Summary
Qui descriviamo un protocollo per un metodo generale di pulse-chase che permette l'analisi cinetica di pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine da seguire in cellule vive.
Abstract
Impulso-insegua radioattivo etichettatura è un potente strumento per lo studio della maturazione conformazionale, il trasporto a loro posizione cellulare funzionale e la degradazione di proteine in cellule vive. Utilizzando radiolabeling tempi brevi (impulso) (< 30 min) e strettamente controllato chase volte, è possibile aggiungere etichette solo una piccola frazione della piscina della proteina totale e seguire sua pieghevole. Quando combinato con non riducente/riducendo l'elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) e immunoprecipitazione con anticorpi (conformazione-specifici), processi di piegatura può essere esaminato in dettaglio. Questo sistema è stato utilizzato per analizzare il ripiegamento di proteine con una variazione enorme in proprietà quali proteine solubili, proteine transmembrana singole e multi-pass, pesantemente N - e O-glicosil proteine e proteine con e senza bisolfuro di vasto incollaggio. Impulso-insegua metodi sono alla base di studi cinetici in una gamma di funzionalità aggiuntive, tra cui co - e modifiche di posttranslational, oligomerizzazione e polimerizzazione, essenzialmente che consente l'analisi di una proteina dalla nascita alla morte. Impulso-Insegua gli studi sul folding delle proteine sono complementari con altri metodi biochimici e biofisici per lo studio delle proteine in vitro , fornendo una maggiore risoluzione temporale e informazioni fisiologiche. I metodi come descritto all'interno di questa carta sono adattati facilmente per studiare la piegatura di quasi tutta la proteina che può essere espressa nei sistemi mammiferi o insetto-cella.
Introduction
La piegatura delle anche relativamente semplice proteine coinvolge molti diversi enzimi pieghevoli, chaperoni molecolari e modificazioni covalenti1. Una ricostituzione completa di questi processi in vitro è praticamente impossibile, dato il vasto numero di differenti componenti coinvolti. È altamente auspicabile, pertanto, per studiare il folding delle proteine in vivo, in cellule vive. Impulso-insegua radioattivo tecniche rivelarsi uno strumento potente per studiare la sintesi, pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine nel loro ambiente naturale.
Il metabolica etichettatura delle proteine durante un breve impulso con 35S-labeled metionina/cisteina, seguita da un inseguimento in assenza di un'etichetta radioattiva, permette il rilevamento specifico di una popolazione di proteine appena sintetizzate nel più ampio ambiente cellulare. Quindi, proteine bersaglio possono essere isolato tramite immunoprecipitazione e analizzati tramite SDS-PAGE o altre tecniche. Per molte proteine, il loro viaggio attraverso la cella è segnata da modifiche che sono visibili su gel di SDS-PAGE. Ad esempio, il trasporto di proteine glicosilate dal reticolo endoplasmatico (ER) al complesso di Golgi è spesso accompagnato da modifiche dei glycans N-collegati o l'aggiunta di glicani O-collegata2,3. Queste modifiche causare grandi aumenti nella massa molecolare apparente, che può essere visto dai cambiamenti di mobilità in SDS-PAGE. Maturazione può anche essere contrassegnato da fenditure proteolitici, come fenditura del peptide di segnale o la rimozione di pro-peptidi, conseguente cambiamenti nella apparente massa molecolare che possono essere seguite facilmente su gel di SDS-PAGE4. Radioattività ha notevoli vantaggi rispetto alle tecniche comparabili come inseguimenti cicloesimmide, dove sintesi proteica romanzo è impedita, come trattamenti di lunga durata sono tossici per le cellule e non escludono la maggior parte delle proteine più vecchio, allo steady-state dalla analisi, come alcune proteine hanno emivite di giorni. Il confronto di proteine sotto entrambi non riducente e condizioni riducenti permette l'analisi della formazione di legami disolfuro, un passo importante nella piegatura di molte proteine secretorie4,5,6, 7.
Qui descriviamo un metodo generale per l'analisi del protein folding e trasporto in cellule intatte, utilizzando un approccio di impulso-insegua radioattivo. Mentre abbiamo l'obiettivo di fornire il metodo come dettagliato possibile, il protocollo ha un potenziale quasi illimitato per adattabilità e permetterà di ottimizzazione studiare le proteine specifiche di ogni lettore.
Sono disponibili due protocolli alternativi pulse-chase, uno per cellule aderenti (passo 1.1 del protocollo presentato qui) e uno per cellule in sospensione (punto 1.2 del protocollo presentato qui). Le condizioni di cui qui sono sufficienti per visualizzare una proteina espressa con livelli di medio-alta espressione. Se il lettore sta lavorando con proteine mal espresse o varie condizioni dopo trattamento, quali immunoprecipitati multiple, è necessario aumentare le dimensioni del piatto o numero di cellulare in modo appropriato.
Per chase di impulso di sospensione, i campioni di chase prelevati in ogni momento sono tutti presi da un singolo tubo di cellule. Le fasi di lavaggio dopo l'impulso vengono omessi; invece, ulteriore incorporazione di 35S è impedita da diluizione con un elevato eccesso di adenoida metionina e cisteina.
I protocolli presentati utilizzano radioattivo 35S-labeled cisteina e metionina per seguire processi di folding delle proteine cellulari. Tutte le operazioni con i reagenti radioattivi devono essere eseguite utilizzando adeguate misure di protezione per ridurre al minimo qualsiasi esposizione dell'operatore e dell'ambiente di radiazione radioattiva ed essere eseguite in un laboratorio designato. Come la pulse-chase etichettatura tecnica è relativamente inefficiente a volte di impulso corto (< 15 min), meno di 1% dell'importo iniziale di radioattività è incorporato nelle proteine recentemente sintetizzate. Dopo l'arricchimento della proteina tramite immunoprecipitazione destinazione, il campione per SDS-PAGE contiene meno dello 0.05% della quantità iniziale di radioattività.
Anche se il 35S metionina e cisteina etichettatura mix è stabilizzato, si verificherà alcune decomposizione, producendo composti radioattivi volatili. Per proteggere il ricercatore e l'apparato, dovrebbero essere prese alcune precauzioni. Il ricercatore deve sempre obbedire alle regole di sicurezza di radiazione locale e può indossare un carboncino maschera, oltre a un camice da laboratorio e guanti (doppie) di professione d'infermiera. Stock flaconcini con 35S metionina e cisteina devono sempre essere aperto in una cappa, o sotto un punto di aspirazione locale. Macchie di contaminazione noto laboratorio sono centrifughe, pipette, bagni d'acqua, incubatori e agitatori. La contaminazione di queste aree è ridotto mediante l'utilizzo di puntali per pipette con un filtro al carbone, positivo-seal per microcentrifuga (Vedi Tabella materiali), Acquario carbone spugne in acqua bagni, carbone filtri di carta incollati nei piatti pulse-chase, guardia del carbone di legna nel sistema di aspirazione e il posizionamento dei piatti che contiene granelli di carbone di legna in incubatrici e contenitori di stoccaggio.
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Protocol
Tutti i reagenti radioattivi ed erano gestite conformemente alle norme e regolamenti di radiazione locali Università di Utrecht.
1. pulse Chase
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Inseguimento di impulso per le cellule aderenti
Nota: I volumi qui riportati sono basati su piastre di coltura cellulare di 60 mm. Per piatti di 100 mm o 35 mm, moltiplicare i volumi da 1/2 o 2, rispettivamente. Questo protocollo utilizza un tempo di impulso di 10 min e chase volte di 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min. Questi può essere variati a seconda le proteine specifiche in fase di studio (discusse sotto).- Semi di cellule aderenti (ad es., HEK 293, HeLa, CHO) in sei piastre di coltura delle cellule di mm 60 affinché siano subconfluent (80% - 90%) il giorno della caccia impulso. Utilizzare almeno un piatto al punto di tempo e/o condizione.
- Se necessario, transfect le cellule con i reagenti di transfezione commercialmente disponibili secondo le istruzioni del produttore; in alternativa, viralmente trasdurre8 cellule 1 giorno prima la pulse-chase sperimentare con il costrutto appropriato per l'espressione.
- Lavare i piatti con 2 mL di tampone di lavaggio (Hank equilibrata soluzione salina [HBSS]), aggiungere 2 mL di terreno di inedia (normale mezzo di coltura privo di metionina e cisteina e siero bovino fetale [FB], come minimo mezzo essenziale [MEM] senza metionina e cisteina ma con 10 mM HEPES, pH 7.4) e mettere i piatti in un incubatore 37 ° C con 5% CO2 per 15 min.
- Trasferire i piatti per i rack in un bagno di acqua preriscaldata 37 ° C in modo che sono a contatto con acqua, ma non galleggiano. Avviare un timer.
- 40 s, aspirare il mezzo di inedia, redigere 600 µ l di soluzione di impulso (media di inedia + 55 µ ci/35 mm piatto label, vedere la nota precedente punto 1.1.1) nella pipetta e aggiungerlo delicatamente al centro del piatto in esattamente 1 minuto Ripeti questo passaggio a intervalli di 1 min per t piatti rimanenti di lui. Iniziare con il campione di inseguimento più lungo per risparmiare tempo durante l'esperimento.
Nota: Durante la manipolazione di materiale radioattivo, è essenziale seguire le precauzioni appropriate e regolamenti per prevenire l'esposizione accidentale e/o contaminazione locale. - A esattamente 11 min e per tutti i seguenti piatti, fatta eccezione per il campione di chase 0 min, aggiungere 2 mL di terreno di caccia direttamente al piatto, aspirare esso e ancora una volta, aggiungere 2 mL di terreno di caccia. Ripetere questo passaggio a intervalli di 1 min per piatti rimanenti. Trasferire tutti i piatti in un incubatore a 37 ° C.
- A esattamente 16 min, aggiungere 2 mL di terreno di caccia (terreno di coltura normale + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5mm cisteina e metionina 5 mM) direttamente per il piatto di campione 0 min in cima il mezzo di impulso per interrompere etichettatura; quindi, aspirare immediatamente, trasferire il piatto su una lastra di alluminio raffreddato e aggiungere 2 mL di tampone di arresto ghiacciata (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]).
Nota: Questo è l'esempio di chase 0 min. Per questo esempio, procedere direttamente al passaggio 1.1.9. - Trasferire ogni piatto chase torna a bagnomaria 2 min prima ogni chase (ad es., 24 min per un inseguimento 15 min) e, al tempo esatto chase (ad es., 26 min per un inseguimento 15 min), aspirare i media chase (o trasferirlo su un tubo del microcentrifuge se seguito pr secrezione di stabilizzati) e trasferire il piatto su una lastra di alluminio raffreddato. Aggiungere 2 mL di tampone di arresto ghiacciata.
- Incubare tutti i piatti sul ghiaccio nel buffer di stop per ≥ 5 min; aspirare la soluzione di arresto, quindi lavarla con 2 mL di soluzione di arresto ghiacciata. Aspirare il lavaggio e lisare piatti con 600 µ l di tampone di lisi (tampone fosfato salino [PBS] + nondenaturing detergente [vedi Tabella materiali] + inibitori della proteasi + 20mm NEM). Utilizzare un raschietto di cella per garantire che i piatti vengono lisati quantitativamente.
- Trasferire il lisato una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 10 min a 15.000-20.000 x g e 4 ° C per appallottolare i nuclei.
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Pulse Chase per cellule in sospensione
Nota: Per garantire etichettatura efficiente, dovrebbero essere pulsate cellule ad una concentrazione di 3 x 106 a 5 x 106 cellule/mL e chase volumi dovrebbero essere 4 volte il volume di impulso. Nell'esempio seguente, abbiamo pulsata 5 x 106 cellule in un volume di 1 mL per 10 min, a cedere cinque chase tempo punti (0, 15, 30, 60 e 120 min) da 1 mL, contenente 1 x 106 cellule per punto nel tempo. Tutte le soluzioni sono le stesse della sezione 1.1.- Coltura le cellule in sospensione (ad es., 3T3, Jurkat) secondo un protocollo precedentemente pubblicato9 in modo che vi sia un numero sufficiente di cellule al momento dell'esperimento, almeno 1 x 106 cellule per tempo punto e/o condizionano.
- Se necessario, transfect cellule con reagenti di transfezione commercialmente disponibili secondo le istruzioni del produttore, o viralmente trasdurre8 cellule 1 giorno prima la pulse-chase sperimentare con il costrutto appropriato per l'espressione.
- A pellet di 5 x 106 cellule per condizione in una provetta da 50 mL per 5 min a 250 x g a temperatura ambiente, lavarli 1 x 5 ml di media di inedia, appallottolarli nuovamente e li risospendere in 1 mL di media di inedia.
- Trasferire le cellule a bagnomaria a 37 ° C ed incubare li per 10-25 min. Agitare i tubi ogni 10-15 minuti per impedire le cellule di depositarsi sul fondo.
- Avviare il timer. A esattamente 1 min, aggiungere 275 µ ci (55 µ ci/1 x 106 cellule) dell'etichetta non diluito direttamente nella provetta contenente cellule e per mescolare.
Nota: Durante la manipolazione di materiale radioattivo, è essenziale seguire le precauzioni appropriate e regolamenti per prevenire l'esposizione accidentale e/o contaminazione locale. - A esattamente 11 min, smettere di etichettatura con l'aggiunta di 4 mL di terreno di caccia. Mescolare il campione e immediatamente trasferire 1 mL in una provetta da 15 mL sul ghiaccio, contenente 9 mL di soluzione di arresto ghiacciata.
Nota: Questo è l'esempio di chase 0 min. - Ripetere questi passaggi per ogni punto di tempo successivi. Una volta sono raccolti tutti i punti di tempo, agglomerare le cellule per 5 min a 250 x g a 4 ° C. Aspirare il mezzo (o trasferirlo in una provetta da 15 mL nuovo se seguendo la secrezione della proteina). Lavare le cellule con 5 mL di soluzione di arresto e agglomerare le cellule per 5 min a 250 x g a 4 ° C.
- Aspirare la soluzione di arresto, completamente lisare le cellule con 300 µ l di tampone di lisi ghiacciata e li Incubare per 20 minuti sul ghiaccio per garantire una lisi completa. Trasferire il lisato una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 10 min a 15.000-20.000 x g a 4 ° C per appallottolare i nuclei.
2. immunoprecipitazione
- Combinare l'anticorpo (Vedi la discussione) e 50 µ l di immunoprecipitazione Perline (ad es., proteina un-Sepharose della) (10% sospensione [v/v] in tampone di lisi + 0,25% di sieroalbumina bovina [BSA]) in una microcentrifuga tube e li Incubare a 4 ° C per circa 30 min in uno shaker.
- A pellet le perline per 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente e aspirare il supernatante. Aggiungere 200 µ l di lisato alla miscela dell'anticorpo-perlina e incubare a 4 ° C in un agitatore per 1 h o testa-testa-se richiede l'immunoprecipitazione > 1 h.
- A pellet le perline per 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di immunoprecipitazione. Il campione viene posto in uno shaker a temperatura ambiente per 5 min.
- Le perline il pellet come descritto al punto 2.3 e ripetere il lavaggio 1X. Quindi, aspirare il supernatante e risospendere le sfere in 20 µ l di buffer di TE, pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vortexare il campione.
- Aggiungere 20 µ l di 2x buffer del campione senza l'agente riduttore, vortice, riscaldare per 5 minuti a 95 ° C e vortexare ancora.
Nota: se solo preparazione campioni riducentesi, 2 µ l di 500 mM DTT deve essere aggiunto a questo punto. Quindi, procedere al punto 2.7. - Pellet, le perle come descritto al punto 2.3. 19 µ l del surnatante nonreduced di trasferimento ad un tubo del microcentrifuge fresco contenente 1 µ l di 500 mM DTT, centrifugare il campione e vortice prima riscaldarla nuovamente per 5 min a 95 ° C.
- Rotazione verso il basso il campione per 1 min a 12.000 x g; si tratta di campione ridotto. Raffreddare fino a temperatura ambiente e aggiungere 1,1 µ l di 1 M NEM sia ridotto e l'esempio di nonreduced. Vortex e centrifugare i campioni.
3. SDS-PAGE
- In primo luogo, determinare l'appropriata percentuale di gel di risoluzione SDS-PAGE per la proteina di interesse. Ad esempio, gp120 di HIV-1, quando deglicosilata, corre a ~ 60 kDa ed è analizzato in un gel di 7,5%.
- Preparare la miscela di gel di risoluzione senza TEMED secondo le istruzioni del produttore (x % di acrilammide, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] 0,1% SDS [p/v] e 0.05% ammonio persolfato [APS] [p/v]) e degassare sotto vuoto per > 15 min. Mentre la miscela di gel è degasaggio, pulire le piastre di vetro di gel con etanolo al 70% e privo di lanugine tessuti e inserirli in un apparato di colata.
- Aggiungere TEMED per la miscela di gel di risoluzione (a una concentrazione finale di 0,005% [v/v]), mescolare accuratamente e pipettare tra lastre di vetro, lasciando uno spazio di ~1.5 cm per il gel d'impilamento. Attentamente il gel con deionizzata H2O o isopropanolo di sovrapposizione e lasciarlo a polimerizzare.
- Una volta che il gel di risoluzione ha polimerizzato, preparare la miscela di gel di impilamento (4% di acrilammide, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], 0,1% SDS [p/v] e 0.025% APS [p/v]).
- Lavare la parte superiore del gel di risoluzione con deionizzata H2O e, successivamente, togliere tutta l'acqua.
Nota: Utilizzare carta da filtro per rimuovere le ultime gocce. - Aggiungere TEMED per la miscela di gel di impilamento (0,005% [v/v]), mescolare accuratamente e il gel di risoluzione con gel d'impilamento di sovrapposizione e inserire un pettine 15-pozzo. Una volta che il gel d'impilamento ha polimerizzato, trasferirlo in una camera di esecuzione e riempire le camere superiori e inferiori con tampone di corsa (25 mM Tris-HCl, glicina 192 mM [pH 8.3] e 0,1% SDS [p/v]).
- Caricare 10 µ l di campione per corsia in un minigel 15-lane. Evitare di caricare i campioni nella prima e l'ultima corsia sul gel e caricare il buffer del campione non riducente in tutte le corsie vuote per evitare la sorridente delle bande. Eseguire i gel al costante un 25 mA/gel, fino a quando la parte anteriore della tintura è nella parte inferiore del gel.
- Rimuovere il gel da lastre di vetro, macchia i gel con soluzione di macchiatura della proteina (acido acetico al 10% e 30% metanolo in H2O + 0,25% brillante blu R250 [p/v]) per 5 min con agitazione e quindi, decolorare per 30 min con soluzione (colorazione decolorante soluzione senza R250 blu brillante).
- Organizzare i gel a faccia in giù su una plastica avvolgono e, quindi, inserire carta di cromatografia di 0,4 mm in cima loro. Collocare il panino gel cromatografia su carta-lato giù su un gel di asciugatrice. Seguendo le istruzioni del produttore, asciugare il gel per 2 ore a 80 ° C.
- Trasferire i gel secchi su una videocassetta e le rivestirai con schermo pellicola o fosforo autoradiografia. Se si utilizza pellicola autoradiografia, questo passaggio deve essere eseguita in una stanza buia.
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Representative Results
La piegatura e la secrezione di gp120 di HIV-1 da un inseguimento di impulso aderente è illustrato nella Figura 2. Il gel non riducente (cellule NR nella figura) viene illustrato il folding ossidativo di gp120. Immediatamente dopo l'impulso di etichettatura di gp120 5 min (0 min chase) appare come una banda diffusa superiore nel gel, e col progredire della chase, la band migra verso il basso il gel attraverso ancora più diffusa pieghevole intermedi (IT) fino a quando non si accumula nella banda stretta (NT) che rappresenta in modo nativo piegato gp120. In questo caso come la formazione di ponti disolfuro aumenta la compattezza della proteina, causandone migrano più velocemente rispetto la proteina completamente ridotta. Sul gel riducente (cellule R nella figura), i legami disolfuro su tutte le forme sono state ridotte tale che, in ogni momento di chase, non sulla mobilità. Questo permette l'analisi di altre modifiche. Lo spostamento nel tempo da Ru a Rc rappresenta la fenditura di peptide di segnale post-traduzionale di gp120: la mobilità aumenta a causa della perdita del peptide segnale, che aumenta durante l'inseguimento più proteine più raggiungono la piega nativa e perdono loro peptide di segnale. Il gel non riducente e riducente, il segnale comincia a diminuire da ~ 1 h in poi a causa della secrezione di gp120. Questo può essere monitorato analizzando i media (Medium nella figura). Un confronto tra i gel non riducente e riducentesi scopre cambiamenti legame disolfuro e rimozione del peptide di segnale. Questo è stato possibile solo perché un'altra modifica, N-collegata della glicosilazione e glycan modifiche, sono stati rimossi da gp120 (e l'analisi) di digestione con endoglycosidase H appena prima di SDS-PAGE.
Il traffico della catena pesante dell'immunoglobulina M (IgM) da un inseguimento di impulso di sospensione µ è illustrato nella Figura 3. Uno spostamento nel tempo da HCER a HCGolgi rappresenta il traffico della catena µ dall'ER di Golgi, che precede la secrezione dalla cellula. Questo cambiamento nella massa molecolare è causato dalla modifica dei glycans N-collegati nel Golgi.
Figura 1 : Diagramma schematico del protocollo per impulso chase, immunoprecipitazione e SDS-PAGE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Pieghevole e la secrezione di gp120 di HIV-1, determinato da chase impulso aderente. Subconfluent 60 mm piatti delle cellule HeLa esprimendo la gp120 di HIV-1 erano impulso etichettati per 10 min e inseguito per indicato volte. Dopo l'immunoprecipitazione di gp120, i campioni sono stati deglicosilata e analizzati utilizzando un gel di SDS-PAGE del 7,5%. IT = pieghevole intermedi; NT = gp120 nativo; Ru = ridotta gp120 segnale-peptide-ApoAlert; RC = ridotto segnale-peptide-spaccati gp120; NR: = non riducente; R = riduzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Traffico della catena pesante di IgM, determinato da chase impulso sospensione. cellule di B di 5 x 106 i. 29 µ+ erano impulso etichettati per 5 min e inseguito per indicato volte. Dopo immunoprecipitazione, i campioni sono stati analizzati utilizzando un gel di SDS-PAGE 10%. HC = immunoglobulina µ pesante catena; LC = catena chiara dell'immunoglobulina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Impulso-insegua metodi sono stati essenziali per sviluppare la comprensione degli scienziati del ripiegamento proteico nella cellule intatte. Mentre abbiamo cercato di fornire un metodo che è più generale possibile, questo approccio ha il potenziale per variazioni quasi illimitate di studiare i vari processi che si verificano durante la piegatura, il trasporto e la vita delle proteine all'interno della cellula.
Quando si esegue un inseguimento di impulso utilizzando cellule aderenti nei piatti, è essenziale per trattare ogni piatto lo stesso per quanto possibile, come un piatto separato viene utilizzato per ogni punto nel tempo e/o condizione in un esperimento. Soprattutto per brevi tempi di impulso e chase (< 5 min), è essenziale per mantenere un controllo stretto sopra i tempi di impulso e chase (con un timer digitale). Sequenze di impulsi con cellule in sospensione possono contribuire a ridurre questa variabilità, come tutti i campioni sono prelevati da un singolo tubo. Come alcuni tipi di cellule aderiscono meno bene ai piatti di cultura rispetto ad altri, si dovrebbe prestare attenzione per garantire che le celle non vengono lavate via durante i vari cambiamenti medi. Questo può essere superato utilizzando queste cellule in sospensione o rivestimento i piatti con poly-L lisina o gelatina, ad esempio, per aderire le cellule per i piatti di cultura. Per misurare la riproducibilità di etichettatura tra piatti, un campione del lisato dovrebbe essere esaminato da SDS-PAGE per controllare tutti i campioni per modello identico di etichettatura e della proteina totale. In alternativa, scintillazione liquida conteggio dei lisati stabilirà i conteggi al minuto (cpm) totale incorporato ma non fornirà informazioni sulla popolazione di proteina etichettata.
Se una proteina bersaglio etichette male, il segnale è aumentato aumentando il numero di celle (o piatti) piuttosto che aumentando la quantità di etichetta. Allungando il tempo di impulso è un'opzione quando la cinetica del processo studiato permetterà questo. Il tempo di impulso ideale varia con ogni destinazione a causa di fattori quali il livello di espressione, il tasso di trascrizione, il numero di methionines/cisteine e il tasso di piegatura della proteina. Come tale, sperimentazione deve essere condotta per determinare il miglior equilibrio tra fattori sopra menzionati in ogni esperimento, mantenendo l'obiettivo sperimentale in mente. Se stanno studiandi intermedi durante la piegatura, ad esempio, è preferibile di impulsi l'etichetta per più breve tempo possibile avere il materiale di partenza più vicino uno stato spiegato come possibile, mentre i livelli di espressione di bilanciamento. In alternativa, se il trasporto o la degradazione di una proteina è la destinazione di studio, tempi di impulso possono essere allungati per fornire i massimi livelli di segnale possibile senza compromettere informazioni cinetiche. In generale, tempi di impulso possono variare da 2-15 minuti quando si utilizza questo protocollo senza modifiche. Precedente sperimentazione5 ha dimostrato un tempo di ritardo di ~ 10 s dopo il polso prima dell'incorporazione di radioattività nel pool di proteine totali; Questo è importante da tenere a mente in caso di derivazione cinetiche informazioni da esperimenti di pulse-chase. In breve mantenere tutti i piatti sul bagno di acqua durante il tempo intero d'impulso, impulso volte (< 2 min). Se impulso tempi prolungati (> 1 h) sono in uso, si consiglia di aumentare il volume di impulso di 1,5 volte e posizionare piatti su un rocker in un incubatore a 37 ° C durante l'impulso per evitare che i piatti dall'asciugarsi. Mentre contenente singoli 35S-metionina/cisteina o un mix di soluzioni di etichettatura sono disponibili, il mix è comodo anche quando le proteine che contengono solo metionina o cisteina sono essere etichettate come entrambi sono necessari per mantenere la sintesi proteica generale nella cella. Se condizioni sperimentali richiedono specifica metionina/cisteina etichettatura, i livelli di metionina/cisteina non radioattivi durante l'impulso devono essere regolati di conseguenza.
Chase volte (e il numero di intervalli di tempo) sono determinati in modo simile. Un buon punto di partenza è quello di impostare la prima volta di chase (dopo l'inseguimento 0 min) come uguale al tempo di impulso e, quindi, raddoppiare la lunghezza del tempo per ogni punto di tempo successivi (ad es., 5, 10, 20 e 40 min). Tuttavia, questo deve essere ottimizzato per ogni specifica proteina e la domanda.
Per evitare l'attivazione delle risposte di sforzo da inedia (che può riguardare la sintesi proteica e pieghevoli), idealmente, alcuni senza etichetta metionina e cisteina dovrebbe aggiungersi alle soluzioni inedia e radiolabeling. La quantità dipenderà la linea cellulare, il tempo d'etichettatura, la quantità di radiomarcato utilizzato e volumi dei supporti e avrà bisogno di prove. Un buon punto di partenza è l'1% della quantità di cisteina e metionina presente nel terreno di coltura delle cellule, che può essere aumentato con l'aumento di tempi di impulso. Periodi di inedia, con o senza aminoacidi senza etichetta, dovrebbe essere tenuto nella gamma di 15-30 min per garantire incorporazione etichetta adeguata ed evitare l'attivazione delle risposte di sforzo. Quando si utilizza un impulso prolungato (≥ 1 h), la fame non è necessaria.
Il buffer di lisi descritto qui sarà adatto per la maggior parte degli scopi, ma in linea di principio, qualsiasi sistema di buffer, ad esempio HEPES, Tris o MES, funzionerà. La concentrazione di detersivo necessaria per lisare cellule dipenderà il numero di cellule e volume detersivo. La concentrazione deve essere sempre sopra la concentrazione micellare critica (CMC) e la quantità di detersivo sufficiente a lisare cellule. Una regola empirica è che 200 µ l di detersivo nondenaturing 0,5% (Vedi Tabella materiali) è sufficiente per fare l'elettrolisi l'equivalente di cella di ~ 1 mg di proteina (~ 1 x 106 cellule). La concentrazione di sali e detergenti anche possono essere variati secondo l'applicazione, ma in generale, condizioni che rompere aperto i nuclei (alto sale, > 0,1% SDS) dovrebbe essere evitato come la presenza di DNA libero interferirà con immunoprecipitazione. Se questo non può essere evitato, per esempio, quando lisati completa tra cui nuclei o pellettati proteine devono essere analizzati, il DNA può essere tosato passando le cellule attraverso un ago di piccolo calibro prima di immunoprecipitazione. Questo è preferibile sonicazione in modo da evitare un'eccessiva formazione di schiuma e la produzione di aerosol radioattivo.
Per immunoprecipitazione, sia la quantità ottima di anticorpi che il tampone di lavaggio migliore per ogni combinazione di anticorpo-antigene deve essere testati accuratamente per raggiungere un equilibrio tra il segnale desiderato antigene e lo sfondo. Gli anticorpi dovrebbero essere sempre presenti in eccesso sopra antigeni affinché immunoprecipitazione quantitativa; un buon punto di partenza è di 1 µ g di anticorpi per immunoprecipitazione da un piatto di 35 mm/1 x 106 celle. Lo sfondo può essere ridotta aumentando il detergente o concentrazioni saline. In particolare, l'aggiunta di ≤ 0,1% SDS può contribuire a ridurre notevolmente lo sfondo ma può anche disturbare interazioni anticorpo-antigene. Per controllare per la specificità degli anticorpi durante immunoprecipitazione, cellule identiche manca la proteina bersaglio devono essere utilizzate quando disponibile. Se questo non è semplice, come quando stanno venendo analizzati proteine endogene, la sovraespressione o svuotamento dell'antigene funzionerà. Di sieri di controllo per lo sfondo (e specificità), entrambi preimmune (ove possibile) o isotipo i controlli devono essere usati. Per controllare per gli antigeni associazione direttamente a immunoprecipitazione perline, perline senza anticorpo dovrebbero anche essere utilizzato. Le condizioni di cui qui dovrebbero essere considerate come punto di partenza come ogni coppia di anticorpo-antigene richiederà un'ottimizzazione di tampone di lavaggio e di condizioni di lavaggio. In caso di troppo sullo sfondo, non aumentare il numero di lavaggi, ma piuttosto il tempo di lavaggio e/o la composizione del tampone di lavaggio. In caso di interazioni particolarmente sensibili come ad esempio in coimmunoprecipitations essere affrontato, può essere preferibile per svolgere tutte le fasi di lavaggio a 4 ° C, l'utilizzo di buffer ghiacciata.
Uno dei vantaggi delle celle aderenti su cellule in sospensione è quella droga trattamenti possono essere eseguiti in praticamente qualsiasi punto durante l'inseguimento di impulso. Se utilizzato con gli inibitori di chaperone, ad esempio, è possibile differenziare i suoi effetti sulle co - versus posttranslational fasi di un processo di piegatura. Questo può essere esteso, adattando i buffer di lavaggio Lisi e immunoprecipitazione (discussi in precedenza) per consentire la coimmunoprecipitazione di complessi proteina-chaperon durante pieghevole10,11,12.
Il trattamento postlysis di campioni amplierà l'ambito delle domande che possono essere affrontate. La digestione della proteasi limitato di proteine bersaglio prima di immunoprecipitazione fornirà ulteriori informazioni conformazionali ed è stato usato con successo per monitorare il ripiegamento delle proteine, specialmente quelli privi di legami disolfuro13, 14. L'aggregazione di proteine e formazione di complessi può essere monitorate mediante centrifugazione su gradiente di densità saccarosio prima immunoprecipitazione15,16.
Per trarre il massimo vantaggio di inseguimenti di impulso, la disponibilità dei reagenti di alta qualità è richiesta per immunoprecipitazione. Quando si esaminano pieghevole intermedi, è essenziale per avere anticorpi che sono in grado di tirare giù tutte le forme della proteina sotto analisi. Se gli anticorpi specifici per la proteina bersaglio non sono disponibili, questo può essere sostituito utilizzando i tag di affinità. Tuttavia, questo limita fortemente l'utilità dei metodi postlysis, ad esempio la proteolisi limitata, per sondare direttamente la conformazione della proteina, come possono essere recuperati soltanto i frammenti contrassegnati.
La sensibilità di impulso inseguimenti è limitata dal numero di residui di cisteina e metionina nella proteina in questione. Proteine con un basso numero di residui di metionina/cisteina accoppiati con un livello basso di espressione sono rilevabili in esperimenti di pulse-chase. Quando si eseguono le modifiche postlysis come proteolisi limitata, solo frammenti di metionina/cisteina-contenenti sarà rilevabili.
Per concludere, dato il dettaglio cinetico che impulsi inseguimenti forniscono, sono complementari a molte altre tecniche e strumenti utilizzati per lo studio di biologia cellulare molecolare a livello di stato stazionario. Come tali, essi continuano ad essere un prezioso componente nella casella degli strumenti del biologo molecolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziare tutti i membri del laboratorio Braakman, passato e presentano, per le loro discussioni fruttuose e aiutano a sviluppare i metodi presentati in questo articolo. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma quadro (FP7/2007-2013) N ° dell'Unione europea 235649 e i Paesi Bassi organizzazione della ricerca scientifica (NWO) sotto il programma ECHO-N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
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