Summary
Her præsenterer vi en protokol for at uddanne en celle population ved hjælp af elektriske og mekaniske stimuli efterligne hjerte fysiologi. Denne elektromekaniske stimulation forbedrer cardiomyogenic potentialet i de behandlede celler og er en lovende strategi for yderligere celleterapi, sygdom modellering og stof screening.
Abstract
Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste årsag til dødsfald i de udviklede lande. Derfor har efterspørgslen efter effektive hjerte celle terapier motiveret forskere i stamceller og bioteknologi felter at udvikle in vitro- high-fidelity menneskelige myokardiet for både grundforskning og klinisk anvendelse. Umodne Fænotypen af cardiac celler er dog en begrænsning på opnåelse af væv, der funktionelt efterligner den voksne myokardiet, som er hovedsagelig karakteriseret ved mekaniske og elektriske signaler. Formålet med denne protokol er således, at forberede og modne celle målgruppen gennem elektromekaniske stimulation, recapitulating fysiologiske parametre. Hjerte vævsmanipulering er udvikling mod flere biologiske metoder og strategier baseret på biofysiske stimuli, således vinder momentum. Enheden er udviklet til dette formål er enestående og giver mulighed for individuelle eller samtidige elektriske og mekaniske stimulation, nøje karakteriseret og valideret. Desuden, selv om metoden, der er blevet optimeret for denne stimulator og en bestemt celle population, kan det nemt tilpasses til andre enheder og cellelinjer. Resultaterne her tilbyde bevis på den øgede hjerte engagement af cellen befolkningen efter elektromekaniske stimulation. Elektromekaniske stimuleret celler Vis øget udtryk for vigtigste hjerte markører, herunder tidlige, strukturelle og calcium-regulerende gener. Denne celle konditionering kan være nyttigt for yderligere regenerativ celleterapi, sygdom modellering og høj overførselshastighed stof screening.
Introduction
Hjertefunktion er baseret på koblingen af elektrisk excitation og mekaniske kontraktion. Kort, cardiomyocyte intercellulære vejkryds tillade elektrisk signal propagation at producere næsten synkron sammentrækninger af hjertet at pumpe blodet systemisk og via lungesystemet. Hjerte celler, gennemgår således både elektriske og mekaniske kræfter, der regulerer gen expression og cellulære funktion. Derfor, mange grupper har forsøgt at udvikle kultur-platforme, der efterligner den kardiale fysiologiske miljø for at forstå rollen, som mekanisk og elektrisk stimulering på hjerte udvikling, funktion og modning. In vitro elektriske og mekaniske stimulering har individuelt anvendt flittigt i hjertets vævsmanipulering at forbedre funktionelle egenskaber, øge celle modning eller forbedre celle-celle kobling og calcium håndtering1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. dog synkron elektromekaniske conditioning er fortsat uudnyttet udfordring for at udvikle en stimulator og protokol, og den obligatoriske optimering22.
Indledende arbejde rettet elektromekaniske stimulation som en kombination af elektrisk stimulation og medier perfusion; strømmen omfatter dog ikke den typiske ventrikulære fyldning23,24,25stamme-baseret deformation. Senere, kombineret flere fysiologiske tilgange elektriske stimuli med fysiske deformation eller strækning til at efterligne isovolumetric sammentrækning26,27,28,29,30 ,31. Feng et al. beskrev den første demonstration af elektromekaniske stimulation i 2005, rapportering af udvidet cardiomyocyte størrelse og kontraktile egenskaber26. Wang et al. forbehandlet mesenkymale stamceller med 5-azacytidine og anvendt samtidige elektriske og mekaniske conditioning, forbedre recellularization, cellernes levedygtighed, cardiac differentiering og væv remodellering27. Siden disse publikationer, flere grupper har rapporteret om elektromekaniske stimulation af celle encellelag eller manipuleret væv (f.eks, sort28, Vunjak-Novakovic29,31, og vores gruppe30) med den første konditioneret celler testet in vivo30. Kort, Morgan og sort testet flere kombinationer af elektriske og mekaniske stimuli, rapportering, timingen mellem stimulering var afgørende, fordi forsinkede kombineret elektromekaniske stimulation givet de bedste resultater28. Næste, Godier-Furnémont og samarbejdspartnere optimeret en elektromekanisk stimulation protokol for manipuleret hjerte muskel konstruktioner fra neonatal rotte hjertet celler og opnåede for første gang, en positiv kraft-frekvens forholdet29. Bagefter, rapporterede vores gruppe at elektromekaniske forprogrammerede celler forøget udtryk af vigtigste hjerte markører i vitro og bredt gavnlige effekter in vivo, såsom forbedret hjertefunktion eller øget fartøj tæthed i infarkt grænse område30. Den seneste publikation demonstreret at hjerte væv fra stilk-celle-afledte cardiomyocytes udsat for elektromekaniske conditioning nået en modning niveau tættere på menneskelige voksen hjertets struktur og funktion31. Derudover alternative tredimensionale stimulation platforme omfatter electroactive stilladser, der giver elektriske, mekaniske, og topografiske stikord til cellerne knyttet32. Desuden kan mekanisk deformation (celle éncellelag stretching og komprimering) også være fremkaldt med elastisk elektroder efterligne normale fysiologiske tilstande, samt ekstreme forhold33.
Rationalet er derfor, at in vitro-elektromekanisk stimuli baseret på fysiologiske forhold kunne øge cardiomyogenic potentiale i en celle. Ja, denne stimulation kunne gavne yderligere integrationer af terapeutiske celler i myokardiet i en klinisk scenario eller øge væv modning for narkotika-screening applikationer.
Derudover vi isoleret og karakteriseret en befolkning på menneskers fedtvæv-afledte stamceller af hjertestop oprindelse (hjertets ATDPCs)34. Disse celler er placeret i den epikardielle fedt. Disse celler vise gavnlige histopatologiske og funktionelle virkninger i behandlingen af myokardieinfarkt og også opretholde hjerte og endotel differentiering potentielle. 30 , 35. vi den hypotese, at disse fordele vil stige efter biofysiske stimulation.
Derfor, vi udviklet en enhed og en stimulation ordning for befolkningens celle af interesse og undersøgte virkningerne. Denne elektromekaniske protokol er en ny strategi for at fremkalde aktiv celle strækker sig i en steril måde og i forhold noninvasively til tidligere publikationer36, i kombination med elektrisk stimulation. Teknikken rapporteret her forklarer i detaljer enheden og metode, der anvendes til elektriske, mekaniske og elektromekaniske stimulering af celler.
Denne enhed kan give både elektrisk og mekanisk stimulation, uafhængigt eller samtidigt. Stimulering er udført med en noninvasive og aseptisk roman tilgang, der omfatter presterilized celle støtte, elektroder placeret inde i en standard kultur plade, og en platform, der inducerer de mekaniske og elektriske kræfter (figur 1).
Platformen kan rumme op til seks kultur plader og består af en sandwich struktur af laser-cut poly(methyl methacrylate) og printplade stykker. Platform prototype bygger på en kombination af en monofasiske programmerbare computer-kontrollerede elektriske stimulator, en printplade til robust tilslutning af elektroder og seks 10 mm x 10 mm x 5 mm forniklet neodym-faste magneter placeret i nærheden af én side af kultur plader. Der er også en aluminium bar med seks drivende magneter (samme model) placeret foran anden siden af kultur plader og flyttede med en lineær servomotor. Motoren drives af en motor controller, drives via en RS-232 port af kommerciel software (Se Tabel af materialer). Gennem brugergrænseflade og programmerbare stimulator er det muligt at programmere den elektriske intensitet, pulse varighed og hyppighed, hyppigheden af mekaniske stimulation, dets normeret maksimalydelse, antallet af impulser, pulse amplitude (magnet udflugt), og hældningen.
Figur 1 : Elektromekaniske stimulator. (A) PDMS konstruere bruges til celle conditioning. (B) tegning af PDMS konstruktion, herunder elektroder og magneter. (C) detaljer af den trykte kredsløb (platform) bruges til at udføre de elektromekaniske conditioning. Dette panel er blevet ændret fra Llucià-Valldeperas et al.30. (D) billede af elektromekaniske stimulation platform og brugergrænsefladen (computer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Både stimulatoren og metoden for elektromekaniske conditioning er fuldt ud beskrevet i to internationale patenter, WO-2013185818-A137 og WO-2017125159-A138.
Biokompatibelt silikone konstruktioner designet til at yde strukturel støtte til celler, elektroder og magneter har været beskrevet tidligere10,21. Kort, de består af Polydimethylsiloxan (PDMS), støbte og helbredt ved stuetemperatur, med en ung modulus af 1,3 MPa, tæt på fysiologiske niveauer. Konstruktionen indeholder en celle kultur pool i en fleksibel område (10 mm x 10 mm x 2 mm), to indre tværgående slots til at holde elektroderne, og to indlejret 6 mm x 2 mm x 4 mm forniklet neodymmagneter. Elektroderne er bygget med 0,2 mm platinum wire snoet omkring en 2 mm x 3 mm x 12 mm polytetrafluorethylen (PTFE) core bar (21 cm pr. elektrode, ca 23 omgange) og placeret på modsatte sider af den fleksible område til at oprette et elektrisk felt for at fremkalde elektrisk stimulation. Mekanisk stretching er opnået gennem magnetisk tiltrækning mellem magneter indlejret i støtte og eksterne magneter placeret ved siden af kultur-pladen og på den bevægelige aluminium arm. På denne måde, kan den celle støtte forlænges uden at bryde den sterile barriere. Denne fremgangsmåde er egnet til en celle éncellelag men kunne tilpasses til tre-dimensionelle konstruktioner, så godt.
Derudover kunne et regelmæssigt mønster være påtrykt, hvor cellerne udsås, ved hjælp af en styret diffraktion rist (1,250 riller/mm). Den direkte visualisering af celler dyrkes på PDMS konstruere under brightfield og fluorescerende mikroskoper er muligt på grund af dens gennemsigtighed og 0,5 mm tykkelse. I den aktuelle sag har PDMS kultur swimmingpool en lodret overflade mønster, vinkelret på den stretching kraft, justere celler vinkelret til det elektriske felt, hvilket minimerer det elektriske felt forløb på tværs af cellen.
Figur 1 viser en detaljeret beskrivelse af konstruktion og enhed, der bruges til at stimulere. PDMS konstruere og karakteristika er optimeret til celle strækker sig (figur 1A, B). Stimulatoren er udviklet og valideret for en effektiv anvendelse af de ønskede elektriske og mekaniske stimulation til celler knyttet til PDMS konstruktion. Denne proces omfatter at sikre gode tilslutningsmuligheder og bruger operabilitet via software interface (figur 1 c, D).
Proceduren for celle stimulation ved hjælp af denne skræddersyede enhed er beskrevet i afsnittet protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse bruger menneskelige hjerte ATDPCs fra patientprøver. Deres anvendelse er godkendt af den lokale etiske komité, og alle patienter gav informeret samtykke. Undersøgelse-protokollen i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.
1. præparater
- Autoklave to pincet, 12 platin PTFE elektroder til elektrisk stimulation og nogle papirhåndklæder, ved 121 ° C i 20 min.
-
Sterilisere 12 PDMS custom-made konstruktioner (fig. 1A).
- Vask hver konstruktion med 5 mL sterilt, destilleret vand med magnetisk agitation ved stuetemperatur i 15 min.
- Vask 1 x med 5 mL af 70% ethanol med magnetisk agitation ved stuetemperatur i 5 min.
- Vask 5 x med 5 mL sterilt, destilleret vand med magnetisk agitation ved stuetemperatur i 10 min pr. vask, fjerne alkoholholdige restkoncentrationer.
- Tørre konstruktioner på sterile papirservietter inde flow kabinet natten.
- Gemme dem i sterile 50 mL centrifugeglas indtil brug.
2. celle såning (dag -1)
- Før celle såning, overføre de rensede PDMS konstruktioner til sterile plader og udsætte dem for ultraviolet lys, i 5 min at sikre fuldstændig sterilisation.
- Overfør hver konstruktion til en 35 mm celle kultur plade, eller 6-godt plade, til øjeblikkelig celle såning.
-
Trypsinize en sammenflydende T75 kolbe af hjertets ATDPCs.
- Vask T75 kolben med 5 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Der tilsættes 1 mL 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 5 min at løsrive cellerne.
- Der tilsættes 5 mL af komplet medium til at inaktivere trypsin-EDTA.
- Indsamle alle celler i en 15 mL rør og vask kolben 2 x med 5 mL PBS til at indsamle de resterende celler.
- Der centrifugeres ved 230 x g i 5 min ved 22 ° C og Fjern supernatanten resuspend celler i 2 mL af komplet medium at tælle dem med hemocytometer afdeling.
- Seed 200 µL af hjertets ATDPCs (2,5 x 105 celler/mL) i celle pulje af de 12 PDMS konstruktioner(figur 1A, B) at have ~ 80% af seeding overflade er dækket af celler dagen efter, og der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: Efter 2-4 h, bør der lægges cellerne. Celle inokulum er tilberedt efter Cellestørrelse og vækst. For mindre celler, bør seeding tætheden øges. - Forsigtigt tilføje forvarmet komplet medium (α-MEM suppleret med 10% føtal bovin serum, 1% L-glutamin, og 1% penicillin-streptomycin) sættes 2 mL pr. plade.
- Inkuber konstruktioner på kultur betingelser (normalt 37 ° C og 5% CO2) natten over.
3. elektromekaniske Stimulation Setup (dag 0)
- Før du begynder proceduren, tage seks konstruktioner for elektromekaniske stimulation og seks som nonstimulated kontrol. Med færre end seks plader pr. stimulation, skal du bruge tomme konstruktioner med den samme medium volumen for at sikre ordentlig elektrisk felt stimulation.
- Ren enheden med 70% ethanol og placere den i flow kabinet.
- Bringe de sterile elektroder og pincet inde i flow kabinettet.
- Fjerne 90% af medierne fra kultur pladen kan nemt manipulere elektroder og konstruktioner. Førstepladsen PDMS konstruktioner i den rigtige position for magnetisk tiltrækning (PDMS forskydning inden for kultur plade mod magneten) mellem både fastnet- og magneter. Dernæst tilslut platin wire elektrode stik og PTFE del i dets udpegede plads i PDMS konstruktion.
- Tilføje 2,5 mL frisk forvarmet komplet medium til hver konstruktion.
Bemærk: Bevare steriliteten under hele proceduren og opererer på en konstruktion på et tidspunkt. Vedligeholde resten af konstruktioner i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 indtil brug. - Når alle PDMS konstruktioner placeret og elektrisk tilsluttet platformen, bringe platformen tilbage i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2.
- Tilslut den elektriske og mekaniske kilde.
-
Konfigurere programmet stimulation. Angive elektriske og mekaniske stimulation regimer gennem brugergrænseflader for den elektriske stimulator og programmet, som kontrollerer den mekaniske stimulation. Angiv synchronism som følger.
- Tænd den elektriske stimulator. Vente på hovedmenuen skal vises i displayet.
- Vælg derefter indstilling 2: Rediger sekvens + Enter.
- Rediger sekvens Menu som følger.
- Brug fanen Mode til at vælge enten spænding eller strøm. Vælg nuværende ved at klikke på + og tryk på Enter.
- Fanen Amplitude Vælg 1 (mA) med +/- og trykke på Enter.
- Periode (T), Vælg 1000 (ms) med +/- og trykke på Enter.
- Impulslængde (Tw) til 2 (ms) med +/- , og tryk på Enter.
- For fanen udløse mode Vælg eksterne software , og tryk på Enter.
- Tilbage i hovedmenuen, Vælg mulighed 4: generere sekvens og tryk på Enter.
Bemærk: Den elektriske stimulator hviler i standbytilstand, indtil det modtager en trigger kommando fra mekanisk stimulator ansøgning via den serielle port.
- Udfør følgende trin i afsnittet mekaniske stimulation af ansøgningen Kontrolpanel (figur 2C).
- Skrive 1.000 (ms) i tekstkontrolelementet Puls periode .
- Skrive 500 (ms) i kontrolelementet ON time (Tw) tekst til at angive den mekaniske impulslængde.
- Skrive 2.000 (AU) i tekstkontrolelementet udflugt til at levere en 10% konstruere brudforlængelse. Dette er antallet af trin i den lineære kontrol motor.
Bemærk: Stimulation protokollen anvendes her består af skiftende-aktuelle 2 ms monofasiske square-bølge pulser af 50 mV/cm på 1 Hz og 10% strækker sig over 7 dage. Stigning og fald gange af den mekaniske puls er sat til 100 ms, at groft efterligne form af skorstenen pres puls. Også, den gentagelse indstillet til fortløbende og der er tælleren viser antallet af impulser.
- Tænd den elektriske stimulator. Vente på hovedmenuen skal vises i displayet.
- Ændre media 2 x om ugen (mandag og torsdag eftermiddag). Første, Fjern de gamle medier; Næste, Tilføj den varme medier på siderne af PDMS støtte aldrig direkte på celle pool.
Bemærk: Hvis cellerne har en høj vækstrate, bør medierne ændrede 3 x om ugen (fx, mandag, onsdag og fredag). Det er nødvendigt at afbryde og reconnect alle kabler, men der er ingen grund til at fjerne kultur plader og elektroder fra deres sted. - Indsamle prøver efter eksperimenter er udført.
4. prøvetagning i slutningen af eksperimenter (dag 7)
-
RNA analyser
- Vaske konstruktionen 2 x med 3 mL 1 x PBS for 5 min ved stuetemperatur.
- Tilføj 3 mL 0,05% trypsin-EDTA til hver plade, (nok til at dække hele konstruktionen) og vente i 5 min ved 37 ° C.
- Når cellerne er frakoblet, tilsættes 2 mL af komplet medium til at inaktivere trypsin-EDTA.
- Indsamle alle celler i en 15 mL tube og vaske konstruere 2 x med 3 mL PBS til at indsamle de resterende celler.
- Der centrifugeres ved 230 x g i 5 min. ved 22 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspenderes i 1 mL PBS.
- Celle opløsning overføres til en 1,5 mL rør og centrifugeres ved 230 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og gemme pellet ved-80 ° C i 700 µL lysis reagens for yderligere RNA isolering.
- Isolere RNA ved hjælp af en kommerciel kit, efter fabrikantens anvisninger.
- Reverse-omskrive den isolerede RNA ved hjælp af kit og tilfældige hexamers, efter producentens protokol.
- For små RNA koncentrationer, preamplify, og derefter fortyndes 1:5 med RNase-fri vand før efterfølgende real-time reverse transkription polymerase kædereaktion (RT-PCR) er udført. Fortsæt med standard-protokol til real-time RT-PCR og kontrollere vigtigste hjerte markører.
Bemærk: Typisk hjerte markører omfatter tidlige og sene markører fra forskellige kategorier, såsom hjerte transkriptionsfaktorer (myocyte-specifikke enhancer faktor 2A [MEF2A], GATA-bindende protein 4 [GATA-4]) og strukturelle (cardiac troponin jeg [cTnI], hjerte troponin T [cTnT], α-actinin) og calcium forordning (Connexin43 [Cx43], sarco-/ endoplasmatiske reticulum Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. Protein isolering kan også udføres, hvis det er nødvendigt. Samtidige RNA og protein isolation kan udføres med den samme prøve, ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser og kits (Table of Materials), hvis prøven er mindre.
-
For immunostainings
Bemærk: Dette er udført direkte på de celler, der er knyttet til cellen pulje af PDMS konstruktion. Derfor anbefaler vi at placere, hver gang 1 cm x 1 cm af paraffin film på toppen celle pool, bortset fra pladen låg, for at minimere fordampning af inkubation løsninger.- Vaske konstruktionen 2 x med 3 mL PBS i 5 min ved stuetemperatur.
- Fastsætte de celler, der er fastgjort til konstruktionen med 2 mL 10% formalin i 15 min. ved stuetemperatur.
- Vaske cellerne 3 x med 3 mL PBS i 5 min ved stuetemperatur. Til langtidsopbevaring, forlade prøverne i PBS med 0,1% natriumazid ved 4 ° C.
- Permeabilize celler med 3 mL PBS + 0,5% vaskemiddel (3 x, hver gang 5-10 min, stuetemperatur).
- Inkuber celler med 100 µL af PBS + 10% hest serum + 0,2% vaskemiddel + 1% bovint serumalbumin ved stuetemperatur i 1 time, for at blokere uspecifik antistof bindende.
- Inkuber celler med 100 µL af PBS + 10% hest serum + 0,2% vaskemiddel + 1% bovint serumalbumin + primære antistof ved stuetemperatur i 1 time. For eksempel, primære antistoffer mod Cx43 (1: 100), sarcomeric α-actinin (1: 100), GATA-4 (1:50), MEF2 (1:25), og SERCA2 (1:50).
- Vask 3 x med 3 mL PBS ved stuetemperatur i 5 min.
- Inkuber celler med 100 µL af PBS + sekundær antistof ved stuetemperatur i mørke for 1 h.
Bemærk: Sekundære antistoffer konjugeret med forskellige fluorophores og en counterstaining agent blev brugt. - Vaske dem 3 x med 3 mL PBS ved stuetemperatur i mørke i 5 min.
- Inkuber celler med 100 µL af nukleare farvning (0,1 µg/mL) i PBS ved stuetemperatur i mørke i 15 min.
- Vaske dem 3 x med 3 mL PBS ved stuetemperatur i mørke i 5 min.
- Opbevare prøverne i 3 mL PBS med 0,1% natriumazid ved 4 ° C indtil overtagelsen.
Bemærk: Mikroskop erhvervelse er muligt på inverteret fluorescerende og konfokal mikroskoper med long-arbejde afstand mål, fordi konstruere tykkelse er ca 0.5 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 repræsenterer generelle skemaet følges for celle stimulation. Kort, celler var seedet på PDMS konstruktion og udsat for elektromekaniske stimulation, med medier ændringer udført to gange om ugen. Nonstimulated celler blev brugt som kontrol for elektromekaniske konditionering. Derudover har vi tilføjet et ekstra kontrolelement til eksperimentet, og subkutane ATDPCs blev brugt som kontrol for hjerte ATDPCs. Subkutane ATDPCs er fremstillet af subkutane fedtvæv, efter de samme isolation og kultur procedurer for hjerte ATDPCs33. Cellerne er knyttet til PDMS konstruere fremgår en typisk fusiform fænotype før og efter stimulation. Derudover cellerne justeres efter mønstrede overfladen, i dette tilfælde efter den lodret mønster.
Elektrisk og mekanisk stimulering blev først optimeret individuelt. Først, elektrostimulation var baseret på en tidligere undersøgelse i hvilken skiftende-aktuelle 2 ms monofasiske square-bølge pulser af 50 mV/cm ved 1 Hz blev fundet for at være bedst for hjerte ATDPCs10. Vi rapporterede, at elektrisk stimulation øget udtryk for tidlige hjerte markører i hjertets ATDPCs, såsom MEF2A (P = 0,050) og GATA-4 (P = 0.031), men ingen virkninger på strukturelle og calcium-håndtering gener blev observeret (data ikke vist) .
Andet, mechanostimulation-protokollen bestod af 10% stretching og en 1 Hz trapezformet bølgeform med en 50% duty cycle med 100 ms anledning og faldetiderne at efterligne presset cyklus i hjertet, som beskrevet i fuld før21. Mekanisk stimuleret hjerte ATDPCs augmented udtryk for strukturelle gener, såsom α-actinin (P = 0,001) eller cTnI (P = 0.044), og viste en stigende tendens til tidlig hjerte markører, GATA-4 (P = 0.068) og T-box transskription faktor 5 (Tbx5; P = 0,065) (data ikke vist). Effekter afledt af mekaniske stimulation var stærkt afhængige af mønstret overflade.
Bagefter, blev begge protokoller kombineret til en effektiv elektromekaniske stimulering af hjertets ATDPCs, der ligner ventrikel-fyldning af blod. Den resulterende protokol omfattede skiftende-aktuelle 2 ms monofasiske square-bølge pulser af 50 mV/cm på 1 Hz og 10% strækker sig over 7 dage30. Samlet set forbedret elektromekaniske stimuleret hjerte ATDPCs deres potentielle cardiomyogenic. Stimuleret hjerte ATDPCs øget udtryk for tidlige og sene hjerte gener (fig. 3A), nemlig den kardiale transskription faktor GATA-4 (P = 0,050), strukturelle markør β-myosin heavy chain (β-MHC; P = 0.000), og calcium-relaterede gen Cx43 (P = 0,025). Gen modulationer som følge af de elektromekaniske stimulation blev også oversat på protein-niveau (figur 3B-M). Phalloidin farvning mod actin fibre viste, at hovedparten af cellerne justeres efter den lodret mønster og at Cx43 fordelingen var for det meste i cytoplasmaet og på plasma-membran til at bidrage til intercellulær kommunikation gennem hullet knudepunkter (fig. 3B-E). MEF2 og GATA-4 transkriptionsfaktorer var placeret på kerner i hjertets ATDPCs; dog blev GATA-4 ikke fundet i subkutane ATDPCs (figur 3F-M). Cytoplasmatisk markører SERCA2 og sarcomeric α-actinin viste ikke et modent sarkomeret organisation typisk for cardiomyocytes, og slå blev ikke observeret i kontrol og stimuleret cellepopulationer (figur 3F-M).
Figur 2 : Procedure, enhed og bruger grænseflade, elektromekaniske stimulation. (A) elektromekaniske stimulation skema med repræsentative billeder af nonstimulated celler på dag 0 og stimuleret celler på dag 7, både på konstruktioner med lodret overflade mønster. Skalere barer = 100 µm. (B) elektromekaniske stimulation enhed: seedede PDMS konstruktion, elektroder og faste/mobile magneter. (C) ansøgning Kontrolpanel for den mekaniske stimulation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Gen og protein udtryk for de vigtigste hjerte markører efter elektromekaniske stimulering af hjerte og subkutane ATDPCs. (A) Real-time PCR vigtigste hjerte gener i hjerte og subkutane ATDPCs. Den relative udtryk af cardiomyogenic markører i stimuleret versus nonconditioned kontrolelementer er vist for hjerte og subkutane ATDPCs. Værdier var normaliseret til glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase udtryk og er vist som betyder ± SEM til seks uafhængige forsøg. P < 0,05 (betydning). (B - M) Protein udtryk i hjerte og subkutane ATDPCs på en lodret-mønstret overflade udtryk for vigtigste hjerte markører for kontrol og stimuleret celler. Phalloidin farvning (actinF, red) og Cx43 udtryk (grøn), SERCA2 (rød), MEF2 (grøn), sarcomeric α-actinin (rød), og GATA-4 (grøn) udtryk i kontrol (i paneler B, D, F, H, Jog L ) og stimuleret (i paneler C, E, G, I, Kog M) hjerte (venstre) og subkutane (højre) ATDPCs. Kerner blev counterstained med DAPI (blå, bedømmelseskomite B - E, Log M). Skala barer = 50 µm. Dette tal er blevet ændret fra Llucià-Valldeperas et al.30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektromekaniske stimulation synes at være et sikkert alternativ til at forberede celler for en fjendtlig hjerte miljø og forbedre deres hjerte engagement. Her, rapporteret en protokol, der er beskrevet for kardiale stamceller øget udtryk for vigtigste hjerte markører og blev for at være gavnlig for deres næste implantation infarcted murine myokardiet30. I almindelighed, forøget elektromekaniske stimuleret hjerte ATDPCs udtryk af gener relateret til tidligt, strukturelle og calcium forordning, hvilket aldrig er sket med tidligere elektriske eller mekaniske stimulering individuelt. I virkeligheden, elektromekaniske stimuleret hjerte ATDPCs viser en mere komplet profil og syntes at være mere engagerede i hjertets slægt end tidligere rapporteret.
Hjerte genekspression var moduleret i begge celletyper efter elektromekaniske stimulation, især efter den bemærkelsesværdige augmentation af hjertets ATDPCs i forhold til subkutane ATDPCs. Dette resultat kan have været en konsekvens af oprindelsen af fedtvæv bruges til celle isolation, nemlig epikardielle eller subkutan fedt, henholdsvis. Epikardielle fedtvæv omkring både hjerte og hjertesækken er en metabolisk aktive organ og en kilde til stamceller. Af interesse har den epikardielle fedt anatomisk og funktionel kontinuitet med myokardiet. Under normale omstændigheder har den epikardielle fedt biokemiske og termogeniske cardioprotective egenskaber; omvendt kan det patologiske betingelser udskiller proinflammatoriske cytokiner for at påvirke hjertet39. Faktisk, hjerte ATDPCs har en iboende hjerte-lignende fænotype og udstille en konstitutiv udtryk for hjertets markører, såsom Cx43, sarcomeric α-actinin, SERCA2 og GATA-4, i forhold til subkutane ATDPCs, der ikke er så tilpasses hjerte miljø34. Effekter afledt af elektromekaniske stimulation kan således større hjerte stamceller, hvis niche er tæt på eller inden for den Myokardie milieu.
Fra den sidste bemærkning i hvilke gen graduering kraftigt afhænger befolkningens celle, en protokol optimering for hver celle befolkning er tilrådeligt og omtrentlige værdier kan udvindes fra de i denne protokol beskrevne. De mest kritiske trin i celle elektromekaniske stimulation er celle vedhæftet fil og stimulation regimer (intensitet, varighed, frekvens).
For eksempel, er de elektriske parametre afgørende. Faktisk, det elektriske felt intensitet anvendes var optimal for en nonelectric celle, så øgede værdier ville være mere passende for celler med elektrisk aktivitet, som umodne pluripotente stamceller-celle-afledte cardiomyocytes40,41 . Foreløbige forsøg for hjerte ATDPC elektrostimulation viste, at en jævnstrøm og en høj spænding induceret celle vækst anholdelse og celle død10. Fra disse resultater, blev skiftende-aktuelle og lav spænding protokoller vedtaget for yderligere eksperimenter.
Derudover præsentere nogle celle lineages en lav tilknytning til PDMS overflade, så en belægning eller en plasma behandling er foreslået til at berige den seeding effektivitet42. Derudover bør celle såning tilpasses til hver Cellestørrelse og vækst, faldende værdier for de meget proliferativ celler eller øge dem for mindre celler; således anbefales et par retssager, såning flere tætheder på PDMS konstruktion. Endelig, protokollen blev udført på en celle éncellelag, og værdier kan være lidt anderledes for en tre-dimensionel scenario (dvs. den celle tæthed).
Desuden, den overflademønster spiller en nøglerolle i mekanisk celle uddannelse. Det var vist, at cellerne afstemt efter mønsteret, og deres ydeevne efter mekanisk stimulation ikke var den samme blandt forskellige overflader. For eksempel, mekanisk stimuleret hjerte ATDPCs seedet på lodret-mønstrede overflader (vinkelret på den stretching kraft) udskilles proteiner forbundet med myokardieinfarkt og ekstracellulære matrix remodeling motiver. Mechanostimulated hjerte ATDPCs seedet på nonpatterned overflader udskilles proteiner forbundet med hjerte regenerering21.
De vigtigste elementer i denne metode har været beskrevet ovenfor. Det er dog vigtigt at fremhæve den noninvasive tilgang af cellen strækker sig som en af de unikke metoder til at opnå disse funktioner. Af interesse, fordi den samme enhed kan sende elektriske og/eller mekaniske stimuli, er en direkte sammenligning mellem de resulterende virkninger fra forskellige stimulering og celler muligt. Derudover er visualiseringen af cellerne seedede på konstruktion, takket være gennemsigtighed og thinness, en klar fordel at evaluere celle status før, under og efter stimulation.
Enheden og protokollen har nogle begrænsninger, nogle af dem allerede bemærket. Først var det designet og optimeret til en éncellelag cellekultur og ikke for en tre-dimensionel cellekultur. Specifikt, kan kun vedhængende celler bruges i éncellelag omgivelser. Til nonadherent celler, bør der iværksættes en tredimensionel tilgang. Andet, konstruere størrelse begrænser seeding overfladen; således antallet af stimuleres cellerne er små, og hver eksperimentelle sæt kræver flere replikater at indsamle nok prøver for yderligere gen eller protein analyser. En skala-up er obligatorisk for store dyreforsøg eller kliniske oversættelse, hvor højere celle doser er påkrævet; i sådanne tilfælde, kan betragtes som større stimulering overflader.
De vigtigste anvendelser af denne protokol omfatter celle conditioning, sygdom modellering og stof screening. Denne stimulation øger celle modning, og dens anvendelse ville være nyttigt for at opnå og fastholde en mere moden fænotype. På den ene side er celler, der efterligner den funktionelle fænotype stede i voksen myokardiet afgørende for sygdom modellering og orgel-on-a-chip eksperimenter. Faktisk kan ikke menneskelige biopsier repræsenterer progression af sygdommen, fordi de er normalt slutstadiet eller post mortem-prøver, mens dyremodeller ikke altid sammenfatte menneskets fysiologi og symptomatologi. Ikke desto mindre er brug af human-induceret pluripotente stamceller opstået som en alternativ modellering metode til optrevling mekanisme underliggende patologi udvikling43. Derudover er organer-on-a-chip miniature væv og organer dyrkes in vitro-der tillader modellering af menneskelige (patho) fysiologi og efterligne de tre-dimensionelle strukturer. Deres mål er at etablere en minimalt funktionel enhed, der kan sammenfatte visse aspekter af menneskets fysiologi og sygdom i en kontrolleret og ligetil måde og håndtere begrænsningerne af eksisterende celle- og dyremodeller44.
På den anden side kræver stof screening kultur platforme, der efterligner den biofysiske miljø stede jegn vivo i en høj overførselshastighed, miniaturiserede system for afprøvning af sikkerheden og effekten af lægemidler via cardiomyocyte reaktion. Modne celler kunne bruges til at sammenfatte en klinisk relevante udlæsning (jeg. e., kontraktile kinetik) i en høj overførselshastighed, analyse, at belyse sygdomsmekanismer og identificere roman terapeutiske mål45.
Feltet hjerte var det vigtigste anvendelsesområdet for denne protokol, men det kunne let tilpasses til neuronal eller skelet domæner, fordi disse miljøer er kendetegnet ved elektriske og mekaniske stimuli. Tidligere studier med fysisk stimulering har angivet gavnlige resultater46,47,48,49,50.
Til sidst, er en ny protokol for den synkrone elektromekaniske konditionering af hjertets ATDPCs blevet beskrevet. Den resulterende protokol og enheden har grundigt testet og godkendt for individuelle og synkroniseret stimuli. Synkron elektromekaniske konditionering af ATDPCs øger deres potentielle cardiomyogenic og fremstår som en lovende strategi for Celleterapi, sygdom modellering og stof screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive, bortset fra at den stimulation enhed og protokol var tidligere patenteret (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1).
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af ICREC Research Program (IGTP, Badalona) og biomedicinsk Instrumentation gruppen (UPC, Barcelona), især Prof. J. Rosell-Ferrer og elektronisk. Derudover, anerkender forfatterne STAMCELLER translationel medicin journal og AlphaMed Tryk på for at tillade tilpasning af tidligere offentliggjorte tal (Llucià-Valldeperas, et al. 30). udvikling af denne prototype og design af protokollen blev støttet af Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), Europa-Kommissionens 7. rammeprogram ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502), og Fundación para la Innovación y la Prospectiva da Salud da España (FIPSE; 06-00001396-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2x | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
References
- McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
- Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
- Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
- Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
- Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
- Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
- Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
- Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93 (2014).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
- Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
- Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
- Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
- Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499 (2018).
- Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
- Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
- Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
- Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
- Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
- Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
- Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
- Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895 (2018).
- Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
- Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
- Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. Rosell Ferrer, F. X., Sánchez Terrones, B., Bragós Bardia, R., Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A. , Barcelano, Spain. WO/2013/185818 (2013).
- Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A., Soler Botija, C., Bragós Bardia, R., Rosell Ferrer, F. X. , Barceleno, Spain. WO/2017/125159 (2017).
- Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
- Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
- Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
- Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
- Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
- Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
- Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
