Summary
Den gnagare vänster pneumonectomy är en värdefull teknik i pulmonell hypertension forskning. Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva råtta pneumonectomy förfarande och postoperativ vård att säkerställa minimal sjuklighet och dödlighet.
Abstract
I detta protokoll, detalj vi den rätta förfarandeåtgärder och nödvändiga försiktighetsåtgärder för att framgångsrikt utföra en vänster pneumonectomy och inducera PAH hos råttor med ytterligare administrering av monocrotaline (MCT) eller SU5416 (Sugen). Vi jämför också dessa två modeller till andra PAH-modeller som vanligen används i forskning. Under de senaste åren, har i fokus för PAH djurmodeller rört sig mot studera mekanismen av angioproliferation av plexiform lesioner, då roll ökat pulmonell blodflöde anses som en viktig utlösande faktor i utvecklingen av allvarlig pulmonell vaskulär remodeling. En av de mest lovande gnagare modellerna av ökade pulmonella flödet är den ensidiga vänster pneumonectomy kombinerat med en ”andra hit” MCT eller Sugen. Avlägsnande av den vänstra lungan leder till ökad och turbulent pulmonell blodflöde och vaskulär remodeling. För närvarande finns det ingen detaljerad procedur av pneumonectomy kirurgi hos råttor. Den här artikeln beskriver ett stegvisa protokoll pneumonectomy kirurgiskt ingrepp och postoperativ vård i manliga Sprague-Dawley-råttor. Kortfattat, djuret är sövd och bröstkorgen öppnas. När den vänstra lungartären, pulmonell ven och luftrör visualiseras, de är sammanskrivna och den vänstra lungan tas bort. Bröstet då stängd och djuret återvinns. Blod är tvungen att cirkulera endast på den högra lungan. Detta ökade vaskulära trycket leder till en progressiv remodeling och ocklusion av små lungartärerna. Andra träffen av MCT eller Sugen är används en vecka efter operationen att inducera endoteldysfunktion. Kombinationen av ökat blodflöde i lunga och endoteldysfunktion ger svår PAH. Primära begränsning av detta förfarande är att den kräver allmän kirurgiska färdigheter.
Introduction
Pulmonell arteriell hypertension (PAH) är en progressiv och dödlig sjukdom som kännetecknas av en ökning av pulmonell blodflöde, ökad vaskulär resistens, inflammation och ombyggnad av små pulmonell blodkärl1. Denna ombyggnad oftast resulterar i vaskulära lesioner som hindrar och utplåna små lungartärerna, orsakar vasokonstriktion och öka höger kammare afterload2. Några framgångsrika farmakologiska behandlingar av PAH finns; som en följd, PAH-relaterad mortalitet är fortsatt hög. Nyligen, i fokus för forskning på patobiologi av pulmonell hypertension har flyttat mot en mekanism av angio-spridning då roll ökat pulmonell blodflöde anses som en viktig utlösande faktor i utvecklingen av pulmonell vaskulär remodeling3,4.
Djurmodeller av pulmonell hypertension har gett viktiga insikter som hjälper till att förklara patofysiologin bakom sjukdomen och har fungerat som en plattform för drogen, cell, gen och protein leverans. Traditionellt, har den kronisk hypoxi-inducerad pulmonell hypertension och den MCT lung skada modellen varit de viktigaste modeller som används för att studera PAH patofysiologi5. De är dock inte tillräcklig för att ge ökad pulmonell blod flöde och neointimal mönster av remodeling jämfört med ändringar som beskrivs i mänskliga patienter. Kronisk hypoxi modellen i gnagare resulterar i förtjockning av kärlväggarna med hypoxisk vasokonstriktion utan angio-obliteration av små pulmonell fartyg6. Dessutom är villkoret hypoxi reversibel. Således, hypoxi modellen är inte heller tillräckligt för att producera svår PAH. MCT lung skada modellen framkalla vissa endoteldysfunktion men de komplexa vaskulära obliterativ lesioner i människor med svår primär PAH utvecklas inte i råttor2. Dessutom, tenderar MCT-behandlade råttor att dö från MCT-inducerad lungtoxicitet, venocklusiv leversjukdom och myokardit snarare än från PAH2. Slutligen räcker pneumonectomy ensam inte för att producera neointimal lesioner i små pulmonell fartyg i en kort tidsperiod. Efter pneumonectomy finns det minimal höjd i pulmonella arteriella trycket7. Pneumonectomy tolereras väl hos människor, när kontralaterala lungan är friska7.
Men är vänster pneumonectomy förfarandet kombinerat med MCT eller Sugen fördelaktigt eftersom det härmar ökat pulmonell blodflöde och resulterar i pulmonell vaskulär ombyggnad jämförbar med svår klinisk PAH. Pneumonectomy utförs på den vänstra lungan, som har endast 1 LOB, snarare än den rätten, som har fyra lober. Om den högra lungan togs bort, skulle djuret kunna kompensera andningsinsufficiens. I pneumonectomy-MCT modellen utvecklar neointimal mönster av remodeling i över 90% av drivs-djur behandlas7. Likaså kombinationen av Sugen och pneumonectomy resulterar i svår PAH, kännetecknas av angio-obliterativ vaskulära lesioner, spridning, apoptos och RV dysfunktion8. Det vänstra pneumonectomy förfarandet är också fördelaktigt jämfört med andra kirurgiska ingrepp för att inducera PAH. Tidigare innefatta beskrivna modeller hos råttor att öka pulmonell blodflödet till lungorna aorto-caval shunt eller subclavia-Pulmonell artär anastomos. Dessa modeller är extremt komplicerade7,9,10,11. För att utföra en aorto-caval shunt, måste djurets buken öppnas. Shunten är placerad i bukaorta, vilket ökar blodflödet till alla bukorganen istället för bara lungorna, således PAH tar mycket längre tid att utveckla. Dessutom är det svårt att avgöra blodflödet genom shunten, medan med pneumonectomy blodflödet till de återstående lung-dubblar. Subclavia-Pulmonell artär anastomos har också många komplikationer. Flödet av arteriellt blod i venen kan leda till trombos anastomos och blödning. Liksom den aorto-caval shunten är det svårt att avgöra blodflödet genom anastomos. Dessutom är det en dyr och svår teknik som kräver vaskulär kirurgiska färdigheter. Den ensidiga vänster pneumonectomy fördubblar blodflödet och skjuvspänning i kontralaterala lungan och i kombination med MCT eller Sugen, orsakar de typiska hemodynamiska och histopatologiska fynd av PAH som är endotelceller skada8, 12.
Nya i detta manuskript presenteras i mycket detaljerade och omfattande kirurgiska protokollet av den vänstra pneumonectomy hos råtta och diskussionen om de tekniska och fysiologiska utmaningarna av dessa modeller. Eftersom detta protokoll inte är tillgängliga, tror många utredare att modellen är alltför svårt användning. Utredare som har utfört den vänstra pneumonectomy har inför höga dödligheten och sjukligheten är associerad med den onödiga förlusten av djur, att kompromissa vetenskaplig bedömning. I stället använder många klassiska modeller som MCT injektion, kronisk-hypoxi eller bara pneumonectomy för att skapa PAH. Dessa modeller är dock mycket mindre effektiva än kombinationen av MCT eller Sugen med den vänstra pneumonectomy. Det primära syftet med denna artikel är att ge den första detaljerade och reproducerbara kirurgiska protokollet för den vänstra ensidiga pneumonectomy hos råttor och tillhandahålla den bästa kirurgiska modellen av PAH. Att kombinera detta protokoll för vänster ensidiga pneumonectomy med MCT eller SU5416 gör att utredarna att skapa en långt effektivare och kliniskt relevant modell svår PAH att studera patogenesen av denna dödliga sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De förfaranden som beskrivs nedan har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Icahn School of Medicine vid berget Sinai. Alla råttor fick mänsklig omsorg i enlighet med Mount Sinai ”Guide för skötsel och användning av försöksdjur”.
1. förberedelser inför kirurgi
- Autoklav Cooley-Mayo böjd sax (stora saxen), raka Iris sax (liten sax), McPherson-Vännäs Iris sax (bakre saxen), Wangensteen vävnad pincett (atraumatiska tången), Gerald vävnad pincett, vanlig tråd spekulum (själv behålla upprullningsdonet), små fartyg cauterizer, gasväv, dubbeländad sond, tunn vaskulär nålförare och Micro-Jacobson mygga hemostatiska pincett (mygga).
2. upprättande och Intubation av råttor
- Administrera en subkutan injektion med buprenorfin analgesi (0,1 mg/kg) i 6 – 8 veckors gamla manliga, Sprague-Dawley-råttor, 30 min före operation.
- Placera råtta individuellt i en kammare som utsätts för isofluran 4% och syre (1 L/min) för 3-4 min tills råttan är ordentligt bedövas (dvs, medvetslös, andas långsamt, och inte svarar på beröring eller ljud).
-
Intubation av råttor
- Ta bort råttan från kammaren och tejpa råttan att en styrelse så råtta ligger plant på rygg, med munnen vid kanten av styrelsen. Använda sträng för att hålla råttan genom två framtänderna så att halsen förblir platt/rakt.
- Placera en fiber optic gås ljuskälla ovanför halsen över struphuvudet, lyft och håll tungan med fingrar och flytta struplocket upp att visualisera stämbanden. Luftstrupen bör vara ljusa bakom stämbanden; justera ljuset tills luftstrupen är ljust.
- Intubation råttorna genom att infoga en 16 G kateter i struphuvudet inom 60 s för att ta bort råttan från kammaren när de vaknar snabbt. Om råttan vaknar innan lyckad intubation, sätta råtta tillbaka och upprepa.
- Omedelbart ansluta råtta till ventilatorn att återuppta isofluran och syre leverans. Bekräfta den intubation med en kall spegel för att iaktta kondensation av luftfuktigheten i utandningsluften från katetern. Kontrollera att djuret är fortfarande andas genom utbyggnaden av bröstet.
- Anslut råtta till ventilatorn. Ställ in syre till flow på 1 L/min. Ange ventilation till 70 andetag/min med tidal volym 0,35-0,45 mL. Ange positiva änden utandningstryck (PEEP) till 2 – 4 cm H2O. minska isofluran till 2 – 3%.
- Placera råtta under lupp i rätt decubitus position på en värmedyna vid 37 ° C. Tejpa frambenen ner. Raka vänster bröstkorgen bakom den främre benet fram till slutet av bröstkorgen med clippers. Ren det kirurgiska området med gasväv och 10% povidon-jodlösning, följt av 70% etanol (tre gånger).
- Placera pulsoximeter på råttans fot och övervaka puls och syremättnad under hela operationen. Pulsen ska ligga mellan 200 – 500 bpm och syre mättnad bör vara > 95%.
3. beredning av steril miljö
- Visualisera det kirurgiska området under mikroskopet. Detta måste göras först eftersom mikroskopet inte kan justeras när miljön är steril.
- Sätta på steril, kirurgiska handskar. Inte röra någonting förutom de steriliserade instrument, de kirurgiska draperier och det kirurgiska området av råttans kropp.
- Placera en steril draperi över råttans kropp och på instrumentet facket att skapa en steril miljö.
- Med sterila handskar, placera sterila instrument på det sterila instrument facket.
4. vänster Pneumonectomy kirurgiskt ingrepp
- Använda Cooley-Mayo sax och Gerald vävnad pincett för att skära ett litet hål i den kirurgiska draperingen. Hålet bör vara ca 2 – 3 cm i diameter helt visualisera snittet men inte alltför stor så att endast steriliseras hud exponeras.
- Gör en 2 cm lång laterala snitt i vänster bröstkorg med hjälp av en kirurgisk blad. Använd gasväv och diatermi pennan för att hantera blödning/bibehålla hemostas. Använd Cooley-Mayo saxen för att klippa varje lager av vävnad tills revbenen och muskulaturen är utsatta.
-
Att ange interkostalrummet
- Använd mygga för att göra ett hål genom den tredje interkostalrummet muskeln.
- Använda dubbelriktade sonden för att flytta lungorna ur vägen för att visualisera lungartären. Utredaren kan ange en annan interkostalrummet om lungartären inte är tillgänglig.
- Användning iris sax och McPherson-Vännäs iris sax (bakre saxen) att öppna av intercostalmusklerna till ca 1 – 2 cm. använda diatermi pennan för att stoppa eventuella blödningar.
- Placera en liten, själv behålla upprullningsdon att hålla revben och muskler öppna.
- Öppna bara vänstra lungsäcken och flytta den vänstra lungan ner lägre i buken att tillåta åtkomst till lungartären och luftrör. Läsa in en medellång hemoclip i ligating klipp applikatorn.
-
Ligering av vänster huvudsakliga luftrör och vänster viktigaste lungartären
- Lyft den övre delen av den vänstra lungan försiktigt med Wangensteen atraumatiska tången att exponera lungartären.
- Klipp lungartären genom att stänga klippet och applikatorn runt artär. Var noga med att inte stänga eller brista den vänstra azygos ven. Klämma inte alltför kraftfullt annars, fartyget kan brista.
- Öppna snittet ytterligare med tonsill för att separera muskelfibrerna.
- Läsa in en annan medelstora hemoclip i ligating klipp applikatorn så att den är klar.
- Använd atraumatiska tången för att lyfta den nedre delen av lungan ur snittet tills de vänster huvudsakliga luftrör och vänster pulmonell ven visualiseras. Atraumatiska tången måste vara brukade dra flytta lungan upp och ut ur snittet. Eftersom lungorna är för stor för att dras ut i en enda rörelse utan att riva vävnaden, är fråga tången nödvändiga för att hålla lungan på plats medan atraumatiska tången används försiktigt att dra mer lung ut.
- Ligera den vänster huvudsakliga luftrör och vänster huvudsakliga pulmonell ven tillsammans genom att stänga applikatorn runt dem. Klämma inte venen och luftrör för kraftfullt annars, fartyget kan brista.
- Ta bort lungan med sax. Var noga med att inte skära eller riva ut klippet. Använda en liten bit av steril gasbinda för att absorbera blod och kontrollera att det finns ingen blödning.
-
Stängningen av revbenen och muskulaturen
- Innan du stänger av intercostalmusklerna, infoga en 16 G kateter i brösthålan från kirurgiska snittet och i den sjunde interkostalrummet. Kontrollera att utredaren kan visualisera nålen så att inte punktera några vitala organ eller fartyg.
- Omedelbart ta bort nålen, lämnar katetern på plats. Detta kommer att användas som en bröstet röret.
- Nära revbenen och muskulaturen med en 4-0 prolene sutur.
- Stäng av hud och subkutan plats med en rinnande 5-0 sutur (Tabell för material).
- Plats en 5-0 sutur (Tabell för material) in i huden och runt bröstet röret så när bröstet röret tas bort, hålet kommer att knytas stänga.
- Evakuera luften från pleural hålighet med en 3 mL spruta genom katetern att återfå normal undertrycket i bröstkorgen. Omedelbart klämma katetern med en nålförare att hindra luft från att gå tillbaka till brösthålan. Snabbt ta bort katetern och knyta suturen för att stänga hålet.
5. postoperativ återhämtning
- Placera djuret i sternala position. Stänga av isofluran men fortsätta ge råtta syre via endotrakealtub. Lämna inte djuret utan uppsikt när som helst tills den har återfått tillräcklig medvetande för att ambulate och djuret säkert i sin bur.
- Administrera 2 – 3 mL steril ringer-laktat lösning subkutant.
- Övervaka hjärtfrekvens (≈200 – 500 bpm), syremättnad (≥ 95%), och djur färg att bekräfta djuret andas väl.
- När djuret börjar göra spontanandningen motioner och hals rörelser och svarar på fysiska stimuli (t.ex. ögonen breddning, näsa flyttar och öron svarar på ljud), extubate djuret genom att dra ut katetern och koppla ur respiratorn.
- Tillbaka djuret till en tom bur, från företaget av andra djur. Djuret ska vara ensam för minst 3 dagar.
- För smärtkontroll, administrera 0,1 mg/kg av Buprenorfin subkutant varje 12 h i 3 dagar.
6. administrering av ”andra Hit” MCT eller Sugen
- Administrera 1 mL MCT (60 mg/kg) eller 1 mL Sugen (25 mg/kg) via subkutan injektion, 1 vecka efter operationen.
7. terminal skörd
- Sju veckor efter administrering av MCT eller Sugen, placera djuret i en kammare med flytande syre (1 L/min) och 4% isofluran.
- Anslut djuret till ventilatorn via näsan konen. Hålla syre flyter och sänka isofluran till 2,5 – 3 procent. Lägg djuret på ryggen och tejpa ner alla lemmar.
- Raka djuret längs hela buken.
-
Öppna bröstet
- Gör ett snitt ner bröstet med en skalpell från subclavia skåran till xyphoid.
- Använda vävnad tången för att hålla xyphoid. Skär genom bröstbenet med Cooley-Mayo saxen tills hjärtat och lungartären är fullt tillgängliga. Använd diatermi för att stoppa blödningen. Håll revbenen öppna med en upprullare.
- Identifiera lungartären. Justera orienteringen av hjärtat, om nödvändigt, genom att lägga till kompress under. Använd en 20 G IV kateter punktera lungartären mellan den pulmonell ventilen och bifurkation av de viktigaste lungartären. Fram endast 20 G katetern in i artären och ta bort nålen. Fram 1,2 Fr transsonisk trycket katetern in IV katetern som är i lungartären. När PA kurvan är stadig, registrera trycket för minst 10 s. Upprepa dessa steg för att registrera trycket i höger kammare.
- Ta bort hjärta och lungor. Placera bitar av lungan i formalin till fastställas i paraffin och färgas med hematoxylin och eosin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt den vedertagna klassifikationssystem kännetecknas pulmonell hypertension av en genomsnittlig pulmonella arteriella trycket (mPAP) överstiger de övre gränserna för normal lungartärtryck (dvs. 25 mm Hg). I MCT gruppen + pneumonectomy, svår PAH utvecklats av dag 21 med en ökad mPAP (figur 1). MPAP beräknas genom formeln:
Systoliskt och diastoliskt RV och PA tryck och mättes med trycket katetern i de viktigaste lungartären ansluten till fördel PV-systemet. Genomsnittliga pulmonella arteriella trycket (mPAP) beräknades med hjälp av ovanstående formel. I kontrollgruppen (n = 20), genomsnittliga PA trycket var 18.6±1.76 mm Hg (figur 1). I pneumonectomy + MCT-gruppen (n = 30), mPAP ökade 2,25 gånger mer jämfört med kontrollgruppen (41.9±2.89 mm Hg) (figur 1). I Sugen gruppen + pneumonectomy (n = 30), mPAP var tre gånger högre än i kontrollgruppen (53±6.60 mm Hg). I både MCT och Sugen grupper, var RVSP mycket högre jämfört med kontrollgruppen (figur 1).
Histopatologi råtta lungvävnad utfördes med hematoxylin och eosin färgning följt av imaging med ett optiskt ljusmikroskop. I den normala lungan, det finns utrymme mellan alveolerna och alveolära strukturer är uppenbara. Fartygen är tydliga och av normal tjocklek (figur 2A). I PAH lungan finns det bevis för remodeling, förtjockning av kärlväggarna, svår förträngning av fartyg, inflammation och fokal pulmonell arterit (figur 2B, C).
Figur 1: svår pulmonell arteriell hypertension i den vänstra pneumonectomy kombinerat med MCT modell. Betydande skillnader i mPAP och RVSP mellan kontrollgruppen och pneumonectomy MCT-gruppen och i kontrollgruppen och pneumonectomy + Sugen grupp. Data presenteras som betyder SEM. P-värdena beräknades med hjälp en envägs ANOVA och Tukey post hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa mikrofotografier av H & E färgning av lungvävnad. (A) Normal lungvävnad. I normala råtta lungan, artärerna (röd pil) är öppna och kärlväggarna är normal storlek. (B) patologiska vaskulär remodeling pulmonell arteriell hypertension råttor som behandlats med pneumonectomy och MCT. Lungan visar fokal pulmonell arterit och inflammation, koncentriska mediala förtjockning av kärlväggarna (vit pil) och koncentriska intimans förtjockning av kärlväggarna (svart pil), vilket resulterar i kraftigt förträngda kärl. (C) patologiska vaskulär remodeling i PAH råttor som behandlades med pneumonectomy och Sugen. Dessa lungor visar också fokala pulmonell arterit och inflammation, koncentriska mediala förtjockning av kärlväggarna (vit pil) och koncentriska intimans förtjockning av kärlväggarna (svart pil). I lumen av dessa fartyg är hårt trängd eller helt stängd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I PAH-drabbade lungorna, vaskulär proliferation med neointimal bildning och utplånandet av lungartärerna resultera i allvarliga hemodynamiska förändringar, högerkammarsvikt och tidig mortalitet7,8. Ändringarna i kärlväggarna öka motståndet mot blodflödet, öka arteriella och höger kammare trycket. I de tidiga stadierna av PAH framkallade vanligtvis 3 veckor efter administrering av MCT eller Sugen, råttor ospecifik histologiska förändringar som medial hypertrofi, adventitial förtjockning och muscularization av små artärer och arterioler. Dessa förändringar är potentiellt reversibla. I senare stadier, ca 6 – 8 veckor efter administrering av MCT eller Sugen, råttans lungorna har neointimal och plexiform Vaskulopati som hindrar och utplåna medelstora och små pulmonell artärer och arterioler, cellulära intimans spridning, och koncentriska intimans fibros. Plexiform lesioner består vanligtvis av en plexus av kanaler kantade av endotelceller och myofibroblaster. I många fall är dessa förändringar associerade med interstitiell ödem och fibros, tromboemboliska obstruktion av distala små lungartärerna, partiell recanalization av en thrombosed muskulär fartyg, och fibrinoid nekros12.
Som nämnts tidigare, utveckla råttor i andra PAH-modeller inte vaskulär utplånandet av den små fartyg och plexiform lesioner, neointimal och höga PA och RV tryck. Behandling med kronisk hypoxi PAH modellen konstaterades för att producera vissa förtjockning av fartyg men fartygen förblir öppna och det finns ingen vaskulära obliterativ lesioner och lite inflammation5. RVSP och mPAP värden är något förhöjd jämfört med kontroll5. Likaså, resulterade behandling med antingen MCT eller pneumonectomy i pulmonell arteriell påtryckningar som inte var betydligt högre än kontroll råttor och något remodeled fartyg7,9.
Däremot fann vi att den vänstra pneumonectomy kombinerat med MCT eller Sugen är en effektiv modell för att skapa allvarliga PAH. Jämfört med kontrollgruppen, fördubblats det genomsnittliga pulmonella artärtryck (mPAP) och höger kammare systoliska trycket (RVSP) i råttor med svår PAH nästan (figur 1). Dessutom, utvecklade dessa råttor plexiform lesioner, koncentriska mediala och intimans förtjockning, tromboemboliska obstruktion av distala små lungartärerna, inflammation, och mycket förhöjda lungartären och höger kammare trycket (figur 2 ). Den pneumonectomy kombinerat med MCT eller Sugen modellen jämfört med den kronisk hypoxi, MCT injektion och pneumonectomy bara modeller av PAH som utförs i andra studier, och skapar ett kliniskt relevanta villkor. Dessutom, denna modell, om utförs korrekt, har en nästan 0% intraoperativ dödlighet och bara en 10% dödlighet klassar efter återställningen från misslyckande av den högra lungan att kompensera andningsinsufficiens. Högre priser antingen intraoperativ eller efter återställningen dödlighet är oftast vägledande att mänskliga eller utrustning fel har ägt rum.
För att framgångsrikt utföra den vänstra pneumonectomy och skapa PAH, finns det flera kritiska steg i detta protokoll som måste slutföras. Först, det är mycket viktigt att övervaka djurets syremättnad, capnography och räkna pulsen under hela förfarandet att säkerställa djuret andas och hans hjärta slår. Övervakning syremättnad ytterligare bekräftar korrekt endotrakeal intubering. Intubating djuret är absolut nödvändigt för detta förfarande. När djurets brösthålan öppnas, skiftas undertrycket som normalt finns i brösthålan till atmosfärens övertryck. Råttor behöver alltså, förses med positivt tryck via konstgjord ventilation. Utan korrekt intubation, kommer att djurets lungor kollapsa från det positiva lufttrycket.
Det kirurgiska snittet har görs sidled eller posterolaterally och i den tredje interkostalrummet. Beroende på råttans anatomi, kan kirurgen behöva öppna en olika interkostalrummet för att få tillgång till lungan och visualisera kärlen. Med hjälp av andra metoder gör det mycket svårt att nå den vänstra lungartären. När du öppnar brösthålan, är det mycket viktigt att använda en diatermi penna för att stoppa blödningar från huden, muskler, och omgivande fartyg. Om utredaren hoppar över detta steg, djuret förlorar blod och mindre syre kommer att cirkulera. Snittet skall vara minst 2 cm lång så att det finns tillräckligt med utrymme att ta ut hela lungan när ligating. Annars kommer utredaren riva vävnaden när du försöker ta bort lungan från en liten öppning. Det är också viktigt att använda atraumatiska pincetten när du flyttar lungan för att undvika att sprängas sönder vävnaden och blödningen. Lungartären är stängd först för att förhindra blödning från manipulation av lungorna. Utredaren bör vara mycket försiktig när ligating fartyg för att undvika stängning av vänster azygos ven eller riva fartygen annars, kommer djuret att dö. Dessutom är det mycket lättare för kirurgen att använda titanium hemoclips snarare än suturer att ligera den vänstra lungartären, vänster huvudsakliga luftrör och vänster pulmonell vener med en sutur. Eftersom utredaren har att göra en relativt lång incision i interkostalrummet, är det nödvändigt att stänga muskulaturen och revben med suturer. När bröstet är stängd, air har evakueras från bröstet för att återställa undertryck och det är viktigt att förhindra kontralaterala lungan och hjärtat distorsion med en sluten pneumothorax.
Slutligen, återhämtning är en av de viktigaste stegen efter den råtta pneumonectomy. En torakotomi anses vara en mycket smärtsam operation och analgetika är väsentliga för att främja tillräcklig ventilation, förbättra lung utflykter i den postoperativa perioden och minska smärta. Råttor ska återställas i sternala position att maximera lung inflationen. Efter 10 min, kan utredaren minska andelen ventilation för att bidra till att stimulera djuret för att andas på egen hand och vakna upp. Om djuret blir cyanotisk och syre mättnad nivåer minskar, är det nödvändigt att öka syre, ventilation ränta och öka tidalvolymen till 5 mL eller mer beroende på kapaciteten i ventilatorn. Extubering råttor bör göras så sent som möjligt, när djuret är helt vaken. Utredaren kan sätta extubated råtta i en kammare med bara flödande syre till ytterligare stöd för återhämtning.
Om tekniken utförs korrekt och de ovannämnda övervägandena riktar, utför en vänster ensidiga pneumonectomy kombinerat med MCT eller Sugen skapar en tillförlitlig modell svår PAH än MCT ensam, hypoxi eller andra metoder. När pneumonectomy utförs korrekt, djuret överlever, förfarandet har en kortvarig (15 – 30 min) och utredaren behöver inte särskilda vaskulär kirurgiska färdigheter. Utredaren är dessutom kunna lyckas skapa PAH. Begränsningarna med denna metod är att en torakotomi är en invasiv förfarande, endotrakeal intubering krävs och utredaren behöver vissa allmänna kirurgiska färdigheter. De neointimal pulmonella vaskulära ocklusiva lesionerna och uttalad ökningen lungartärtryck liknar mänskliga pulmonell hypertension patienter märks hos råttor efter kombinationen av pneumonectomy med MCT eller SU5416 injektion7 , 8 , 9. den nuvarande modellen är en tillförlitlig metod att studera rollen av pulmonell överflöd i kontralaterala lungan och flöde-inducerad pulmonell hypertension.
Detta protokoll kan vara användbart för att studera andra sjukdomar. Det är möjligt att använda denna modell för att studera kompensatoriska tillväxten av pulmonell vävnad i kontralaterala lungan. Denna teknik kan också användas för att studera och utveckla behandlingar för högerkammarsvikt (RVF). Svår höger kammare hypertrofi framkallar i djur som utvecklar neointimal lesioner från ökat artärtryck7. RVF orsakar död i ca 70% av patienter med PAH13. Att öka pulmonell blodflödet kan vara användbar för att studera och utveckla behandlingar för patienter som lider av medfödda hjärtsjukdomar samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga potentiella intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta manuskript stöddes av NIH bevilja 7R01 HL083078-10 bidrag från American Heart Association AHA-17SDG33370112 och från de nationella institut för hälsa NIH K01 HL135474 att Y.S. och från den nationella institut för hälsa R01 HL133554 till L.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
References
- Leopold, J., Maron, B. Molecular Mechanisms of Pulmonary Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 761 (2016).
- Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L363-L369 (2012).
- van Albada, M. E., et al. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. European Respiratory Journal. 26 (3), 487-493 (2005).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A. J., Berger, R. M. F. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: lessons from preclinical animal models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (6), L1013-L1032 (2009).
- Cahill, E., et al. The pathophysiological basis of chronic hypoxic pulmonary hypertension in the mouse: vasoconstrictor and structural mechanisms contribute equally. Experimental Physiology. 97 (6), 796-806 (2012).
- Okada, K., et al. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. American Journal of Pathology. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- Happé, C. M., et al. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Tanaka, Y., Schuster, D. P., Davis, E. C., Patterson, G. A., Botney, M. D. The role of vascular injury and hemodynamics in rat pulmonary artery remodeling. Journal of Clinical Investigation. 98 (2), 434-442 (1996).
- Nishimura, T., Faul, J. L., Berry, G. J., Kao, P. N., Pearl, R. G. Effect of a surgical aortocaval fistula on monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Critical Care Medicine. 31 (4), 1213-1218 (2003).
- Linardi, D., et al. Ventricular and pulmonary vascular remodeling induced by pulmonary overflow in a chronic model of pretricuspid shunt. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (6), 2609-2617 (2014).
- White, R. J., et al. Plexiform-like lesions and increased tissue factor expression in a rat model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L583-L590 (2007).
- Samson, N., Paulin, R. Epigenetics, inflammation and metabolism in right heart failure associated with pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (3), 572-587 (2017).
