Summary
Il roditore pneumonectomy di sinistra è una tecnica importante nella ricerca di ipertensione polmonare. Qui, presentiamo un protocollo per descrivere la procedura di pneumonectomia di ratto e cura post-operatoria per garantire la mortalità e la morbosità minima.
Abstract
In questo protocollo, abbiamo dettaglio i passaggi procedurali corrette e le precauzioni necessarie per correttamente eseguire una pneumonectomia sinistra e indurre PAH in ratti con la somministrazione ulteriore di monocrotaline (MCT) o SU5416 (Sugen). Abbiamo anche confrontare questi due modelli per altri modelli PAH comunemente usati nella ricerca. Negli ultimi anni, lo stato attivo di modelli animali di PAH ha spostato verso lo studio del meccanismo di angioproliferation di lesioni plexiform, in cui il ruolo di flusso sanguigno polmonare aumentato è considerato come un importante trigger nello sviluppo di severa polmonare rimodellamento vascolare. Uno dei modelli più promettenti del roditore di flusso polmonare aumentato è il pneumonectomy di sinistra unilaterale combinato con un "secondo colpo" di MCT o Sugen. La rimozione del polmone di sinistra conduce a flusso sanguigno polmonare aumentato e turbolento e rimodellamento vascolare. Attualmente, non esiste alcuna procedura dettagliata della chirurgia pneumonectomia in ratti. Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo passo-passo della procedura chirurgica pneumonectomia e cure post-operatorie in ratti Sprague-Dawley maschi. Brevemente, l'animale è anestetizzato e viene aperto il torace. Una volta che l'arteria polmonare di sinistra, della vena polmonare e Bronco sono visualizzati, cui sono legati e il polmone di sinistra è stato rimosso. Quindi chiuso il petto e l'animale recuperato. Il sangue è costretto a circolare solo sul polmone di destra. Questo aumento della pressione vascolare conduce ad un progressivo rimodellamento ed occlusione delle piccole arterie polmonari. Il secondo colpo di MCT o Sugen è usata una settimana dopo l'intervento per indurre disfunzione endoteliale. La combinazione di aumento del flusso sanguigno nel polmone e nella disfunzione endoteliale produce gravi PAH. Il limite principale di questa procedura è che richiede abilità chirurgiche generali.
Introduction
Ipertensione arteriosa polmonare (PAH) è una malattia progressiva e fatale, caratterizzata da un aumento nel flusso sanguigno polmonare, aumento della resistenza vascolare, l'infiammazione ed il ritocco di piccoli vasi sanguigni polmonari1. Questo rimodellamento solitamente provoca lesioni vascolari che ostacolano e cancellare piccole arterie polmonari, provocando vasocostrizione e aumento di postcarico ventricolo di destra2. Esistono pochi riusciti trattamenti farmacologici di IPA; di conseguenza, rimane elevato di mortalità correlata al PAH. Recentemente, il fuoco della ricerca il pathobiology di ipertensione polmonare si è spostato verso un meccanismo di angio-proliferazione in cui il ruolo di flusso sanguigno polmonare aumentato è considerato come un importante trigger nello sviluppo di polmonare vascolare rimodellamento3,4.
Modelli animali di ipertensione polmonare hanno fornito le comprensioni critiche che aiutano a spiegare la patofisiologia della malattia e hanno servito come una piattaforma per droga, cella, gene e la proteina consegna. Tradizionalmente, il modello di ipertensione polmonare indotta da ipossia cronica e il modello di lesione polmonare MCT sono stati i modelli principali usati per studiare la patofisiologia PAH5. Tuttavia, essi non sono sufficienti per produrre pattern di flusso e neointimale sanguigno polmonare aumentato del rimodellamento rispetto ad alterazioni descritte in pazienti umani. Il modello di ipossia cronica nei roditori provoca ispessimento delle pareti del vaso con vasocostrizione ipossica senza angio-obliterazione dei vasi polmonari piccolo6. Inoltre, la condizione di ipossia è reversibile. Così, il modello di ipossia non è anche sufficiente a produrre gravi PAH. Il modello di lesione polmonare MCT suscitare qualche disfunzione endoteliale, ma le lesioni obliterative vascolari complesse trovate in esseri umani con PAH primario severo non si sviluppano in ratti2. Inoltre, ratti trattati con MCT tendono a morire da tossicità MCT-indotta del polmone, malattia veno-occlusiva del fegato e miocardite anziché da PAH2. Infine, la pneumonectomia da sola non è sufficiente a produrre lesioni neointimale nei piccoli vasi polmonari in un breve periodo di tempo. Dopo pneumonectomia, c'è la minima elevazione nella pressione arteriosa polmonare7. In esseri umani, la pneumonectomia è ben tollerato se il polmone controlaterale è sano7.
Tuttavia, la procedura di pneumonectomia sinistra combinata con MCT o Sugen è vantaggiosa poiché imita flusso sanguigno polmonare aumentato e risultati nel rimodellamento vascolare polmonare paragonabile a PAH clinico severo. La pneumonectomia è effettuata sul polmone di sinistra, che ha solo 1 lobo, piuttosto che sulla destra, che ha quattro lobi. Se il polmone di destra è stato rimosso, è possibile che l'animale sarebbe in grado di compensare l'insufficienza respiratoria. Nel modello di pneumonectomia-MCT neointimale modello di rimodellamento si sviluppa in oltre il 90% di animali operati trattati7. Allo stesso modo, la combinazione di risultati Sugen e pneumonectomia in PAH severa, caratterizzata da lesioni vascolari angio-obliterative, proliferazione, apoptosi e RV disfunzione8. La procedura di pneumonectomy di sinistra è anche vantaggiosa rispetto ad altre procedure chirurgiche per indurre PAH. In precedenza modelli descritti nei ratti per aumentare il flusso sanguigno polmonare ai polmoni includono dello shunt aorto-caval o anastomosi dell'arteria succlavia-polmonare. Questi modelli sono estremamente complicati7,9,10,11. Per eseguire uno shunt aorto-cavale, addome dell'animale deve essere aperto. Lo shunt è posizionato nell'aorta addominale, che aumenta il flusso di sangue a tutti gli organi addominali invece solo i polmoni, quindi, PAH richiede molto più tempo per sviluppare. Inoltre, è difficile determinare il flusso di sangue attraverso lo shunt, considerando che con la pneumonectomia il flusso di sangue per le rimanenti doppie del polmone. L'anastomosi dell'arteria succlavia-polmonare ha anche molte complicazioni. Il flusso di sangue arterioso nella vena può condurre a trombosi di anastomosi e sanguinamento. Come lo shunt aorto-cavale, è difficile determinare il flusso di sangue attraverso l'anastomosi. Inoltre, è una tecnica costosa e difficile che richiede abilità chirurgiche vascolari. Il pneumonectomy di sinistra unilaterale raddoppia il flusso sanguigno e la sollecitazione di taglio nel polmone controlaterale e, in combinazione con MCT o Sugen, provoca i risultati emodinamici ed istopatologici tipici di PAH che è di danno delle cellule endoteliali8, 12.
La novità di questo manoscritto è presentata nel protocollo chirurgico molto dettagliato ed esauriente del pneumonectomy di sinistra nel ratto e nella discussione delle sfide tecniche e fisiologiche di questi modelli. Perché questo protocollo non è attualmente disponibile, molti ricercatori credono che il modello è troppo difficile uso. Gli investigatori che si sono esibiti il pneumonectomy di sinistra hanno affrontato alta mortalità e tassi di morbosità connessi con l'inutile perdita di animali, compromettere la valutazione scientifica. Invece, molti utilizzerà modelli classici come MCT iniezione, ipossia cronica o appena la pneumonectomia per creare PAH. Tuttavia, questi modelli sono molto meno efficaci che la combinazione di MCT o Sugen con il pneumonectomy di sinistra. Lo scopo primario di questo articolo è di fornire il protocollo chirurgico prima dettagliato e riproducibile per la pneumonectomia sinistra unilaterale in ratti e fornire il migliore modello chirurgico di IPA. Combinando questo protocollo per pneumonectomy unilaterale di sinistra con MCT o SU5416 permetterà ai ricercatori di creare un modello molto più efficace e clinicamente rilevante di grave IPA per studiare la patogenesi di questa malattia mortale.
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Protocol
Le procedure descritte di seguito sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della scuola di medicina Icahn sul Monte Sinai. Tutti i ratti hanno ricevuto assistenza umana in conformità con il Monte Sinai "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio".
1. preparazione per la chirurgia
- Autoclave Cooley-Mayo curvo: le forbici (grande), forbici Iris rette (piccole forbici), McPherson-Allerød Iris: le forbici (posteriore), Wangensteen tessuto forcipe (pinza atraumatica), pinze di Gerald, speculum filo normale (autoritenuta Retrattore), cauterizzatore piccolo vascello, garza, doppia sonda, vascolari sottili aghi e pinze emostatiche zanzara di Micro-Jacobson (zanzara).
2. preparazione e intubazione dei ratti
- Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina analgesia (0,1 mg/kg) in ratti Sprague-Dawley maschi, di 6 – 8 settimane vecchio, 30 min prima della chirurgia.
- Posizionare il ratto singolarmente in una camera esposta a isoflurano 4% e ossigeno (1 L/min) per 3 – 4 minuti fino a quando il ratto è adeguatamente anestetizzato (cioè, inconscio, respirare lentamente e non risponde al tocco o suono).
-
Intubazione di ratti
- Rimuovere il ratto dalla camera e nastro il topo a una tavola così il ratto adagiata sul dorso, con la bocca al bordo del bordo. Utilizzare stringa per contenere il ratto dai due denti davanti in modo che il collo rimane piatto/dritto.
- Posizionare una sorgente luminosa di fibra ottica oca sopra il collo sopra la laringe, sollevare e tenere la lingua con le dita e spostare l'epiglottide fino a visualizzare le corde vocali. La trachea dovrebbe essere illuminata dietro le corde vocali; regolare la posizione della luce fino a quando la trachea è luminosa.
- Intubare i ratti con l'inserimento di un catetere di 16 G nella laringe entro 60 s di rimozione ratto dalla camera come si svegliano rapidamente. Se il ratto si sveglia prima intubazione riuscita, rimettere il ratto e ripetere.
- Collegare immediatamente il ratto al ventilatore per riprendere il recapito di isoflurano e ossigeno. Confermare l'intubazione usando uno specchio freddo per osservare la condensazione dell'umidità in respiro esalato dal catetere. Assicurarsi che l'animale è ancora respirazione dall'espansione del torace.
- Collegare il ratto al ventilatore. Impostare l'ossigeno al flusso a 1 L/min. impostata la frequenza di ventilazione su 70 respiri/min con un volume corrente di 0,35-0,45 mL. Impostare la pressione positiva di fine espirazione (PEEP) per 2 – 4 cm H2O. Reduce isoflurano al 2 – 3%.
- Posto il ratto sotto il microscopio in decubito destro su un rilievo di riscaldamento a 37 ° C. Le zampe anteriori del nastro verso il basso. Radere il torace di sinistra dietro la gamba anteriore fino alla fine della gabbia toracica con i clippers. Pulire l'area chirurgica con garza e 10% soluzione di povidone-iodio, seguiti da etanolo al 70% (tre volte).
- Posizionare il pulsossimetro sul piede del ratto e monitorare la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno durante l'intervento chirurgico. Frequenza cardiaca dovrebbe essere tra i 200 – 500 bpm e saturazione dell'ossigeno deve essere > 95%.
3. preparazione dell'ambiente Sterile
- Visualizzare l'area chirurgica al microscopio. Questo deve essere fatto prima perché il microscopio non può essere regolato una volta che l'ambiente è sterile.
- Indossare guanti sterili, chirurgici. Non toccate nulla oltre a strumenti sterilizzati, teli chirurgici e l'area chirurgica del corpo del ratto.
- Posizionare un telino sterile sul corpo del ratto e il ripiano di strumento per creare un ambiente sterile.
- Con guanti sterili, collocare strumenti sterili sul vassoio strumento sterile.
4. procedura chirurgica pneumonectomia sinistra
- Consente di tagliare un piccolo foro nel telo chirurgico Cooley-Mayo forbici e pinze di Gerald. Il foro deve essere circa 2 – 3 cm di diametro per visualizzare completamente l'incisione ma non troppo grande così che solo sterilizzato pelle è esposta.
- Fare un'incisione lungo laterale di 2 cm nel torace sinistro utilizzando una lama chirurgica. Utilizzare la penna elettrocauterizzazione e garza per gestire sanguinamento/mantenere l'emostasi. Utilizzare le forbici di Cooley-Mayo per tagliare ogni strato di tessuto fino a quando le costole e muscoli intercostali sono esposti.
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Inserimento spazio intercostale
- Utilizzare la zanzara per fare un buco attraverso il muscolo del terzo spazio intercostale.
- Utilizzare la sonda doppia per spostare il polmone fuori del modo di visualizzare l'arteria polmonare. Lo sperimentatore può immettere un altro spazio intercostale se l'arteria polmonare non è accessibile.
- Forbici iris uso e McPherson-Allerød iris: le forbici (posteriore) per aprire i muscoli intercostali a circa 1 – 2 cm. è possibile utilizzare la penna elettrocauterizzazione per bloccare qualsiasi emorragia.
- Posizionare un piccolo, autoritenuta riavvolgitore per contenere le costole e muscoli aprire.
- Aprire solo la pleura di sinistra e spostare il polmone di sinistra in basso nell'addome per consentire l'accesso all'arteria polmonare e Bronco. Caricare un hemoclip medio nell'applicatore clip legatura.
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Legatura del bronco principale di sinistra e dell'arteria polmonare sinistra
- Sollevare con cura la parte superiore del polmone sinistro con la pinza atraumatica Wangensteen per esporre l'arteria polmonare.
- Agganciare l'arteria polmonare chiudendo la clip e applicatore intorno all'arteria. Fare attenzione a non chiudere o rottura della vena azygos sinistra. Non stringere troppo energicamente in caso contrario, la nave può rompersi.
- Aprire l'incisione ulteriormente utilizzando la tonsilla per separare le fibre muscolari.
- Caricare un altro media hemoclip nell'applicatore clip legatura in modo che è pronto.
- Utilizzare la pinza atraumatica per sollevare la parte inferiore del polmone fuori l'incisione fino al bronco principale di sinistra e la vena polmonare di sinistra sono visualizzati. Atraumatica deve essere utilizzato tirare per spostare il polmone e fuori l'incisione. Poiché il polmone è troppo grande per essere tirato fuori in un unico movimento senza strappare il tessuto, il forcipe di problema sono necessario per tenere il polmone in posizione mentre la pinza atraumatica vengono utilizzati con attenzione per estrarre più del polmone.
- Legare insieme il bronco principale di sinistra e la vena polmonare principale sinistra chiudendo l'applicatore intorno a loro. Non stringete la vena ed il Bronco troppo energicamente altrimenti, la nave può rompersi.
- Rimuovere il polmone con le forbici. Fare attenzione a non tagliare o strappare la clip. Utilizzare un piccolo pezzo di garza sterile per assorbire qualsiasi sangue e assicurarsi che non vi è alcun sanguinamento.
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Chiusura delle costole e muscoli intercostali
- Prima di chiudere i muscoli intercostali, inserire un catetere 16g nella cavità toracica lontano l'incisione chirurgica e nel settimo spazio intercostale. Verificare che lo sperimentatore può visualizzare l'ago per non forare eventuali organi vitali o vasi.
- Rimuovere immediatamente l'ago, lasciando il catetere in posizione. Questo fungerà da un tubo della cassa.
- Chiudere le costole e muscoli intercostali con una sutura in prolene 4 / 0.
- Chiudere la pelle e spazio sottocutaneo con un suturare corrente 5-0 (Tabella materiali).
- Posto un 5-0 suturare (Tabella materiali) nella pelle e intorno alla cassa del tubo così quando viene rimosso il tubo della cassa, il foro sarà legato chiuso.
- Evacuare l'aria dalla cavità pleurica con una siringa da 3 mL attraverso il catetere di riprendere la normale pressione negativa nel torace. Immediatamente Clampare il catetere con un porta-aghi per impedire l'aria che sta ritornando nella cavità toracica. Rimuovere il catetere rapidamente e legare la sutura per chiudere il foro.
5. post-operatorio recupero
- Mettere l'animale in posizione sternale. Spegnere l'isoflurano, ma continuare a dare l'ossigeno di ratto tramite tubo endotracheale. Non lasciare l'animale incustodito in qualsiasi momento fino a quando ha riacquistato sufficiente coscienza per deambulare e l'animale è sicuro nella sua gabbia.
- Somministrare per via sottocutanea 2 – 3 mL di soluzione sterile di Ringer lattato.
- Monitorare la frequenza cardiaca (bpm ≈ 200 – 500), la saturazione dell'ossigeno (≥ 95%) e animale di colore per confermare l'animale è respirare bene.
- Quando l'animale inizia a fare movimenti di respirazione spontanea e movimenti del collo e risponde a stimoli fisici (ad esempio, allargando gli occhi, naso in movimento e orecchie risponde al suono), estubare l'animale tirando fuori il catetere e scollega il ventilatore.
- Restituire l'animale a una gabbia vuota, dalla compagnia di altri animali. L'animale dovrebbe essere solo per almeno 3 giorni.
- Per il controllo del dolore, è necessario somministrare 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea ogni 12 h per 3 giorni.
6. amministrazione del "Secondo colpo" MCT o Sugen
- Somministrare 1 mL di MCT (60 mg/kg) o 1 mL di Sugen (25 mg/kg) tramite iniezione sottocutanea, 1 settimana dopo l'intervento chirurgico.
7. terminale Harvest
- Sette settimane dopo la somministrazione di MCT o Sugen, metti l'animale in una camera con ossigeno che scorre (1 L/min) e 4% isoflurane.
- Collegare l'animale al ventilatore tramite cono di naso. Mantenere il flusso di ossigeno e abbassare l'isoflurano a 2,5-3%. Posare l'animale sulla sua schiena e il nastro verso il basso tutte le membra.
- Radere l'animale lungo tutto l'addome.
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Apertura sul petto
- Fare un'incisione lungo il petto con un bisturi dalla tacca subclavian per il xyphoid.
- Utilizzare le pinze per tenere il xyphoid. Tagliare lo sterno con le forbici di Cooley-Mayo fino a quando il cuore e l'arteria polmonare sono completamente accessibili. Utilizzare l'elettrocauterizzazione per fermare l'emorragia. Tenere che le costole aprire con un retrattore.
- Identificare l'arteria polmonare. Se necessario, regolare l'orientamento del cuore, con l'aggiunta di garza sotto. Utilizzare un catetere IV 20 G per puntura dell'arteria polmonare fra la valvola polmonare e la biforcazione dell'arteria polmonare principale. Far avanzare solo il catetere 20g nell'arteria e rimuovere l'ago. Avanzare il catetere di pressione transonico Fr 1,2 in IV catetere in arteria polmonare. Una volta che la curva di PA è costante, registrare la pressione per almeno 10 s. Ripetere questi passaggi per registrare la pressione nel ventricolo destro.
- Rimuovere il cuore ed i polmoni. Posto pezzi di polmone in formalina per essere riparato in paraffina e colorati con ematossilina ed eosina.
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Representative Results
Secondo il sistema di classificazione accettata, l'ipertensione polmonare è caratterizzata da una pressione media dell'arteria polmonare (mPAP) che superano i limiti superiori di pressione normale dell'arteria polmonare (cioè, 25 mm Hg). Nel gruppo MCT + pneumonectomia, PAH severo sviluppato da giorno 21 con un'aumentata mPAP (Figura 1). Il mPAP è calcolata mediante la formula:
Pressioni sistoliche e diastoliche RV e PA e sono stati misurati con il catetere pressione in arteria polmonare principale collegato al sistema di PV di vantaggio. Le pressioni arteriose polmonari medi (mPAP) è stata calcolata utilizzando la formula precedente. Nel gruppo di controllo (n = 20), la pressione media PA era 18.6±1.76 mm Hg (Figura 1). Nel gruppo MCT + pneumonectomia (n = 30), il mPAP aumentato 2,25 volte di più rispetto al gruppo di controllo (41.9±2.89 mm Hg) (Figura 1). Nel gruppo Sugen + pneumonectomia (n = 30), il mPAP era tre volte più superiore a nel gruppo di controllo (53±6.60 mm Hg). Nei gruppi di MCT sia Sugen, la RVSP era molto superiore rispetto al gruppo di controllo (Figura 1).
L'istopatologia del tessuto polmonare del ratto è stato effettuato usando ematossilina ed eosina seguita da formazione immagine con un microscopio ottico a luce. Nel polmone normale, c'è spazio tra gli alveoli e le strutture alveolari sono evidenti. I vasi sono chiare e di spessore normale (Figura 2A). Nel polmone PAH, c'è prova di ritocco, ispessimento delle pareti del vaso, grave costrizione dei vasi sanguigni, infiammazione e arteritis polmonare focale (Figura 2B, C).
Figura 1: ipertensione arteriosa polmonare severa nella pneumonectomia sinistra combinato con modello MCT. Differenze significative nel mPAP e RVSP tra il gruppo di controllo e pneumonectomia + gruppo MCT e il gruppo di controllo e pneumonectomia + Sugen gruppo. I dati sono presentati come media SEM I p-valori sono stati calcolati utilizzando un one-way ANOVA e Tukey test post-hoc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rappresentante microfotografie di H & E macchiatura del tessuto polmonare. Tessuto polmonare normale (A). Nel polmone normale del ratto, le arterie (freccia rossa) sono aperte e le pareti dei vasi sono normali dimensioni. (B) patologico vascolare rimodellamento in ratti di ipertensione arteriosa polmonare trattati con pneumonectomia e MCT. Il polmone Mostra arteritis polmonare focale e infiammazione, ispessimento concentrico mediale delle pareti del vaso (freccia bianca) e ispessimento intimale concentrico delle pareti del vaso (freccia nera), conseguente severamente ristretto vasi. (C) patologico vascolare rimodellamento in PAH ratti trattati con pneumonectomia e lallina. Questi polmoni mostrano anche arteritis polmonare focale e infiammazione, ispessimento concentrico mediale delle pareti del vaso (freccia bianca) e un ispessimento intimale concentrico delle pareti del vaso (freccia nera). I lumi di questi vasi sono severamente ristretti e/o completamente chiuso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In polmoni affetti da PAH, proliferazione vascolare con formazione di neointima e l'obliterazione delle arterie polmonari causare gravi alterazioni emodinamiche, insufficienza ventricolare destra e precoce mortalità7,8. Le modifiche alle pareti del vaso aumentano la resistenza al flusso del sangue, aumento della pressione arteriosa e ventricolare destra. Nelle fasi iniziali della PAH, solitamente 3 settimane dopo la somministrazione di MCT o Sugen, ratti hanno sviluppato i cambiamenti istologici aspecifici come l'ipertrofia mediale, adventitial ispessimento e muscularization di piccole arterie ed arteriole. Questi cambiamenti sono potenzialmente reversibili. Nelle fasi successive, circa 6-8 settimane dopo la somministrazione di MCT o Sugen, polmoni del ratto hanno neointimale e vasculopathy plexiform che ostacolano e cancellare arteriole, proliferazione intimal cellulare, e medie e piccole arterie polmonari e concentrici fibrosi intimal. Lesioni plexiform consistono solitamente di un plesso delle scanalature allineate dalle cellule endoteliali e miofibroblasti. In molti casi, questi cambiamenti sono associati con l'edema interstiziale e la fibrosi, tromboembolico ostruzione delle arterie polmonari piccole distale, parziale ricanalizzazione di un navi muscolare thrombosed e necrosi fibrinoide12.
Come affermato in precedenza, ratti in altri modelli PAH non sviluppano obliterazione vascolare di piccoli vasi, neointimale, lesioni plexiform e alte pressioni PA e RV. Trattamento con il modello PAH di ipossia cronica è stato trovato per produrre alcuni ispessimento dei vasi ma i vasi rimangono aperti e ci sono nessun lesioni vascolari obliterative e piccola infiammazione5. RSVP e mPAP valori sono leggermente sopraelevati rispetto per controllare5. Allo stesso modo, il trattamento con MCT o pneumonectomia ha provocato le pressioni arteriose polmonari che non erano significativamente superiori ai ratti di controllo e leggermente rimaneggiato navi7,9.
Al contrario, abbiamo trovato che la pneumonectomia sinistra combinato con MCT o Sugen è un modello efficace per creare gravi PAH. Rispetto al gruppo di controllo, la pressione arteriosa polmonare media (mPAP) e la pressione sistolica ventricolare destra (RSVP) in ratti con grave PAH quasi raddoppiato (Figura 1). Inoltre, questi ratti hanno sviluppato lesioni plexiform, ispessimento mediale e intimale concentrico, tromboembolico ostruzione distale piccole arterie polmonari, infiammazione e molto elevati dell'arteria polmonare e pressioni ventricolare destra (Figura 2 ). Rispetto alla ipossia cronica, iniezione di MCT e solo i modelli pneumonectomia di PAH eseguita in altri studi, la pneumonectomia combinato con MCT o Sugen modello crea una condizione clinicamente rilevante. Inoltre, questo modello, se eseguita correttamente, ha un tasso di mortalità intra-operatoria quasi 0% e solo un 10% mortalità tasso post-ripristino da errore del polmone destro per compensare l'insufficienza respiratoria. Più alti tassi di mortalità intra-operatoria o post-recupero è in genere indicativa che errore umano o attrezzature ha avuto luogo.
Per poter eseguire la pneumonectomia sinistra e creare PAH, ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che dovrà essere completato. In primo luogo, è molto importante monitorare la saturazione di ossigeno dell'animale, capnografia e contando la frequenza cardiaca durante tutta la procedura per garantire l'animale sta respirando e batte il suo cuore. Monitoraggio saturazione dell'ossigeno ulteriore conferma corretta intubazione endotracheale. Intubating l'animale è assolutamente necessario per questa procedura. Quando viene aperta la cavità toracica dell'animale, la pressione negativa che normalmente esiste nella cavità toracica è spostata a pressione positiva atmosferica. Così, ratti devono essere forniti con pressione positiva tramite ventilazione artificiale. Senza intubazione corretta, i polmoni dell'animale crollerà dalla pressione atmosferica positiva.
L'incisione chirurgica deve essere effettuato lateralmente o posterolaterally e nel terzo spazio intercostale. A seconda dell'anatomia del ratto, il chirurgo potrebbe essere necessario aprire un diverso spazio intercostale per poter accedere al polmone e visualizzare i vasi. Usando altri metodi renderà molto difficile raggiungere l'arteria polmonare di sinistra. Quando si apre la cavità toracica, è molto importante utilizzare una penna elettrocauterizzazione per fermare il sanguinamento della pelle, muscoli e che circondano i vasi. Se lo sperimentatore salta questo passaggio, l'animale perde sangue e meno ossigeno sarà messe in circolazione. L'incisione deve essere un minimo di 2 cm di lunghezza in modo che vi sia spazio sufficiente per estrarre l'intero polmone quando legando. In caso contrario, l'investigatore si strappa il tessuto quando si tenta di rimuovere il polmone da una piccola apertura. Inoltre è indispensabile utilizzare pinza atraumatica durante lo spostamento del polmone al fine di evitare la rottura del tessuto e un'emorragia. L'arteria polmonare è chiuso prima per prevenire il sanguinamento dalla manipolazione dei polmoni. Lo sperimentatore deve essere molto attento quando legando i vasi per evitare la chiusura della vena azygos sinistra o lacerazione dei vasi in caso contrario, l'animale muore. Inoltre, è molto più facile per il chirurgo di usare i hemoclips titanio anziché suture per legare l'arteria polmonare di sinistra, ha lasciato bronco principale e vene polmonari di sinistra con una sutura. Poiché lo sperimentatore deve fare un'incisione relativamente lunga nello spazio intercostale, è necessario chiudere i muscoli intercostali e costole con punti di sutura. Una volta chiuso il petto, l'aria deve essere evacuata dal petto per ripristinare la pressione negativa ed è importante evitare la distorsione di cuore e polmone controlaterale con un pneumotorace chiuso.
Infine, il recupero è una delle fasi più critiche dopo la pneumonectomia di ratto. Un thoracotomy è considerato un intervento molto doloroso e analgesici sono essenziali per promuovere un'adeguata ventilazione, migliorare escursioni polmonari nel periodo postoperatorio e ridurre il dolore. Ratti dovrebbero essere recuperati in posizione sternale per massimizzare insufflazione polmonare. Dopo 10 min, l'investigatore può fare diminuire il tasso di ventilazione per contribuire a stimolare l'animale a respirare da solo ed a svegliarsi. Se l'animale diventa cianotico e diminuiscono i livelli di saturazione di ossigeno, è necessario aumentare l'ossigeno, il tasso di ventilazione e aumentare il volume corrente a 5 mL o più a seconda della capacità del ventilatore. Extubation dei ratti dovrebbe essere fatto più tardi possibile, una volta che l'animale è completamente sveglio. Lo sperimentatore può mettere il ratto estubato in una camera con solo fluire ossigeno per favorire ulteriormente la ripresa.
Se la tecnica viene eseguita correttamente e le considerazioni di cui sopra sono indirizzate, eseguendo un pneumonectomy unilaterale sinistro combinato con MCT o Sugen crea un modello affidabile di PAH severa ipossia da solo, MCT o altri metodi. Quando la pneumonectomia viene eseguita correttamente, l'animale sopravvive, la procedura ha una durata breve (15-30 min), e lo sperimentatore non ha bisogno di specifiche abilità chirurgiche vascolari. Inoltre, il ricercatore è in grado di creare correttamente PAH. Le limitazioni di questo metodo sono che un thoracotomy è una procedura invasiva, l'intubazione endotracheale è necessaria e l'investigatore ha bisogno di alcune abilità chirurgiche generali. Le lesioni occlusive vascolari polmonare neointimale e gli aumenti pronunciati in pressione dell'arteria polmonare simile ai pazienti di ipertensione polmonare umana sono evidenti in ratti dopo la combinazione di pneumonectomy con MCT o SU5416 iniezione7 , 8 , 9. il presente modello è un metodo affidabile per studiare il ruolo di overflow polmonare nel polmone controlaterale e ipertensione polmonare indotta da flusso.
Questo protocollo può essere utile per lo studio di altre malattie. È possibile utilizzare questo modello per studiare la crescita compensatoria del tessuto polmonare nel polmone controlaterale. Questa tecnica può essere utilizzata anche per studiare e sviluppare trattamenti per l'insufficienza ventricolare destra (RVF). Ipertrofia del ventricolo destro grave si sviluppa in animali che sviluppano neointimale lesioni da pressione arteriosa aumentata7. RVF provoca la morte in circa il 70% dei pazienti con PAH13. Aumento del flusso sanguigno polmonare può essere utile per lo studio e lo sviluppo di terapie per i pazienti che soffrono di malattie cardiache congenite pure.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun potenziali conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo manoscritto è stato sostenuto dal NIH concedere 7R01 HL083078-10 garantisce dall'American Heart Association AHA-17SDG33370112 e da istituti nazionali di salute NIH K01 HL135474 di Y.S. e da istituti nazionali di salute R01 HL133554 a L.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
References
- Leopold, J., Maron, B. Molecular Mechanisms of Pulmonary Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 761 (2016).
- Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L363-L369 (2012).
- van Albada, M. E., et al. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. European Respiratory Journal. 26 (3), 487-493 (2005).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A. J., Berger, R. M. F. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: lessons from preclinical animal models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (6), L1013-L1032 (2009).
- Cahill, E., et al. The pathophysiological basis of chronic hypoxic pulmonary hypertension in the mouse: vasoconstrictor and structural mechanisms contribute equally. Experimental Physiology. 97 (6), 796-806 (2012).
- Okada, K., et al. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. American Journal of Pathology. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- Happé, C. M., et al. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Tanaka, Y., Schuster, D. P., Davis, E. C., Patterson, G. A., Botney, M. D. The role of vascular injury and hemodynamics in rat pulmonary artery remodeling. Journal of Clinical Investigation. 98 (2), 434-442 (1996).
- Nishimura, T., Faul, J. L., Berry, G. J., Kao, P. N., Pearl, R. G. Effect of a surgical aortocaval fistula on monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Critical Care Medicine. 31 (4), 1213-1218 (2003).
- Linardi, D., et al. Ventricular and pulmonary vascular remodeling induced by pulmonary overflow in a chronic model of pretricuspid shunt. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (6), 2609-2617 (2014).
- White, R. J., et al. Plexiform-like lesions and increased tissue factor expression in a rat model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L583-L590 (2007).
- Samson, N., Paulin, R. Epigenetics, inflammation and metabolism in right heart failure associated with pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (3), 572-587 (2017).
