Summary
Den gnaver venstre pneumonectomy er en værdifuld teknik i pulmonal hypertension forskning. Vi præsenterer her, en protokol for at beskrive den rotte pneumonectomy procedure og postoperativ pleje at sikre minimal sygelighed og dødelighed.
Abstract
I denne protokol, vi detalje den korrekte proceduremæssige skridt og forholdsregler, der med held udføre en venstre pneumonectomy og fremkalde PAH i rotter med den ekstra administration af monocrotaline (MCT) eller SU5416 (Sugen). Vi har også sammenligne disse to modeller til andre PAH modeller almindeligvis anvendes i forskning. I de sidste par år, er fokus for PAH dyremodeller flyttet til at studere mekanismen for angioproliferation af plexiform læsioner, hvor rollen som øget pulmonal blodgennemstrømning er betragtes som en vigtig udløsende faktor i udviklingen af svær pulmonal vaskulære remodellering. En af de mest lovende gnavere modeller af øget pulmonal flow er den ensidige venstre pneumonectomy kombineret med en "anden hit" af MCT eller Sugen. Fjernelse af venstre lunge fører til øget og turbulente pulmonal blodgennemstrømningen og vaskulære remodellering. I øjeblikket er der ingen detaljeret procedure for pneumonectomy kirurgi i rotter. I denne artikel beskrives en trinvis protokol af pneumonectomy kirurgisk procedure og postoperativ pleje i mandlige Sprague-Dawley rotter. Kort, dyret er bedøvede og brystet er åbnet. Når venstre lungepulsåren, pulmonal vene og bronkier er visualiseret, de er forbundet, og den venstre lunge er fjernet. Brystet så lukket og dyret inddrevet. Blod er tvunget til at cirkulere kun på højre lunge. Denne øgede blodkartryk fører til en progressiv remodellering og okklusion af små pulmonale arterier. Den anden ramt af MCT eller Sugen er brugt en uge efter operationen til at fremkalde endotel dysfunktion. Kombinationen af øget blodgennemstrømning i lungerne og endotel dysfunktion producerer svær PAH. Den primære begrænsning af denne procedure er, at det kræver generelle kirurgiske færdigheder.
Introduction
Pulmonal arteriel hypertension (PAH) er en progressiv og dødelig sygdom karakteriseret ved en stigning i pulmonal blodgennemstrømning, øget vaskulær resistance, betændelse og ombygning af lille pulmonal blodkar1. Denne remodeling normalt resulterer i vaskulære læsioner, der hindrer og udslette lille pulmonal arterier, forårsager vasokonstriktion og øge højre hjertekammer afterload2. Få succesfulde farmakologiske behandlinger af PAH findes; som en konsekvens, PAH-relaterede dødelighed er fortsat høje. For nylig, fokus på forskning i pathobiology af pulmonal hypertension er flyttet mod en mekanisme for angio-spredning, hvor rollen som øget pulmonal blodgennemstrømning er betragtes som en vigtig udløser i udvikling af pulmonal vaskulær remodeling3,4.
Dyremodeller for pulmonal hypertension har givet kritiske indsigter, der hjælper med at forklare Patofysiologi af sygdommen og har tjent som platform for narkotika, celle, gen og protein levering. Traditionelt, har kronisk hypoxi-induceret pulmonal hypertension model og MCT lunge skade model været de vigtigste modeller bruges til at undersøge PAH Patofysiologi5. De er imidlertid ikke tilstrækkelig til at medføre øget pulmonal blod flow og neointimal mønster af remodeling i forhold til ændringer beskrevet i menneskelige patienter. Kronisk hypoxi model i gnavere resultater i fortykkelse af fartøj vægge med hypoxisk vasokonstriktion uden angio-udslettelse af små pulmonal fartøjer6. Derudover er hypoxi betingelse reversibel. Således, iltsvind modellen er heller ikke tilstrækkelig til at medføre svær PAH. MCT lunge skade model fremkalde nogle endotel dysfunktion men de komplekse vaskulær obliterative læsioner fundet hos mennesker med svær primær PAH udvikler ikke i rotter2. Derudover MCT-behandlede rotter har tendens til at dø fra MCT-induceret lunge toksicitet, veno-okklusiv sygdom og Myokarditis ikke fra PAH2. Endelig er pneumonectomy alene ikke tilstrækkelig til at frembringe neointimal læsioner i de lille pulmonal fartøjer i en kort periode. Efter pneumonectomy er der minimal elevation i pulmonal arteriel pres7. Hos mennesker tåles pneumonectomy godt når de kontralaterale lunge er sund7.
Dog er proceduren venstre pneumonectomy kombineret med MCT eller Sugen fordelagtigt, da det efterligner øget pulmonal blodgennemstrømningen og medfører pulmonal vaskulær remodeling sammenlignes med alvorlige kliniske PAH. Pneumonectomy er udført på den venstre lunge, som har kun 1 lap, i stedet for til højre, som har fire kamre. Hvis højre lunge blev fjernet, ville dyr kunne kompensere for den respiratorisk insufficiens. I modellens pneumonectomy-MCT neointimal mønster af remodeling udvikler sig i mere end 90% af drives-dyr behandlet7. Ligeledes, kombinationen af Sugen og pneumonectomy resultater i svær PAH, karakteriseret ved angio-obliterative vaskulære læsioner, spredning, apoptose og RV dysfunktion8. Den venstre pneumonectomy procedure er også fordelagtigt i forhold til andre kirurgiske procedurer til at fremkalde PAH. Tidligere omfatter beskrevne modeller i rotter at øge pulmonal blodtilførslen til lungerne aorto-caval shunt eller subclavia-pulmonal arterie anastomose. Disse modeller er ekstremt kompliceret7,9,10,11. Hvis du vil udføre en aorto-caval shunt, har dyrets maven åbnes. Shunt placeres i den abdominale aorta, hvilket øger blodtilførslen til alle abdominale organer i stedet for blot i lungerne, således PAH tager meget længere tid at udvikle. Desuden er det vanskeligt at bestemme blodgennemstrømningen gennem shunt, der henviser til, at med pneumonectomy blodgennemstrømningen til de resterende lunge fordobler. Subclavia-pulmonal arterie anastomose har også mange komplikationer. Strømmen af arterielt blod i venen kan føre til trombose af anastomose og blødning. Ligesom aorto-caval shunt er det vanskeligt at bestemme blodgennemstrømningen gennem anastomose. Derudover er det en bekostelig og vanskelig teknik, der kræver vaskulære kirurgiske færdigheder. Den ensidige venstre pneumonectomy fordobler blodgennemstrømningen og shear stress i de kontralaterale lunge og i kombination med MCT eller Sugen, forårsager de typiske hæmodynamiske og histopatologiske fund af PAH, som er endotel celle skader8, 12.
Nyhed i dette håndskrift er præsenteret i den meget detaljerede og omfattende kirurgisk protokol af den venstre pneumonectomy i rotter og diskussion af de tekniske og fysiologiske udfordringer i disse modeller. Fordi denne protokol ikke er længere tilgængelig, mener mange efterforskere modellen er alt for svært brug. Efterforskere, der har udført den venstre pneumonectomy har haft høj dødelighed og sygelighed priser forbundet med de unødvendige tab af dyr, gå på kompromis med videnskabelig vurdering. I stedet, vil mange bruge klassiske modeller såsom MCT injektion, kronisk hypoxi eller bare pneumonectomy til at oprette PAH. Disse modeller er dog langt mindre effektiv end kombinationen af MCT eller Sugen med den venstre pneumonectomy. Det primære formål med denne artikel er at orientere den første detaljerede og reproducerbare kirurgisk protokol for den venstre ensidige pneumonectomy i rotter og give den bedste kirurgiske model af PAH. Kombinere denne protokol til venstre ensidige pneumonectomy med MCT eller SU5416 vil tillade efterforskere at skabe en langt mere effektiv og klinisk relevante model svær PAH at studere patogenesen af denne dødelige sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedurer, der er beskrevet nedenfor er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Icahn School of Medicine på Mount Sinai. Alle rotter modtaget Human pleje i overensstemmelse med Mount Sinai "Vejledning i pleje og brugen af forsøgsdyr".
1. forberedelse til operation
- Autoklave Cooley-Mayo buet saks (store saks), straight Iris saks (lille saks), McPherson-markriyor Iris saks (tilbage saks), Wangensteen væv pincet (atraumatisk pincet), Gerald væv pincet, almindelig wire speculum (selvstændig fastholde retractoren), lille skib cauterizer, gaze, dobbelt-ended sonde, tynd vaskulær nål indehaveren og mikro-Jacobson myg hæmostatisk pincet (myg).
2. forberedelse og Intubation af rotter
- Administrere en subkutan injektion af buprenorphin analgesi (0,1 mg/kg) i 6-8 uge gamle mand, Sprague-Dawley rotter, 30 min før operation.
- Placere rotten individuelt i et kammer udsat for isofluran 4% og ilt (1 L/min) i 3-4 min. indtil rotten er korrekt bedøvede (dvs., bevidstløs, vejrtrækning langsomt, og ikke reagerer på røre eller lyd).
-
Intubation af rotter
- Fjerne rotten fra salen og tape rotte til et bord, så rotten ligger fladt på ryggen, med munden på kanten af brættet. Bruge strengen til at holde rotten af to fortænderne, så halsen er stadig flad/straight.
- Placer en fiber optic gås lyskilde over halsen over strubehovedet, løft og holde tungen med fingre og flytte strubelåget at visualisere stemmebånd. Luftrør bør være smukt tændt bag stemmebånd; justere placeringen af lyset, indtil luftrøret er lyse.
- Intubate rotter ved at indsætte en 16 G kateter i strubehovedet inden for 60 s for at fjerne rotten fra salen, da de vågner hurtigt. Hvis rotten vågner før vellykket intubation, sætte rotten tilbage og Gentag.
- Straks forbinde rotten til ventilator til at genoptage isofluran og ilt levering. Bekræfte intubation ved hjælp af en kold spejl til at observere kondensering af fugtighed i den udåndede ånde fra kateteret. Sørg for dyret er stadig vejrtrækning ved udvidelse af brystet.
- Tilsluttes ventilator rotten. Indstil ilt til at flyde på 1 L/min. Indstil ventilation hastigheden til 70 vejrtrækninger/min med en tidalvolumen af 0,35-0,45 mL. Angiv positive ende udåndingstrykket (PIP) til 2-4 cm H2O. Reducer isofluran til 2-3%.
- Placere rotten under mikroskop i den rigtige decubitus holdning på en varmepude på 37 ° C. Tape forbenene ned. Barbere den venstre brystkasse bag det forreste ben indtil udgangen af brystkassen med neglesaks. Rense den kirurgisk område med gaze og 10% povidon-jodopløsning, efterfulgt af 70% ethanol (tre gange).
- Placer pulsoximeter rottens fods og overvåge puls og iltmætning i hele operationen. Pulsen skal være mellem 200-500 bpm og oxygen mætning skal være > 95%.
3. forberedelse af Sterile omgivelser
- Visualisere den kirurgisk område under mikroskop. Dette skal gøres først, fordi mikroskopet ikke kan justeres, når miljøet er sterile.
- Sætte på sterile, kirurgiske handsker. Rør ikke ved noget udover de steriliserede instrumenter, de kirurgiske draperier og den kirurgisk område af rottens krop.
- Sted en steril drapere over rottens krop og på bakken instrument til at skabe et sterilt miljø.
- Sterile handsker, placere sterile instrumenter på bakken sterile instrument.
4. venstre Pneumonectomy kirurgisk Procedure
- Brug Cooley-Mayo saks og Gerald væv pincet til at skære en lille hul i den kirurgiske drapere. Hullet bør være omkring 2-3 cm i diameter til fuldt visualisere snit, men ikke for stor så at kun steriliseret hud er udsat.
- Gøre en 2 cm lange laterale indsnit i den venstre brystkasse ved hjælp af en kirurgiske kniv. Bruge gaze og Elektrokauterisation pen til at styre blødning og vedligeholde hæmostase. Brug Cooley-Mayo saks til at klippe hvert lag af væv indtil ribben og interkostale muskulatur er udsat.
-
Indtastning interkostale rum
- Brug myg til at lave et hul gennem muskel i den tredje interkostale rum.
- Bruge dobbelt-ended sonden flytte lunge ud af den måde at visualisere lungepulsåren. Investigator kan angive en anden interkostale rum, hvis lungepulsåren ikke er tilgængelig.
- Brug iris saks og McPherson-markriyor iris saks (tilbage saks) til at åbne de mellemsiddende muskler til omkring 1-2 cm. bruger Elektrokauterisation pen til at standse eventuelle blødninger.
- Placer en lille, selvstændig fastholde retractor at holde ribbenene og muskler åbne.
- Åbn kun venstre brysthinden og flytte den venstre lunge ned nederst i maven til at give adgang til lungepulsåren og bronkier. Indlæse en medium hemoclip i den ligating klip applikator.
-
Ligatur af venstre vigtigste Bronkie og venstre vigtigste lungepulsåren
- Løft den øverste del af venstre lunge omhyggeligt med Wangensteen atraumatisk pincet til at eksponere lungepulsåren.
- Klip lungepulsåren ved lukning af klip og applikator omkring arterie. Vær omhyggelig med ikke at lukke eller brud i venstre azygos vene. Klemme ikke alt for kraftigt ellers, fartøjet kan briste.
- Åbne snittet yderligere ved hjælp af tonsil for at adskille muskelfibre.
- Indlæse et andet medium hemoclip i den ligating klip applikator, så de er klar.
- Brug atraumatisk pincet til at løfte den nederste del af lungen ud af snittet indtil venstre vigtigste Bronkie og venstre pulmonal vene er visualiseret. Atraumatisk pincet skal bruges træk for at flytte lungen op og ud af snittet. Da lungerne er for store til at blive trukket i en bevægelse uden at rive væv, er spørgsmålet pincet nødvendige for at holde den lunge på plads, mens atraumatisk pincet bruges forsigtigt at trække flere lunge.
- Ligate venstre vigtigste Bronkie og venstre vigtigste pulmonal vene sammen ved at lukke applikator omkring dem. Klemme ikke vene og bronkier for kraftigt ellers, fartøjet kan briste.
- Fjerne lungen med saks. Vær omhyggelig med ikke at klippe eller rive ud af klippet. Bruge et lille stykke af steril gaze til at absorbere enhver blod og sørg for der er ingen blødning.
-
Lukning af ribben og interkostale muskulatur
- Før du lukker den interkostale muskulatur, indsætte et 16 G kateter i brysthulen fra den kirurgiske indsnit og ind i det syvende interkostale rum. Sørg for investigator kan visualisere nål så ikke at punktere enhver vitale organer eller fartøjer.
- Straks at fjerne nålen, forlader kateteret på plads. Dette vil blive brugt som en bryst tube.
- Luk ribben og mellemsiddende muskler med en 4-0 prolene sutur.
- Lukke huden og det subkutane rum med en løbende 5-0 sutur (Tabel af materialer).
- Sted en 5-0 sutur (Table of Materials) ind i huden og omkring brystet tube så når brystet tube er fjernet, hullet vil være bundet lukket.
- Evakuere luften fra den pleural hulrum med en 3 mL sprøjten gennem kateteret til at genvinde det normale undertryk i brystkassen. Straks klemme kateteret med en nål holder at forhindre luft i at gå tilbage i brysthulen. Hurtigt at fjerne kateteret og binde sutur for at lukke hullet.
5. postoperative genopretning
- Placere dyret i brystbenet holdning. Slukke for isofluran, men fortsætte med at give den rotte ilt via endotrakealtube. Efterlad ikke dyret uden opsyn på ethvert tidspunkt indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at ambulate og dyret er sikkert i sit bur.
- Administrere 2-3 mL sterilt laktat Ringers løsning subkutant.
- Overvåge puls (≈200 – 500 bpm), iltmætning (≥95%), og dyr farve at bekræfte dyret vejrtrækning godt.
- Når dyret begynder at foretage spontan vejrtrækning bevægelser og hals bevægelser og reagerer på fysiske stimuli (såsom øjne udvidelse, næse bevæger sig, og ører reagerer på lyd), extubate dyret ved at trække kateteret og afbryde ventilator.
- Returnere dyret til et tomt bur, fra selskab med andre dyr. Dyret skal være alene i mindst 3 dage.
- For smerter kontrol, administrere 0,1 mg/kg af buprenorphin subkutant hver 12 timer til 3 dage.
6. administration af "Anden Hit" MCT eller Sugen
- Administrere 1 mL af MCT (60 mg/kg) eller 1 mL af Sugen (25 mg/kg) via subkutan injektion, 1 uge efter operationen.
7. terminal høst
- Syv uger efter MCT eller Sugen administration, placere dyret i et kammer med flydende ilt (1 L/min) og 4% isofluran.
- Tilslut dyret til ventilator via næsen kegle. Holde ilt flyder og sænke isofluran til 2,5-3%. Lå dyret på hans ryg og tape ned alle lemmer.
- Barbere dyr langs hele underlivet.
-
Åbner brystet
- Gøre et snit ned brystet med en skalpel fra subclavia hak til xyphoid.
- Bruge væv pincet til at holde xyphoid. Skære gennem brystbenet med Cooley-Mayo saks indtil hjertet og lungepulsåren er fuldt tilgængelige. Bruge Elektrokauterisation for at stoppe blødningen. Holde ribbenene åbne med en retractor.
- Identificere lungepulsåren. Justere retningen af hjertet, hvis det er nødvendigt, ved at tilføje gaze nedenunder. Bruge en 20 G IV kateter for at punktere lungepulsåren mellem det pulmonale ventilen og tvedeling af den vigtigste lungepulsåren. Forhånd kun 20 G kateteret ind i arterien og fjerne nålen. Rykke 1,2 Fr transonic pres kateteret ind i IV kateter, der er i lungepulsåren. Når PA kurven er støt, optage presset for mindst 10 s. Gentag disse trin for at registrere trykket i højre hjertekammer.
- Fjern hjertet og lungerne. Læg stykker af lungen i formalin til fastsættes i paraffin og farves med hæmatoxylin og eosin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ifølge den accepterede klassifikationssystem, er pulmonal hypertension karakteriseret ved en middelværdi lungepulsåren pres (mPAP) overstiger de øvre grænser for normale lungepulsåren pres (dvs., 25 mm Hg). Pneumonectomy + MCT gruppe udviklet svær PAH dag 21 med en forøget mPAP (figur 1). MPAP beregnes ved formlen:
Systoliske og diastoliske RV og PA pres og blev målt med pres kateter i de vigtigste lungepulsåren tilsluttet fordel solcelleanlæg. De gennemsnitlige pulmonal arteriel pres (mPAP) blev beregnet ved hjælp af formlen ovenfor. I kontrolgruppen (n = 20), PA middeltryk var 18.6±1.76 mm Hg (figur 1). I pneumonectomy + MCT gruppen (n = 30), mPAP øget 2,25 gange mere sammenlignet med kontrolgruppen (41.9±2.89 mm Hg) (figur 1). I pneumonectomy + Sugen gruppen (n = 30), mPAP var tre gange højere end i kontrolgruppen (53±6.60 mm Hg). I både MCT og Sugen grupper, blev RVSP meget højere sammenlignet med kontrolgruppen (figur 1).
Histopatologisk undersøgelse af rotte lungevæv blev udført ved hjælp af hæmatoxylin og eosin pletter efterfulgt af imaging med en optisk lysmikroskop. I den normale lunge, der er ikke plads mellem alveolerne og alveolær strukturer er tilsyneladende. Fartøjerne, der er klar og af normal tykkelse (figur 2A). PAH lunge er der tegn på remodeling, fortykkelse af fartøj vægge, svær forsnævring af fartøjer, inflammation og fokale pulmonal arteritis (figur 2B, C).
Figur 1: svær pulmonal arteriel hypertension i den venstre pneumonectomy kombineret med MCT model. Betydelige forskelle i mPAP og RVSP mellem kontrolgruppen og pneumonectomy + MCT gruppen og kontrolgruppen og pneumonectomy + Sugen gruppe. Data præsenteres som betyder SEM. P-værdier blev beregnet ved hjælp af en en-vejs ANOVA og Tukey post hoc test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative mikrofotografier af H & E farvning af lungevæv. (A) Normal lungevæv. I normal rotte lunge, arterier (rød pil) er åbne og fartøj vægge er normal størrelse. (B) patologiske vaskulære remodeling i pulmonal arteriel hypertension rotter behandlet med pneumonectomy og MCT. Lungerne viser fokale pulmonal arteritis og betændelse, koncentriske mediale fortykkelse af fartøj vægge (hvid pil) og koncentrisk intima fortykkelse af fartøj vægge (sort pil), resulterer i alvorlig grad trange fartøjer. (C) patologiske vaskulære remodeling i PAH rotter behandlet med pneumonectomy og Sugen. Disse lungerne viser også fokale pulmonal arteritis og betændelse, koncentriske mediale fortykkelse af fartøj vægge (hvid pil) og koncentrisk intima fortykkelse af fartøj vægge (sort pil). Lumen af disse fartøjer er alvorligt trange og/eller helt lukket. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I PAH-ramte lunger, vaskulære spredning med neointimal dannelse og udslettelse af de pulmonale arterier kan resultere i alvorlige hæmodynamiske ændringer, højre ventrikel svigt og tidlig dødelighed7,8. Ændringer til fartøj vægge øge modstanden mod blodgennemstrømningen, øge arteriel og højre ventrikel trykket. I de tidlige stadier af PAH udviklede normalt 3 uger efter administration af MCT eller Sugen, rotter uspecifik histologiske ændringer som mediale hypertrofi, adventitial fortykkelse og muscularization af de små arterier og arterioler. Disse ændringer er potentielt reversible. I de senere faser, cirka 6-8 uger efter administration af MCT eller Sugen, rottens lungerne har neointimal og plexiform vasculopathy, der hindrer og udslette mellemstore og små pulmonale arterier og arterioler, cellulære intima spredning, og koncentrisk intima fibrose. Plexiform læsioner består normalt af en plexus af kanaler foret af endothelceller og myofibroblasts. I mange tilfælde, disse ændringer er forbundet med interstitiel ødem og fibrose, tromboemboliske obstruktion af distale lille pulmonal arterier, delvis recanalization af en thrombosed muskulære skibe, og fibrinoid nekrose12.
Som nævnt tidligere, udvikler rotter i andre PAH modeller ikke vaskulær udslettelse af de små fartøjer, neointimal og plexiform læsioner og høj PA og RV pres. Behandling med kronisk hypoxi PAH model blev fundet til at producere nogle fortykkelse af fartøjer, men fartøjerne forbliver åben og der er ingen vaskulær obliterative læsioner og lille inflammation5. RVSP og mPAP værdierne er let forhøjede sammenlignet for at styre5. Tilsvarende resulterede behandling med enten MCT eller pneumonectomy i pulmonal arteriel pres, der ikke var betydeligt højere end kontrol rotter og lidt ombygget fartøjer7,9.
Derimod fandt vi, at den venstre pneumonectomy kombineret med MCT eller Sugen er en effektiv model for at oprette svær PAH. Sammenlignet med kontrolgruppen, fordoblet den gennemsnitlige pulmonal arteriel pres (mPAP) og den højre ventrikel systolisk blodtryk (RVSP) i rotter med svær PAH næsten (figur 1). Derudover udviklede disse rotter plexiform læsioner, koncentriske mediale og intima fortykkelse, tromboemboliske obstruktion af distale lille pulmonal arterier, betændelse, og meget forhøjet lungepulsåren og højre ventrikel trykket (figur 2 ). I forhold til kronisk hypoxi, MCT injektion og pneumonectomy eneste modeller af PAH udført i andre undersøgelser, skaber pneumonectomy kombineret med MCT eller Sugen model en klinisk relevante tilstand. Endvidere, denne model, hvis det udføres korrekt, har en næsten 0% intra-operative dødelighed og kun en 10% dødelighed sats efter genopretning fra svigt af højre lunge at kompensere respiratorisk insufficiens. Højere satser for enten intra-operative eller post-opsving dødelighed er normalt vejledende at menneskelige eller udstyr fejl har fundet sted.
For at kunne udføre den venstre pneumonectomy og skabe PAH, er der flere vigtige skridt i denne protokol, der skal færdiggøres. Først, er det meget vigtigt at overvåge dyrets iltmætning, capnography, og tælle puls under hele proceduren at sikre dyret vejrtrækning og hans hjerte slår. Overvågning iltmætning yderligere bekræfter korrekt endotracheal intubation. Intubere dyret er absolut nødvendige for denne procedure. Når dyrets brysthulen er åbnet, er undertryk, der normalt findes i brysthulen flyttet til atmosfærisk overtryk. Rotter skal derfor, forsynes med overtryk via kunstig ventilation. Uden ordentlig intubation, vil dyrets lungerne kollapse fra den positive atmosfærisk tryk.
Den kirurgiske indsnit er blevet gjort lateralt eller posterolaterally og i det tredje interkostale rum. Afhængigt af rottens anatomi, kan kirurgen have til at åbne et andet interkostale rum for at få adgang til lungerne og visualisere fartøjerne. Ved hjælp af andre metoder vil gøre det meget vanskeligt at nå den venstre lungepulsåren. Når du åbner brysthulen, er det meget vigtigt at bruge en Elektrokauterisation pen til at stoppe blødninger fra hud, muskler, og de omkringliggende fartøjer. Hvis investigator springer dette trin, dyret mister blod og mindre ilt vil cirkulere. Snittet skal være mindst 2 cm lange, så der er plads nok til at tegne hele lungen, når ligating. Ellers vil investigator rive væv, når de forsøger at fjerne lungen fra en lille åbning. Det er også vigtigt at bruge atraumatisk pincet når du flytter lungen for at undgå brud i vævet og hemorrhaging. Lungepulsåren lukkes først for at undgå blødning fra manipulation af lungerne. Investigator skal være meget forsigtig, når ligating fartøjer for at undgå lukning de venstre azygos vene eller rive fartøjerne, der ellers, dyret vil dø. Desuden er det meget lettere for kirurgen at bruge titanium hemoclips snarere end suturer at ligate venstre lungepulsåren, venstre vigtigste Bronkie, og venstre pulmonal venerne med en sutur. Fordi investigator skal gøre en forholdsvis lange snit i den interkostale rum, er det nødvendigt at lukke de mellemsiddende muskler og ribben med suturer. Når brystet er lukket, luft skal evakueres fra brystet til at gendanne undertryk og det er vigtigt at forhindre kontralaterale lunge og hjerte forvrængning med en lukket pneumothorax.
Endelig er recovery et af de mest afgørende skridt efter den rotte pneumonectomy. En torakotomi er anset for en meget smertefuld kirurgi og analgetika er afgørende for at fremme tilstrækkelig ventilation, forbedre lunge udflugter i den postoperative periode og mindske smerter. Rotter skal inddrives i brystbenet holdning at maksimere lunge inflation. Efter 10 min, kan investigator mindske ventilation sats for at hjælpe med at stimulere dyret for at puste på sine egne og vågne op. Hvis dyret bliver cyanotisk og oxygen mætning niveauet falder, er det nødvendigt at øge ilt, ventilation sats, og øge tidalvolumen til 5 mL eller mere afhængigt af ventilator kapacitet. Extubation af rotter skal ske så sent som muligt, når dyret er helt vågen. Investigator kan sætte extubated rotte i et kammer med bare flydende ilt til yderligere støtte genopretning.
Hvis teknikken er udført korrekt, og de ovennævnte overvejelser behandles udfører en venstre ensidige pneumonectomy kombineret med MCT eller Sugen skaber en pålidelig model svær PAH end MCT alene, hypoxi eller andre metoder. Når pneumonectomy udføres korrekt, dyret overlever, proceduren, der har en kort varighed (15-30 min) og investigator behøver ikke bestemt vaskulære kirurgiske færdigheder. Derudover er investigator købedygtig med held oprette PAH. Begrænsningerne ved denne metode er at en torakotomi er en invasiv procedure, endotracheal intubation er påkrævet, og investigator behøver nogle generelle kirurgiske færdigheder. Neointimal pulmonal vaskulær okklusiv læsioner og de udtalte stigninger i lungepulsåren pres svarende til menneskelige pulmonal hypertension patienter er tydelig i rotter efter en kombination af pneumonectomy med MCT eller SU5416 injektion7 , 8 , 9. den nuværende model er en pålidelig metode til at studere rollen af pulmonal overløb i de kontralaterale lunge og flow-induceret pulmonal hypertension.
Denne protokol kan være nyttige til at studere andre sygdomme. Det er muligt at bruge denne model til at studere den kompenserende væksten af lunge væv i de kontralaterale lunge. Denne teknik kan også bruges til at studere og udvikle behandlinger for højre ventrikel svigt (RVF). Svær højre ventrikel hypertrofi udvikler i dyr, der udvikler neointimal læsioner fra øget arterielt Tryk7. RVF forårsager død i omkring 70% af patienter med PAH13. Stigende pulmonal blodgennemstrømning kan være nyttigt for at studere og udvikle behandlinger for patienter, der lider af medfødt hjerte sygdomme samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette håndskrift blev støttet af NIH give 7R01 HL083078-10 tilskud fra American Heart Association AHA-17SDG33370112 og fra de nationale institutter for Health NIH K01 HL135474 til Y.S. og fra de nationale institutter sundhed R01 HL133554 til L.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
References
- Leopold, J., Maron, B. Molecular Mechanisms of Pulmonary Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 761 (2016).
- Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L363-L369 (2012).
- van Albada, M. E., et al. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. European Respiratory Journal. 26 (3), 487-493 (2005).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A. J., Berger, R. M. F. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: lessons from preclinical animal models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (6), L1013-L1032 (2009).
- Cahill, E., et al. The pathophysiological basis of chronic hypoxic pulmonary hypertension in the mouse: vasoconstrictor and structural mechanisms contribute equally. Experimental Physiology. 97 (6), 796-806 (2012).
- Okada, K., et al. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. American Journal of Pathology. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- Happé, C. M., et al. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Tanaka, Y., Schuster, D. P., Davis, E. C., Patterson, G. A., Botney, M. D. The role of vascular injury and hemodynamics in rat pulmonary artery remodeling. Journal of Clinical Investigation. 98 (2), 434-442 (1996).
- Nishimura, T., Faul, J. L., Berry, G. J., Kao, P. N., Pearl, R. G. Effect of a surgical aortocaval fistula on monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Critical Care Medicine. 31 (4), 1213-1218 (2003).
- Linardi, D., et al. Ventricular and pulmonary vascular remodeling induced by pulmonary overflow in a chronic model of pretricuspid shunt. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (6), 2609-2617 (2014).
- White, R. J., et al. Plexiform-like lesions and increased tissue factor expression in a rat model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L583-L590 (2007).
- Samson, N., Paulin, R. Epigenetics, inflammation and metabolism in right heart failure associated with pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (3), 572-587 (2017).
