Summary
ここで心臓の生理学をエミュレートする電気的・機械的刺激を用いたセル人口をトレーニングするためのプロトコルを提案する.この電気刺激は扱われた細胞の cardiomyogenic の可能性を高めるもの、さらに細胞療法、疾患モデル作製、および創薬スクリーニングの有望な戦略です。
Abstract
心血管疾患は、先進国の主要な死因です。その結果、効果的な心臓の細胞療法のための要求は基礎研究と臨床応用のための in vitro忠実度の高いひと心筋を開発する幹細胞とバイオ エンジニア リング分野の研究者に動機を与えた。ただし、心筋細胞の未熟な表現型は機能的模倣は機械的および電気的信号によって主に特徴付けられる大人の心筋組織の取得に制限です。したがって、このプロトコルの目的を準備し、生理学的パラメーターをさた電気刺激による標的細胞のポピュレーションを成熟です。心臓ティッシュ エンジニア リングの進化のより多くの生物学的アプローチ、方向、したがって、生物の刺激に基づく戦略が勢いを増しています。この目的のために開発した装置は、ユニークで個別または同時電気的・機械的刺激、慎重に検証し、特徴をことができます。さらに、方法論はこの刺激と特定のセル人口のために最適化されているが簡単にこと他のデバイスおよび細胞ラインに適応です。ここでの結果は、電気刺激後の細胞集団の心臓のコミットメントの増加の証拠を提供しています。基づかせ刺激細胞は初期・構造・ カルシウム調節遺伝子を含むメインの心臓マーカーの発現の増加を表示します。この携帯エアコンはさらに再生細胞療法、疾患モデル作製、高スループットの薬剤のスクリーニングに役に立つかもしれません。
Introduction
心臓の機能は、電気刺激や機械的収縮の結合に基づいています。簡潔に、心筋細胞間の接合は、全身および肺システムを介して血液を送り出す心臓のほぼ同期の収縮を生成への電気信号の伝達を許可します。心筋細胞は、したがって、遺伝子発現と細胞機能を調節する電気と機械の両方の力を受けます。したがって、多くのグループが機械的・電気的刺激が心臓の開発、機能、および成熟の役割を理解する心の生理環境を模倣文化のプラットフォームを開発しようとしています。In vitro電気的・機械的刺激個別に適用されている広範囲機能特性を高める細胞の成熟を増やすか、細胞間結合とカルシウムの処理1を改善する心臓組織工学,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. それにもかかわらず、同期電気機械式エアコン残る未踏刺激およびプロトコルの開発の挑戦のため、必須の最適化22のため。
予備的な作業対応電気刺激電気刺激および灌流; の組み合わせとしてしかし、流れは心室充填23,24,25の典型的な歪みベースの変形を伴わない。多くの生理学的アプローチが物理的な変形と等容収縮26,27,28,29,30 を模倣するストレッチ電気刺激を併用後、 ,31。風水ら 2005、心筋収縮と26を強化されたレポートにおける電気刺激の最初のデモンストレーションを説明しました。王ら 5-アザシチジンと間葉系幹細胞を前処理し、同時の電気的・機械的エアコン、recellularization、細胞生存率、心筋分化と改造27組織改善を適用します。これらの出版物以来より多くのグループが細胞の電気刺激に関する報告または設計組織 (例えば、黒28、Vunjak ノバコビチ29,31, と私たちのグループの30)、最初の調節された細胞は、生体内で30をテストしました。簡単に言えば、モーガンと黒いくつかの組み合わせをテスト電気的・機械的刺激の刺激間のタイミングあった重要なため遅延結合された電気刺激が最高の結果28を得られたことを報告します。次に、Godier Furnémont との共同研究ラット新生児心筋細胞から人工心臓の筋肉構造のため電気刺激プロトコルを最適化し、肯定的な力周波数関係29を最初に達成。その後、私たちのグループ報告、電気機械的前処理細胞主な心臓マーカーの in vitro発現の増強、その広範な有益な生体内での効果など心機能を改善または、梗塞で血管密度を増加国境地域30。最も最近の出版物を示した心筋組織幹細胞由来心筋細胞からは受ける成熟レベル人間に近い成人心臓の構造と機能31に達した電気機械をご利用いただけます。また、代替三次元刺激プラットフォーム構成には、電気、機械、ゲルロボット足場、32がセルに地形のキューに接続されています。また、機械的変形 (細胞膜のストレッチと圧縮) は、極端な条件33と同様に、通常の生理学的条件を模倣した伸縮性電極を用いた誘導もことができます。
したがって、理論的根拠は生理学的条件に基づく in vitro における電気刺激が細胞の cardiomyogenic の可能性を高めることができます。確かに、この刺激がさらに臨床シナリオで心筋に治療用細胞の統合の恩恵を受けるか薬剤スクリーニング用組織の成熟を増やします。
また、孤立し、心のひと脂肪組織由来神経前駆細胞の人口を特徴と起源 (心臓 ATDPCs)34。これらの細胞は、心外膜脂肪にあります。これらの細胞は心筋梗塞の治療に有益な病理組織学的、機能的な効果を表示、また潜在的な心臓と血管内皮分化を維持します。30,35です。 これらの利点が生物物理刺激後増加を。
その結果、デバイスと興味のセル人口のための刺激体制を開発し、効果を検討した.このメカニカル プロトコルをアクティブ セルの滅菌方法でストレッチを誘発する新たな戦略して前出版物36, 電場刺激との組み合わせと比較して非侵襲的です。技術がここに報告は、装置と細胞の電気、機械、および電気刺激の使用方法の詳細について説明します。
このデバイスは、個別または同時に電気的・機械的刺激を提供することができます。刺激は、presterilized セル サポート、標準培養プレート、機械的および電気的力 (図 1) を誘導するプラットフォーム内部電極を含む非侵襲的かつ無菌の新たなアプローチで実行されます。
プラットフォームは、プレート、サンドイッチ構造レーザー カット poly(methyl methacrylate) ・ プリント基板部分成っている六つの文化まで保持できます。プラットフォーム プロトタイプは、単相性プログラム可能なコンピューター制御電気刺激装置、電極、および配置 6 10 mm x 10 mm x 5 mm ニッケル メッキ ネオジム固定磁石の堅牢な接続のため、プリント回路基板の組み合わせに依存しています。培養皿の片側に近い6 駆動磁石 (同じモデル) 前培養皿の反対側に置かれ、リニア サーボモータと移動とアルミのバーもあります。電動モーター コント ローラー、RS-232 ポートを通じて商業ソフトウェアが運営によって (材料の表を参照してください)。ユーザー インターフェイスとプログラミング可能な刺激、電気的強度、脈拍の持続期間、頻度、機械的刺激、そのデューティ サイクル、パルス振幅 (磁石遠足)、パルス数の周波数をプログラムすることが可能です。斜面。
図 1: 電気刺激装置。(A) PDMS 構造細胞調節のために使用されます。(B) 電極と磁石を含む PDMS コンストラクトの図面。(C) 電気機械の調節を行うためのプリント回路基板 (プラットフォーム) の詳細。このパネルは、Llucià Valldeperas から変更されているら30。(D) 電気刺激プラットフォームとユーザー インターフェイス (コンピューター) の画像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
刺激と電気エアコンのメソッドは、2 つの国際特許 WO 2013185818 A137ヲ 2017125159 A138で詳しく説明します。
構成要素のセル、電極、および磁石に構造サポートを提供するように設計されている生体適合性シリコーンは前述10,21。簡単に言えば、彼らはポリジメチルシロキサン (PDMS) 成形し、生理学的レベルに近い、1.3 MPa のヤングと常温で硬化ので構成されます。構築には柔軟な地区 (10 × 10 × 2 mm) 細胞培養プールが含まれて、電極を保持するために 2 つの内側横スロットと 2 つに 6 mm × 2 mm × 4 mm ニッケル メッキのネオジム磁石が埋め込まれています。電極は 0.2 mm プラチナ線 2 mm × 3 mm x 12 mm ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) に巻きつけて (電極、約 23 ターンごと 21 cm) バー コアし、誘導電界を作成する柔軟なエリアの反対側に配置で構築されて電気刺激。メカニカル ストレッチ サポートに埋め込まれた磁石と培養プレートの横にある、および移動のアルミ製アームに外部の磁石の磁力によって実現されます。このように、無菌バリアを壊すことがなく細胞サポートを拡張できます。このアプローチは、細胞膜に適していますが、三次元構造体に適応することができます。
さらに、規則的なパターンされない可能性があります、セルがシードされて印刷ルールド回折格子 (1,250 溝/mm) を使用します。その透明性と 0.5 mm 厚のため明視野と蛍光顕微鏡下で PDMS 構築する上で培養した細胞の直接可視化が可能です。PDMS 培養プールがある現在のケースでは、セル間の電場勾配を最小化する電界に垂直にセルを配置する、伸縮力に垂直な垂直面パターン。
図 1は、構成や刺激のために使用されるデバイスの詳細な説明を示します。PDMS を構築し、ストレッチ (図 1 a, B) のセルの特性が最適化されています。刺激は、PDMS の構成要素に接続されているセルに必要な電気的・機械的刺激の効果的なアプリケーションの検証します。このプロセスでは、ソフトウェアのインターフェイス (図 1、D) を通じて良い接続とユーザー操作性を確保する含まれています。
細胞刺激このカスタムメイドのデバイスを使用するための手順はプロトコル」に記載されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究は、患者サンプルから人間の心臓 ATDPCs を使用しています。使用は、倫理委員会によって承認されているし、すべての患者は、インフォームド コンセントを与えた。研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言の原則に準拠しています。
1. 準備
- オートクレーブ 2 ピンセット、電気刺激のための 12 のプラチナ PTFE 電極やいくつかの紙タオル、121 ° C、20 分で。
-
12 PDMS カスタムメイド構成 (図 1A) を消毒します。
- 15 分の室温で 5 mL の滅菌、蒸留水磁気攪拌の各構成体を洗います。
- 5 分間室温での磁気撹拌で 70% エタノール 5 mL で 1 x を洗ってください。
- アルコール残基を削除するために、洗浄あたり 10 分の室温で 5 mL の滅菌、蒸留水磁気攪拌と 5 x を洗ってください。
- 乾燥フロー キャビネット一晩中滅菌ペーパー タオルの上の構成要素。
- 使用するまで滅菌 50 mL 遠沈管に保存します。
2. 細胞播種 (日-1)
- 細胞播種前、に転送プレートに滅菌洗浄 PDMS 構造と完全な殺菌を確実に 5 分間紫外線にそれらを公開します。
- 35 mm 細胞培養プレート、または 6 ウェル プレート、即時細胞播種のために各構成要素を転送します。
-
心臓 ATDPCs の合流 T75 フラスコを trypsinize します。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 の 5 mL の T75 フラスコを洗います。
- 0.05% トリプシン-EDTA の 1 mL を追加し、セルをデタッチする 5 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- トリプシン-EDTA を不活化する完全培地 5 mL を追加します。
- 収集すべては 15 mL チューブの洗浄フラスコ細胞に残っているセルを収集する PBS の 5 mL の 2 倍。
- 22 ° C で 5 分間 230 × gで遠心、上清を除去、検定室でそれらをカウントする完全培地 2 mL に細胞を再懸濁します。
- 一日の後、細胞によって 12 の PDMS 構造 (図 1A, B) に覆われたシードの表面の約 80% の細胞のプールに心臓 ATDPCs (2.5 x 10 の5セル/mL) 200 μ L をシードし、37 ° C、5% CO2で孵化させなさい。
注:2-4 h 後セルを添付してください。セル接種は、セル サイズと成長に応じて用意しています。小さい細胞の播種密度を増やす必要があります。 - 優しくプレートあたり prewarmed 完全培地 (10% 胎仔ウシ血清, 1 %l-グルタミンおよび 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した α MEM) 2 mL を追加します。
- 一晩培養条件 (通常 37 ° C、5% CO2) で構造を孵化させなさい。
3. 電気機械刺激セットアップ (0 日)
- 手順を開始する前に、電気刺激の六つの構成要素と nonstimulated コントロールとして六つを取る。刺激のより少ない 6 枚と同じミディアム ボリュームに空の構造を使用する適切な電気刺激。
- 70% のエタノールの刺激を清掃、キャビネット フロー内に置きます。
- 滅菌電極と流れのキャビネット内のピンセットをもたらします。
- 電極と構成要素を簡単に操作する培養プレートからメディアの 90% を削除します。まず、固定とモバイルの両方の磁石の磁力 (PDMS 変位磁石に向かって培養プレート内) を確実に正しい位置に PDMS 構成要素を配置します。次に、電極コネクタと PDMS コンス トラクターに指定された空間に PTFE 部分に白金線を接続します。
- 新鮮な prewarmed 完全な媒体の 2.5 mL を各構成要素に追加します。
注:プロシージャ全体で無菌性を維持し、一度に 1 つ構築する上で動作します。使用するまで 37 ° C、5% CO2インキュベーター内の構成体の残りの部分を保持します。 - 一度すべての PDMS 構造体の配置し、電気的に接続された、プラットフォームに戻して 37 ° C、5% CO2インキュベーター。
- 電気的・機械的ソースに接続します。
-
刺激プログラムを構成します。電気刺激や機械的刺激を制御するアプリケーションのユーザー インターフェイスを通じて電気的および機械的刺激による体制を指定します。同期を設定します。
- 電気刺激装置に切り替えます。メイン メニュー画面に表示するを待ちます。
- 次に、選択オプション 2: 編集シーケンス + 入力。
- シーケンスメニューを次のように編集します。
- 電圧または電流のどちらかを選択するのに、[モード] タブを使用します。+をクリックして現在選択し、 Enterキーを押します。
- 振幅タブの+/-に1 (mA)を選択し、 enter。
- 期間 (T)の+/-に1000 (ms)を選択し、 enter。
- パルス持続時間 (Tw)と+/- 2 (ms)に設定し、 Enterキーを押します。
- トリガー モード] タブで、ソフトウェアによって外部を選択し、 Enterを押してください。
- メイン メニューに戻るを選択オプション 4: シーケンスを生成するキーを押します。
注: 電気刺激装置は、シリアル ・ ポートを介して機械的刺激装置アプリケーションからトリガー コマンドを受け取るまでにスタンバイにかかっています。
- コントロール アプリケーション パネル (図 2C) の機械的刺激のセクションで以下の手順を実行します。
- パルス周期テキスト コントロールで 1,000 (ms) を記述します。
- 機械的パルス持続時間を設定するの時間 (Tw)テキスト コントロールで 500 (ms) を記述します。
- 書き込み 2,000年 (AU)遠足テキスト コントロールで 10% コンストラクト伸長を提供します。これは、線形制御モーターのステップ数です。
注: ここに適用刺激プロトコル 1 Hz と 7 日間のストレッチ 10 %50 mV/cm の交互になる電流 2 ms 相性矩形波パルスので構成されます。機械的パルスの立ち上がりと立ち下がり時間は、大体炉圧力パルスの形状を模倣する、100 ミリ秒に設定されます。また、繰り返しモード連続に設定されて、パルスの数を表示するカウンターがあります。
- 電気刺激装置に切り替えます。メイン メニュー画面に表示するを待ちます。
- メディア 2 倍の週 (月曜日と木曜日の午後) を変更します。最初に、古いメディアを削除します。次に、PDMS サポート、決して直接細胞のプールの両側に暖かいメディアを追加します。
注:セルは、高い成長率を持っている、メディアは変更された 3 倍の週 (例えば、月曜日、水曜日、および金曜日) をする必要があります。切断、すべてのケーブルを再接続する必要があるが、培養皿と電極の場所から削除する必要はありません。 - 実験の実行後は、サンプルを収集します。
4 実験 (7 日目) の終わりサンプル コレクション
-
RNA の解析
- 構造体を洗って 3 ml の 1x PBS 室温で 5 分間の 2 倍。
- (構造体全体をカバーするために十分な) 各プレートに 0.05% トリプシン-EDTA の 3 mL を追加し、37 ° C で 5 分間待つ
- セルが切り離された後は、トリプシン-EDTA を不活化する完全培地 2 mL を追加します。
- 15 mL のすべてのセルがチューブし、コンストラクトを洗う収集 3 ml に残っているセルを収集する PBS の 2 倍。
- 230 x gで 22 ° C で 5 分間遠心
- 上澄みを除去し、1 mL の PBS でペレットを再懸濁します。
- 1.5 mL チューブ、230 x gで 5 分間遠心する携帯ソリューションに転送します。
- 上澄みを除去し、さらに RNA の隔離のための溶解試薬の 700 μ L で-80 ° C でペレットを格納します。
- 製造元の指示に従って商業キットを使用して RNA を分離します。
- キットと製造元のプロトコルによると、ランダムな hexamers を使用して隔離された RNA を逆転写。
- 小さな RNA 濃度 preamplify し、RNase フリー、希釈 1:5 水以降のリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を実行する前に。リアルタイム RT-PCR のための標準プロトコルを続けるし、主な心疾患マーカーをチェックします。
注: 典型的な心筋マーカーを構成する心筋転写因子などの異なる種類の初期と後期のマーカー (心筋固有エンハンサー要因 2 a [MEF2A] GATA 結合タンパク質 4 [潟-4]) と構造 (心筋トロポニン私 [cTnI] 心臓トロポニン T [cTnT] α-アクチニン) とカルシウム調節 (Connexin43 cx [43] サルコ-/小胞体 ca 2 +-[SERCA2] atp アーゼ)30。蛋白質の隔離は、必要な場合にも実行できます。RNA および蛋白質の同時分離は、サンプル量が少ない場合、市販試薬・ キット (材料表) を使用して、同じサンプルを実行できます。
-
Immunostainings の
注:これは PDMS コンストラクトの細胞のプールに接続されているセル上で直接実行されます。したがって、お勧めします配置、プレートから離れて細胞のプールの上にパラフィン フィルムの 1 cm x 1 cm の蓋を培養溶液の蒸発を最小限にするたびに。- 構造体を洗って部屋の温度で 5 分間 3 mL の PBS で 2 倍。
- 2 ml の 10% ホルマリン室温で 15 分間の構成要素に接続されているセルを修正します。
- 洗浄セル 3 x 3 ml の PBS の室温で 5 分間。長期保存のためサンプルを PBS で 4 ° C では、0.1% アジ化ナトリウムを残す
- 3 ml の PBS + 0.5% 洗剤のセルを permeabilize (x, それぞれ 3 時間室温での 5-10 分)。
- 非特異的な抗体の結合をブロックする 100 μ L の PBS + 10% 馬血清 0.2% 洗剤 + 1 時間室温で 1% ウシ血清アルブミンの細胞を孵化させなさい。
- 100 μ L の PBS + 10% 馬血清 0.2% 洗剤 + 1% ウシ血清アルブミン + 1 時間室温で一次抗体と細胞を孵化させなさい。たとえば、一次抗体配列とコネキシン 43 (1: 100)、サルコメア α-アクチニン (1: 100) 潟 4 (1:50)、MEF2 (1:25)、および SERCA2 (1:50)。
- 5 分間室温で 3 mL の PBS で 3 x を洗います。
- 100 μ L の PBS + 1 h、暗所に室温で二次抗体と細胞を孵化させなさい。
注:二次抗体は異なった fluorophores が付いている共役し、counterstaining エージェントが使用されました。 - 洗って 5 分、暗所に室温で 3 mL の PBS と 3 倍。
- 室温 15 分間暗闇の中で核染色 (0.1 μ g/mL) 100 μ L で細胞を PBS で孵化させなさい。
- 洗って 5 分、暗所に室温で 3 mL の PBS と 3 倍。
- 4 ° C では、0.1% アジ化ナトリウムを 3 mL の PBS で取得までのサンプルを格納します。
注:施工厚は約 0.5 mm のため長作動距離対物レンズで倒立蛍光と共焦点顕微鏡に顕微鏡の獲得です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 2は、細胞の刺激の一般的なスキーマを表します。簡単に言えば、細胞 PDMS コンストラクトでシード, 週に 2 回を行うメディア変更で電気刺激を受ける.Nonstimulated セルは、電気エアコンのコントロールとして使用されました。また、我々 は、実験に余分なコントロールを追加、皮下 ATDPCs 心臓 ATDPCs コントロールとして使用されていました。皮下の ATDPCs は、次の心臓 ATDPCs33と同じ分離と培養手順皮下脂肪から取得されます。PDMS の構成要素に接続されている細胞は、刺激の前後に典型的な紡錘状の表現型を証明されています。また、この場合次の垂直パターン、パターン付きのサーフェスによるとセルが配置されます。
電気的・機械的刺激が個別に最適化された最初。まず、電気刺激は、心臓の ATDPCs10の最もよいことがわかった 1 Hz で 50 mV/cm の矩形波パルスする交互になる電流 2 ms の相性で以前の研究に基づいていた。我々 は電気刺激に MEF2A など心臓の ATDPCs の早期の心臓マーカーの発現が増加したことを報告した (P = 0.050) と潟 4 (P = 0.031 現在)、遺伝子構造とカルシウム処理の効果は認められなかった (データは示されていない) が、.
第二に、10% のストレッチと、50% のデューティ ・ サイクル、100 ms の上昇と 1 Hz の台形波形から成っていた mechanostimulation プロトコルと圧力を模倣する立ち下がり時間が21の前に完全に記載されている、心臓のサイクルします。機械的刺激の心臓 ATDPCs 拡張など α-アクチニンの構造遺伝子の発現 (P = 0.001) または cTnI (P = 0.044)、早期心筋マーカー、潟 4 の増加傾向を示し (P = 0.068) と T ボックス転写因子 5 (Tbx5;P = 0.065) (データは示されていない)。由来する機械的刺激の効果は、パターン付きのサーフェスに強く依存しました。
その後、両方のプロトコルは、血によって心室充填に似た心の ATDPCs の効率的な電気刺激のため結合されました。結果のプロトコルでは、1 Hz と 10 %7 日30ストレッチ 50 mV/cm の交互になる電流 2 ms 相性矩形波パルスで構成されます。全体的にみて、基づかせ刺激心臓 ATDPCs は潜在的な彼らの cardiomyogenic を強化しました。刺激の心臓 ATDPCs 初期と後期心臓の遺伝子 (図 3A) 心筋転写因子 GATA 4 すなわち、発現の増強 (P = 0.050)、構造マーカー β-ミオシン重鎖 (β-MHC;P = 0.000)、およびカルシウム関連遺伝子配列とコネキシン 43 (P = 0.025)。電気の刺激に起因する遺伝子変調は、タンパク質レベル (図 3B M) でも翻訳されました。ファロイジンをアクチン繊維と染色を示した細胞の大半が垂直パターンに従って配置する配列とコネキシン 43 配布されたギャップを介して細胞間コミュニケーションに貢献する、細胞膜、細胞質を中心に接合 (図 3B E)。MEF2 と潟 4 転写因子が心臓 ATDPCs; の核にあります。しかし、潟 4 は皮下 ATDPCs (図 3F M) で検出されませんでした。細胞質マーカー SERCA2 と α-アクチニンのサルコメアを示さなかった成熟した筋組織、心筋細胞の典型的なして (図 3F M) の細胞集団を刺激暴行コントロールでは観察されなかった。
図 2:電気刺激プロシージャ、単位、およびユーザー インターフェイスです。(A) 電気刺激スキーマ 0 日 nonstimulated 細胞と垂直の表面パターンを持つ構造体の両方、7 日目で刺激の細胞の代表的なイメージで。スケール バー = 100 μ m。 (B) 電気刺激装置: PDMS 構築、電極と固定/携帯電話磁石をシードします。(C) 機械的刺激のコントロール アプリケーション パネル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:心筋および皮下 ATDPCs の電気刺激後メインの心臓マーカーの遺伝子および蛋白質の表現。(A) 心筋および皮下 ATDPCs の主な心臓遺伝子のリアルタイム PCR。相対式刺激対の cardiomyogenic マーカーの心臓と皮下 ATDPCs に行わなければなりませんコントロールが表示されます。値は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ式に正規化された、六つの独立した実験のため ± SEM の意味が表示されます。P < 0.05 (意義)。(B ・ M)垂直パターン表面発現制御と刺激細胞の主な心臓マーカーの心臓と皮下 ATDPCs の蛋白質の表現。ファロイジン染色 (actinF; 赤) と配列とコネキシン 43 式 (緑)、SERCA2 (赤) (緑)、MEF2 サルコメア α-アクチニン (赤) とコントロール (パネルB、 D、 F、 H J L で潟 4 (緑) 式) および刺激 (パネルC、 E、 G、 I K、およびM) の心臓 (左) と皮下 (右) ATDPCs。核を DAPI で counterstained された (青; パネルB - E L、およびM)。スケールバー = 50 μ m。この図は、Llucià Valldeperas から変更されているら30。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
電気刺激は、敵対心環境の細胞を準備および心臓のコミットメントの強化の安全な代替案のように見えます。ここでは、プロトコルの主な心臓マーカーの発現を増加され、心臓前駆細胞で説明報告梗塞マウス心筋30次の注入のために有益であること。一般に、電気機械的刺激の心臓 ATDPCs は早期に関連、構造解析、遺伝子やカルシウム調節前の電気的または機械的刺激と個別に達成されたことの表現を高めた。実際、電気機械的刺激心 ATDPCs はより完全なプロフィールを表示、以前の報告よりもより心臓の血統にコミットするように見えた。
変調心臓遺伝子発現はした皮下 ATDPCs と比較して心臓の ATDPCs の顕著な豊胸後は特に電気の刺激の後、両方のセルの種類。この結果はそれぞれのセル隔離、すなわち、心外膜や皮下脂肪用脂肪組織の起源の結果かもしれない。心臓と心膜の両方を取り巻く、心外膜脂肪組織は代謝活性の高いオルガンと前駆細胞のソースです。関心、心外膜脂肪が心筋の解剖学的および機能の継続性。通常の状況で、心外膜脂肪が生化学的および発熱心保護のプロパティ逆に、病理学的条件の下でそれは39の心に影響を与える炎症性サイトカインを分泌できます。確かに、心臓 ATDPCs 固有の心臓のような表現があるし、潟 4、心臓に適応ではない皮下 ATDPCs と比較して、SERCA2、サルコメアの α-アクチニン配列とコネキシン 43 など、心臓マーカーの発現を展示環境34。したがって、効果に由来する電気刺激が心臓前駆細胞、そのニッチはの近くにまたは心筋の環境の内でより大きいかもしれない。
のどの遺伝子の変調セル人口に依存する強く最後の観察から各細胞集団のプロトコルの最適化をお勧め、このプロトコルで記述されているそれらからおおよその値を抽出できます。細胞の電気刺激で最も重要な手順は、セル添付ファイルと刺激の体制 (強度、期間、頻度)。
たとえば、電気パラメーターが重要です。増加値より適切な未熟な多能性幹細胞由来心筋細胞40,41 などの電気活動を細胞だろうので確かに、応用電界強度だった靖セルの最適です.心臓 ATDPC 電気刺激のための予備実験を直流電流と高電圧による細胞増殖停止及び細胞死の10を示した。これらの結果から交互になる電流と低電圧のプロトコルはさらなる実験のため採用されました。
さらに、播種効率42を豊かにするためのコーティングやプラズマ処理が示唆されたので、いくつかの細胞系統は PDMS 表面に低添付ファイルを提示します。さらに、各セルのサイズと成長、増殖性が高いセルの値を減少または小さい細胞のそれらを増加に適応する必要がありますセル播種したがって、いくつかの試験の播種 PDMS 構築する上でいくつかの量を推奨します。最後に、プロトコルは細胞膜上に行ったし、値が三次元のシナリオ (すなわち、細胞密度) の異なる場合があります。
さらに、表面のパターンは、機械セル トレーニングでキーの役割を果たします。機械的刺激ではなかった別のサーフェス間で同じ後パターン、および彼らのパフォーマンスによると、細胞が整列されていることが示されました。心筋梗塞と細胞外マトリックスのモチーフを改造に関連付けられた垂直パターンの表面 (伸縮力に垂直) 分泌蛋白質でシード ATDPCs 例えば、機械的刺激の心臓。Mechanostimulated 心臓心臓再生21に関連付けられているから分泌されるタンパク質 nonpatterned 表面上の ATDPCs シードされます。
このメソッドの主な機能は、上記記載されています。ただし、これらの機能を達成するためにユニークな方法の一つとしてストレッチ細胞の非侵襲的アプローチを強調することが重要です。関心の同じデバイスは、電気的や機械的刺激を送信できますので、異なる刺激や細胞から生成されるエフェクトの直接比較は可能です。さらに、透明性と、薄さのおかげで、構築する上で播種された細胞の可視化は、刺激の前後、時にセルの状態を評価するための明確な利点です。
デバイスとプロトコルいくつかすでに指摘しているそれらのいくつかの制限があります。最初に、それのように設計され、単層細胞培養と三次元細胞培養のために最適化されました。具体的には、付着性のセルだけは、単分子膜の設定で使用できます。非粘着性細胞三次元アプローチを実装する必要があります。第二に、コンストラクト サイズ制限シードの表面;したがって、刺激細胞数が少ないとすべての実験セットさらに遺伝子やタンパク質の解析に十分なサンプルを収集するために複数の複製が必要です。スケール アップは大規模な動物実験または、セルの高用量が必要; 臨床の翻訳のために必須このような場合は、大きな刺激面を見なすことができます。
このプロトコルの主なアプリケーションには、携帯、エアコン、疾患モデル作製、薬剤のスクリーニングが含まれます。この刺激が細胞の成熟を高め、応用は達成し、成熟した表現型を維持するのに役立つでしょう。一方、機能的な表現型の大人の心筋に存在を模倣細胞疾患モデリングとオルガン オンチップ実験のため重要であります。確かに、人間の生検は、通常末期や事後のサンプル モデル動物が人間の生理と症状に常に要約できないので病気の進行を表すことはできません。それにもかかわらず、人間誘導された多能性幹細胞の使用は、メカニズムの根本的な病理学開発43の解明のための代替手法として登場しました。さらに、チップ上の臓器がミニチュアのティッシュおよび器官無菌培養人間 (病態) 生理学的モデリングと三次元構造を模倣します。彼らの目的は、制御で簡単な方法で人間の生理と疾患の特定の側面を摘記して既存のセルと動物モデル44の制限に対処できる最小機能単位を確立することです。
その一方で、創薬スクリーニング生物環境現在私n 生体の高スループット、心筋細胞応答を介して薬の安全性をテストするための小型のシステムを模倣する文化のプラットフォームが必要です。臨床的に関連性の高い読み出しを要約する成熟細胞をされる可能性があります (私。 e.、収縮動態) 対象45疾患のメカニズムを解明し、新規治療する高スループット試金で。
心臓フィールドはこのプロトコルの主な範囲が、それが簡単に適応する神経や骨格ドメインこれらの環境は、電気的・機械的刺激によって特徴付けられるので。物理的な刺激と以前の研究では、有益な成果46,47,48,49,50を示しています。
結論としては、心臓 ATDPCs の同期電気機械調節のための新しいプロトコルが記載されています。結果のプロトコルとデバイスが広範囲テストおよび検証された個々 と同期の刺激のため。ATDPCs の同期電気機械設備は潜在的な彼らの cardiomyogenic を高め細胞療法、疾患モデル作製、および創薬スクリーニングの有望な戦略として現れます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、刺激デバイスおよびプロトコルは (WO 2013185818 A1、WO 2017125159 A1) 以前に特許を取得したことを除いて開示、何もありません。
Acknowledgments
著者は、ICREC 研究プログラム (IGTP、バダロナ) と電子と生体計測グループ (UPC、バルセロナ)、特に教授 J. Rosell ・ フェレールのメンバーに感謝したいです。さらに、著者認める幹細胞トランスレーショナル医学ジャーナルと以前公表数値 (Llucià Valldeperas、らの適応を許可するための AlphaMed プレス30). このプロトタイプの開発とプロトコルのデザインは Ministerio デ Educación y サイエンス (SAF 2008-05144) Ministerio デ Economía y Competitividad (SAF 2014 59892)、欧州委員会によって支えられた第 7 フレームワーク プログラム (RECATABI、NMP3-SL-2009-229239)、読書用ラ Marató デ TV3 (080330、201516、201502)、フンダシオン ・ パラ ・ ラ Innovación y ラ Prospectiva en サラッド en エスパーニャ (FIPSE; 06 00001396 15)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulator | |||
| nickel plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-10-10-05-N | |
| nickel-plated neodymium magnets | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| ruled diffraction grating (1250 grooves/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motor controller | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Cell culture | |||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm cell culture dish | BD Falcon | 45353001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essential medium eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA analyses | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | |
| AllPrep RNA/Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 172-5140 | |
| Random hexamers | Qiagen | 79236 | |
| TaqMan PreAmp MasterMix 2x | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining | |||
| 10% formalin | Sigma | HT-501128-4L | |
| horse serum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Bovine Serum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| sodium azide | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 rabbit primary antibody | Sigma | C6219 lot#061M4823 | |
| sarcomeric α-actinin mouse primary antibody | Sigma | A7811 lot#080M4864 | |
| GATA-4 goat primary antibody | R&D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 rabbit primary antibody | Santa Cruz | sc-313 lot#E0611 | |
| SERCA2 goat primary antibody | Santa Cruz | sc-8095 lot#D2709 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
References
- McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
- Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
- Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
- Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
- Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
- Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
- Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
- Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93 (2014).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
- Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
- Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
- Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
- Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499 (2018).
- Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
- Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
- Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
- Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
- Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
- Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
- Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
- Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
- Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895 (2018).
- Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
- Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
- Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. Rosell Ferrer, F. X., Sánchez Terrones, B., Bragós Bardia, R., Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A. , Barcelano, Spain. WO/2013/185818 (2013).
- Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A., Soler Botija, C., Bragós Bardia, R., Rosell Ferrer, F. X. , Barceleno, Spain. WO/2017/125159 (2017).
- Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
- Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
- Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
- Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
- Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
- Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
- Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
