modellering metod för att nysta upp den mekanism underliggande patologi utveckling43. Organ-på-ett-chip är dessutom miniatyr vävnader och organ vuxit in vitro-som tillåter modellering av mänskliga (patolo) fysiologi och härma den tredimensionella strukturen. Deras mål är att etablera ett minimalt funktionell enhet som kan sammanfatta vissa aspekter av människans fysiologi och sjukdom på ett kontrollerat och okomplicerat sätt och ta itu med begränsningarna i befintliga cell- och djurmodeller44.
Drogkontroll kräver däremot, kultur plattformar som efterliknar de biofysiska miljön närvarande jagn vivo i en hög genomströmning, miniatyriserade system för provning av säkerhet och effekt av läkemedel via hjärtmuskelcellen svar. Mogna celler kan användas för att sammanfatta en kliniskt relevant avläsning (jag. e., kontraktila kinetik) i en hög genomströmning-analys, att belysa sjukdomsmekanismer och identifiera nya terapeutiska mål45.
Fältet hjärt var den huvudsakliga omfattningen av detta protokoll, men det kan enkelt anpassas till neuronala eller skelett domäner eftersom dessa miljöer kännetecknas av elektriska och mekaniska stimuli. Tidigare studier med fysisk stimuli har visat gynnsamma resultat46,47,48,49,50.
Sammanfattningsvis, har ett nytt protokoll för synkron elektromekaniska villkora av hjärt ATDPCs beskrivits. Den resulterande protokoll och enheten har testats och godkänts för enskilda och synkroniserade stimuli. Synkron elektromekaniska konditionering av ATDPCs ökar deras potentiella cardiomyogenic och framstår som en lovande strategi för cellterapi, sjukdom modellering och drogkontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut, utom att stimulering enheten och protokoll patenterades tidigare (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1).
Acknowledgments
Författarna vill tacka medlemmarna i forskningsprogrammet ICREC (IGTP, Badalona) och Elektro och biomedicinsk Instrumentation grupp (UPC, Barcelona), särskilt Prof. J. Rosell-Ferrer. Dessutom bekräftar författarna STAMCELLER translationell medicin journal och AlphaMed tryck för att tillåta anpassning av tidigare publicerade siffror (Llucià-Valldeperas, et al. 30). utvecklingen av denna prototyp och utformningen av protokollet stöddes av Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), Europeiska kommissionen () 7: e ramprogrammet RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502), och Fundación para la Innovación y la Prospectiva sv Salud sv España (FIPSE; 06-00001396-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2x | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
References
- McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
- Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
- Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
- Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
- Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
- Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
- Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
- Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93 (2014).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
- Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
- Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
- Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
- Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499 (2018).
- Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
- Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
- Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
- Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
- Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
- Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
- Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
- Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895 (2018).
- Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
- Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
- Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. Rosell Ferrer, F. X., Sánchez Terrones, B., Bragós Bardia, R., Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A. , Barcelano, Spain. WO/2013/185818 (2013).
- Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A., Soler Botija, C., Bragós Bardia, R., Rosell Ferrer, F. X. , Barceleno, Spain. WO/2017/125159 (2017).
- Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
- Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
- Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
- Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
- Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
- Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
- Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
