Summary
A roedor pneumonectomia esquerda é uma técnica valiosa na investigação de hipertensão pulmonar. Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o procedimento de pneumonectomia de rato e cuidados pós-operatórios para garantir mínima morbidade e mortalidade.
Abstract
Neste protocolo, detalhamos os passos processuais corretos e precauções necessárias para com êxito executar uma pneumonectomia esquerda e induzir PAH em ratos com a administração adicional de monocrotaline (MCT) ou SU5416 (Sugen). Podemos também comparar esses dois modelos para outros modelos PAH comumente utilizados na investigação. Nos últimos anos, o foco dos modelos animais PAH mudou-se para estudar o mecanismo de angioproliferation de lesões plexiforme, no qual o papel do fluxo sanguíneo pulmonar aumentado é considerado como um gatilho importante no desenvolvimento da severa pulmonar remodelação vascular. Um dos mais promissores modelos de roedores de hiperfluxo pulmonar é a pneumonectomia esquerda unilateral, combinada com um hit"segundo" do MCT ou Sugen. A remoção do pulmão esquerdo leva ao fluxo sanguíneo pulmonar aumentado e turbulento e remodelação vascular. Atualmente, não há nenhum procedimento detalhado da cirurgia pneumonectomia em ratos. Este artigo detalha um protocolo passo a passo do procedimento cirúrgico pneumonectomia e cuidados pós-operatórios em ratos Sprague Dawley masculinos. Resumidamente, o animal é anestesiado e o peito é aberto. Uma vez que a artéria pulmonar esquerda, veia pulmonar e brônquio são visualizados, eles são ligados e o pulmão esquerdo é removido. Em seguida, fechado no peito e o animal recuperado. O sangue é forçado a circular apenas no pulmão direito. Este aumento da pressão vascular leva a uma remodelação progressivo e oclusão de pequenas artérias pulmonares. O segundo hit do MCT ou Sugen é usado uma semana depois da cirurgia para induzir disfunção endotelial. A combinação do aumento do fluxo sanguíneo no pulmão e disfunção endotelial produz grave PAH. A principal limitação deste procedimento é que ele requer habilidades cirúrgicas gerais.
Introduction
Hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença progressiva e fatal, caracterizada por um aumento no fluxo sanguíneo pulmonar, aumento da resistência vascular, inflamação e remodelação de pequenos vasos sanguíneos pulmonares1. Esta remodelação geralmente resulta em lesões vasculares que obstruam e obliterar pequenas artérias pulmonares, causando vasoconstrição e aumento de pós-carga do ventrículo direito2. Existem alguns tratamentos farmacológicos bem sucedidos de PAH; Como consequência, restos de mortalidade PAH altas. Recentemente, o foco da pesquisa sobre a Patobiológico da hipertensão pulmonar mudou-se para um mecanismo de angio-proliferação, em que o papel do fluxo sanguíneo pulmonar aumentado é considerado como um gatilho importante no desenvolvimento da pulmonar vascular remodelação de3,4.
Modelos animais de hipertensão pulmonar forneceram introspecções críticas que ajudam a explicar a fisiopatologia da doença e têm servido como uma plataforma para a droga, celular, gene e entrega de proteína. Tradicionalmente, o modelo de hipertensão pulmonar induzida pela hipóxia crônica e o modelo de lesão pulmonar MCT têm sido os principais modelos utilizados para estudar PAH fisiopatologia5. No entanto, eles não são suficientes para produzir o padrão de fluxo e neointimal de sangue pulmonar aumentada de remodelação em relação às alterações descritas em pacientes humanos. O modelo de hipóxia crônica em roedores resulta em espessamento das paredes de vasos com vasoconstrição hipóxica sem angio-obliteração dos pequenos vasos pulmonares6. Além disso, a condição de hipóxia é reversível. Assim, o modelo de hipóxia não também é suficiente para produzir grave PAH. O modelo de lesão pulmonar MCT provocar alguma disfunção endotelial mas complexas vasculares obliterative lesões encontradas em humanos com HAP primária grave não desenvolvem no2ratos. Além disso, os ratos tratados com MCT tendem a morrer de toxicidade pulmonar induzida pelo MCT, doença hepática veno-oclusiva e miocardite em vez de PAH2. Finalmente, a pneumonectomia sozinha não é suficiente para produzir lesões neointimal em pequenos vasos pulmonares em um curto período de tempo. Depois a pneumonectomia, há mínima elevação na pressão arterial pulmonar7. Em humanos, a pneumonectomia é bem tolerada quando o pulmão contralateral é saudável7.
No entanto, o procedimento de pneumonectomia esquerda combinado com MCT ou Sugen é vantajoso uma vez que imita o fluxo sanguíneo pulmonar aumentado e resulta em remodelação vascular pulmonar comparável à Hap clínica grave. A pneumonectomia é executada no pulmão esquerdo, que tem apenas 1 lobo, em vez do direito, que possui quatro lóbulos. Se o pulmão direito foi removido, o animal seria incapaz de compensar a insuficiência respiratória. No modelo de pneumonectomia-MCT, neointimal padrão de remodelação desenvolve-se em mais de 90% dos animais operados tratados7. Da mesma forma, a combinação dos resultados Sugen e pneumonectomia em HAP grave, caracterizada por lesões vasculares angio-obliterative, proliferação, apoptose e RV disfunção8. O procedimento de pneumonectomia esquerda também é vantajoso em comparação com outros procedimentos cirúrgicos para induzir PAH. Anteriormente descritos modelos em ratos para aumentar o fluxo sanguíneo pulmonar para os pulmões incluem o aorto-caval shunt ou anastomose da artéria subclávia-pulmonar. Estes modelos são extremamente complicado7,9,10,11. Para realizar uma derivação aorto-caval, abdômen do animal tem que ser aberto. O shunt é colocado na aorta abdominal, que aumenta o fluxo sanguíneo para os órgãos abdominais em vez de apenas os pulmões, assim, PAH leva muito mais tempo para desenvolver. Além disso, é difícil determinar o fluxo de sangue através do shunt, Considerando que com a pneumonectomia, o sangue flui para as restantes duplas de pulmão. A anastomose da artéria subclávia-pulmonar também tem muitas complicações. O fluxo de sangue arterial na veia pode levar a trombose da anastomose e sangramento. Como a derivação aorto-caval, é difícil determinar o fluxo de sangue através da anastomose. Além disso, é uma técnica difícil e cara que requer habilidades cirúrgicas vasculares. A pneumonectomia esquerda unilateral duplica o fluxo sanguíneo e da tensão de cisalhamento no pulmão contralateral e, em combinação com MCT ou Sugen, faz com que os resultados típicos de hemodinâmicos e histopatológicos de PAH, que é a célula endotelial dano8, 12.
A novidade deste manuscrito é apresentada no protocolo cirúrgico muito detalhado e abrangente da pneumonectomia esquerda em ratos e na discussão dos desafios técnicos e fisiológicos destes modelos. Porque este protocolo não está atualmente disponível, muitos investigadores acreditam que o modelo é muito difícil usar. Os investigadores que tenham realizado a pneumonectomia esquerda têm enfrentado alta mortalidade e taxas de morbidade associadas com a perda desnecessária de animais, comprometendo a avaliação científica. Em vez disso, muitos vai usar modelos clássicos como MCT injeção, hipóxia crônica ou apenas a pneumonectomia criar PAH. No entanto, estes modelos são muito menos eficazes do que a combinação de MCT ou Sugen com a pneumonectomia esquerda. O objetivo principal deste artigo é fornecer o protocolo cirúrgico primeiro detalhado e reproduzível para a pneumonectomia esquerda unilateral em ratos e fornecer o melhor modelo cirúrgico de PAH. Combinar este protocolo para pneumonectomia unilateral à esquerda com MCT ou SU5416 permitirá que os investigadores criar um modelo muito mais eficaz e clinicamente relevante de grave PAH para estudar a patogênese desta doença fatal.
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Protocol
Os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da faculdade de medicina da Icahn no Monte Sinai. Todos os ratos receberam atendimento humano em conformidade com o Monte Sinai "Guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório".
1. preparação para a cirurgia
- Autoclave Cooley-Mayo curvo tesoura (grande tesoura), tesoura de íris reta (tesoura pequena), tesoura Iris McPherson-Vannas (tesoura de costas), fórceps de tecido Rehbein (Pinças atraumáticas), fórceps do tecido do Gerald, espéculo fio liso (auto de retenção retractor), cauterizador de pequeno vaso, gaze, duas extremidades sonda, da fina agulha vascular e pinça hemostática de Micro-Jacobson mosquito (mosquito).
2. preparação e intubação de ratos
- Administre uma injeção subcutânea de analgesia de buprenorfina (0,1 mg/kg) em ratos de Sprague-Dawley machos, 6 – 8 semanas de idade, 30 min antes da cirurgia.
- Coloque o rato individualmente em uma câmara exposta a 4% de isoflurano e oxigênio (1 L/min) por 3 – 4 min até que o rato está devidamente anestesiado (ou seja, inconsciente, respirando lentamente e não responde ao toque ou som).
-
Intubação de ratos
- Remover o rato da câmara e o rato para uma placa de fita para que o rato plana deita de costas, com a boca na borda da placa. Use a sequência de caracteres para segurar o rato pelos dois dentes da frente para que o pescoço permanece plana-hetero.
- Coloque uma fonte de luz da fibra óptica ganso acima do pescoço sobre a laringe, levantar e segurar a língua com os dedos e mover a epiglote para visualizar as cordas vocais. A traqueia deve ser iluminada por trás das cordas vocais; ajuste a posição da luz até a traqueia é brilhante.
- Entubar os ratos inserindo um cateter 16G a laringe dentro 60 s de remoção o rato da câmara como acordam rapidamente. Se o rato acorda antes da intubação bem sucedida, volte a colocar o rato e repita.
- Imediatamente, ligue o rato ao ventilador para retomar a entrega de isoflurano e oxigênio. Confirme a intubação usando um espelho frio para observar a condensação da umidade no ar exalado do cateter. Certifique-se que o animal ainda é respirar pela expansão do tórax.
- Ligue o rato ao ventilador. Definir o oxigênio flua em 1 L/min. definir a taxa de ventilação de 70 respirações por minuto com um volume tidal de 0,35 – 0,45 mL. Conjunto de pressão expiratória final positiva (PEEP) para 2-4 cm H2o isoflurano O. reduzir para 2-3%.
- Coloque o rato sob o microscópio na posição de decúbito direito sobre uma almofada de aquecimento a 37 ° C. Tape as pernas dianteiras para baixo. Depilar o tórax esquerdo para trás a perna da frente até o final da caixa torácica com clippers. Limpe a área cirúrgica com gaze e 10% solução de iodo-povidona, seguida por 70% de etanol (três vezes).
- Coloque o oxímetro de pulso no pé do rato e monitorar a frequência cardíaca e saturação de oxigênio durante a cirurgia. Frequência cardíaca deve estar entre 200-500 bpm e oxigênio de saturação deve ser > 95%.
3. preparação do ambiente estéril
- Visualize a área cirúrgica sob o microscópio. Isto deve ser feito primeiro, porque não pode ser ajustado ao microscópio, uma vez que o ambiente é estéril.
- Colocar luvas estéreis, cirúrgicas. Não toque em nada além dos instrumentos esterilizados, a e cirúrgicos da área cirúrgica do corpo do rato.
- Coloque um pano estéril sobre o corpo do rato e na bandeja do instrumento para criar um ambiente estéril.
- Com luvas estéreis, coloque instrumentos esterilizados sobre a bandeja de instrumentos esterilizados.
4. esquerdo pneumonectomia procedimento cirúrgico
- Use tesoura Cooley-Mayo e Gerald tecido fórceps cortar um furo pequeno no cirúrgico drapeja. O furo deve estar a cerca de 2 – 3 cm de diâmetro para visualizar totalmente a incisão, mas não muito grande para que apenas esterilizados a pele é exposta.
- Fazer uma incisão longa lateral de 2 cm no tórax esquerdo usando uma lâmina cirúrgica. Use gaze e a caneta eletrocautério para gerenciar hemostasia sangramento/manter. Use a tesoura de Cooley-Mayo para cortar cada camada de tecido até as costelas e músculos intercostais são expostos.
-
Entrando no espaço Intercostal
- Use o mosquito para fazer um furo através do músculo do terceiro espaço intercostal.
- Use a sonda de dupla ponta para mover o pulmão do caminho para visualizar a artéria pulmonar. O investigador pode entrar outro espaço intercostal se a artéria pulmonar não é acessível.
- Tesoura de íris uso e McPherson-Vannas tesoura de íris (tesoura de costas) para abrir os músculos intercostais para aproximadamente 1 – 2 cm. Use a caneta eletrocautério para parar qualquer sangramento.
- Coloque um pequeno, auto retenção afastador para segurar as costelas e músculos abra.
- Abra apenas a pleura esquerda e mova o pulmão esquerdo baixo no abdômen para permitir o acesso à artéria pulmonar e brônquio. Carrega um hemoclip médio para o aplicador de clip ligating.
-
Ligadura do brônquio principal esquerdo e artéria pulmonar esquerda
- Levante a parte superior do pulmão esquerdo cuidadosamente com a pinça atraumática de Rehbein para expor a artéria pulmonar.
- Clip a artéria pulmonar, fechando o clipe e o aplicador em torno da artéria. Tenha cuidado para não fechar ou romper a veia Ázigos à esquerda. Não fixar demasiada força caso contrário, a embarcação pode romper.
- Abra a incisão mais usando a tonsila para separar as fibras musculares.
- Carrega outro hemoclip médio para o aplicador de clip ligating para que está pronto.
- Use a pinça atraumática para levantar a parte inferior do pulmão fora a incisão até o brônquio principal esquerdo e a veia pulmonar esquerda são visualizados. Pinça atraumática deve ser usado puxar para mover o pulmão, cima e para fora da incisão. Desde que o pulmão é muito grande para ser puxado para fora em um movimento sem rasgar o tecido, a pinça de emissão é necessária para manter o pulmão no lugar enquanto a pinça atraumática é usada com cuidado para retirar mais pulmão.
- Ligam o brônquio principal esquerdo e a veia pulmonar principal esquerda juntos, fechando o aplicador em torno deles. Não fixar a veia e brônquio também com força de caso contrário, a embarcação pode romper.
- Remova o pulmão com uma tesoura. Tenha cuidado para não cortar ou arrancar o clipe. Use um pequeno pedaço de gaze esterilizada para absorver qualquer sangue e certifique-se de que não há nenhuma hemorragia.
-
Encerramento das costelas e músculos intercostais
- Antes de fechar os músculos intercostais, inserir um cateter 16G na cavidade torácica, longe da incisão cirúrgica e no sétimo espaço intercostal. Certifique-se que o investigador pode visualizar a agulha para não perfurar qualquer órgãos vitais ou vasos.
- Retire imediatamente a agulha, deixando o cateter no lugar. Isso será usado como um dreno de tórax.
- Feche as costelas e músculos intercostais com uma sutura de prolene 4-0.
- Feche a pele e subcutâneo espaço com uma sutura de execução 5-0 (Tabela de materiais).
- Lugar uma sutura de 5-0 (Tabela de materiais) na pele e em torno do peito do tubo, então quando o tubo é removido, o buraco vai ser amarrado fechar.
- Evacue o ar da cavidade pleural com uma seringa de 3 mL através do cateter para recuperar a pressão negativa normal no tórax. Imediatamente, prenda o cateter com um porta-agulha para evitar o ar de volta na cavidade torácica. Remover o cateter rapidamente e amarrar a sutura para fechar o buraco.
5. no pós-operatório recuperação
- Coloque o animal na posição esternal. Desligar o isoflurano, mas continue dando o oxigênio do rato através do tubo endotraqueal. Não deixe o animal sem vigilância em qualquer ponto até que ele recuperou a consciência suficiente para deambular e o animal com segurança em sua jaula.
- Administre 2-3 mL de solução de Ringer lactato estéril por via subcutânea.
- Monitorar a frequência cardíaca (bpm ≈200 – 500), saturação de oxigênio (≥ 95%), e animal cor para confirmar o animal está a respirar bem.
- Quando o animal começa a fazer movimentos de respiração espontânea e movimentos do pescoço e responde a estímulos físicos (tais como olhos alargando, movendo-se de nariz e orelhas respondendo ao som), os tubos do animal, puxando para fora o cateter e desconectar o ventilador.
- Devolver o animal para uma gaiola vazia, longe da companhia de outros animais. O animal deve ficar sozinho pelo menos 3 dias.
- Para controle da dor, administre 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea a cada 12 h por 3 dias.
6. administração do "Segundo golpe" MCT ou Sugen
- Administre 1 mL de MCT (60 mg/kg) ou 1 mL de Sugen (25 mg/kg) via subcutânea, 1 semana após a cirurgia.
7. terminal colheita
- Sete semanas após a administração de MCT ou Sugen, coloque o animal em uma câmara com fluxo de oxigênio (1 L/min) e 4% de isoflurano.
- Conecte o animal ao ventilador através do cone de nariz. Manter o fluxo de oxigênio e abaixar o isoflurano para 2,5-3%. Coloque o animal em suas costas e fita para baixo todos os membros.
- Raspe o animal ao longo do abdômen inteiro.
-
Abrindo o peito
- Fazer uma incisão no peito com um bisturi do notch subclávia para o xyphoid.
- Use a pinça de tecido para manter o xyphoid. Corte o esterno com a tesoura de Cooley-Mayo até o coração e a artéria pulmonar são totalmente acessíveis. Use o eletrocautério para parar o sangramento. Segure que as costelas abrir com um afastador.
- Identifica a artéria pulmonar. Ajuste a orientação do coração, se necessário, pela adição de gaze por baixo. Use um cateter IV de 20g para punção da artéria pulmonar entre a válvula pulmonar e a bifurcação da artéria pulmonar principal. Avançar apenas o cateter 20G na artéria e retire a agulha. Avance o cateter de pressão Transônica de Fr 1.2 no cateter IV que é a artéria pulmonar. Uma vez que a curva de PA é constante, grave a pressão pelo menos 10 s. Repita estes passos para registar a pressão no ventrículo direito.
- Remova o coração e os pulmões. Coloque pedaços do pulmão em formol para ser fixado em parafina e corados com hematoxilina e eosina.
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Representative Results
De acordo com o sistema de classificação aceites, hipertensão pulmonar caracteriza-se por uma pressão média de artéria pulmonar (PAPm) excedeu os limites superiores da pressão normal de artéria pulmonar (i.e., 25 mm Hg). No grupo MCT + pneumonectomia, grave PAH desenvolvido por dia 21, com um aumento PAPm (Figura 1). A PAPm é calculado pela fórmula:
As pressões sistólica e diastólica RV e PA e foram medidos com o cateter de pressão na artéria pulmonar principal conectado ao sistema de vantagem PV. A pressão arterial pulmonar média (PAPm) foi calculado usando a fórmula acima. No grupo controle (n = 20), a pressão média da PA foi 18.6±1.76 mm Hg (Figura 1). No grupo MCT + pneumonectomia (n = 30), a PAPm aumentou 2,25 vezes mais em relação ao grupo controle (41.9±2.89 mm Hg) (Figura 1). No grupo de Sugen + pneumonectomia (n = 30), a PAPm era três vezes maior do que no grupo controle (53±6.60 mm Hg). O MCT e o Sugen grupos, o RVSP foi muito mais alto comparado ao grupo controle (Figura 1).
Histopatologia do tecido pulmonar de ratos foi realizada com hematoxilina e eosina coloração seguido de imagem com um microscópio óptico. No pulmão normal, não há espaço entre os alvéolos e as estruturas alveolares são aparentes. Os vasos são claras e de espessura normal (Figura 2A). No pulmão PAH, há evidências de remodelação, espessamento das paredes dos vasos, grave constrição dos vasos, inflamação e arterite pulmonar focal (Figura 2B, C).
Figura 1: grave hipertensão arterial pulmonar na pneumonectomia esquerda combinado com modelo MCT. Diferenças significativas na PAPm e RVSP entre o grupo controle e pneumonectomia grupo MCT e o grupo controle e pneumonectomia + Sugen grupo. Os dados são apresentados como média SEM. Os p-valores foram calculados usando um teste de post hoc One-Way ANOVA e Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fotomicrografias representativas de H & E mancha do tecido pulmonar. (A) do tecido pulmonar Normal. O pulmão de rato normal, as artérias (seta vermelha) estão abertas e as paredes dos vasos são normais de tamanho. (B) patologia vascular de remodelação em ratos de hipertensão arterial pulmonar tratada com pneumonectomia e MCT. O pulmão mostra focal arterite pulmonar e inflamação, concêntrico medial espessamento das paredes dos vasos (seta branca) e espessamento da íntima concêntrico de paredes dos vasos (seta preta), resultando em severamente restrito dos navios. (C) patologia vascular PAH ratos tratados com pneumonectomia e Sugen a remodelação. Os pulmões também mostram focal arterite pulmonar e inflamação, concêntrico medial espessamento das paredes dos vasos (seta branca) e concêntrico espessamento da íntima das paredes dos vasos (seta preta). Os lúmens desses vasos são severamente restrito e/ou totalmente fechados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nos pulmões afetados PAH, proliferação vascular com formação neointimal e obliteração das artérias pulmonares resultar em graves alterações hemodinâmicas, insuficiência ventricular direita e precoce mortalidade7,8. As alterações às paredes do vaso aumentam a resistência ao fluxo sanguíneo, aumentando a pressão arterial e ventrículo direito. Nas fases iniciais de PAH, geralmente 3 semanas após a administração de MCT ou Sugen, ratos desenvolveram alterações histológicas inespecíficas como hipertrofia medial, espessamento adventícia e muscularization das pequenas artérias e arteríolas. Essas alterações são potencialmente reversíveis. Nas fases posteriores, cerca de 6-8 semanas após a administração de MCT ou Sugen, pulmões de ratos têm neointimal e vasculopatia plexiforme que obstruir e obliterar a médias e pequenas artérias pulmonares e arteríolas, proliferação celular da íntima, e concêntricos fibrose da íntima. Lesões plexiforme geralmente consistem de um plexo de canais revestidos por células endoteliais e miofibroblastos. Em muitos casos, estas alterações estão associadas a edema intersticial e fibrose, obstrução tromboembólica de distais pequenas artérias pulmonares, a recanalização parcial de um Trombosadas muscular dos vasos e necrose fibrinoide12.
Conforme mencionado anteriormente, ratos em outros modelos PAH não desenvolvem obliteração vascular dos pequenos vasos neointimal e lesões plexiforme e altas pressões PA e RV. O tratamento com o modelo PAH hipóxia crônica foi encontrado para produzir algum espessamento dos vasos, mas os navios permanecem abertos e existem sem lesões vasculares obliterative e pequena inflamação5. RVSP e PAPm valores são ligeiramente elevados em comparação com o controle5. Da mesma forma, o tratamento com MCT ou pneumonectomia resultou na pressão arterial pulmonar que não eram significativamente mais elevados do que os ratos controle e ligeiramente remodelada navios7,9.
Por outro lado, nós encontramos que a pneumonectomia esquerda combinada com MCT ou Sugen é um modelo eficaz para criar grave PAH. Comparado ao grupo controle, a pressão arterial pulmonar média (PAPm) e a pressão sistólica de ventrículo direito (RVSP) em ratos com HAP grave quase dobraram (Figura 1). Além disso, estes ratos desenvolveram lesões plexiforme, espessamento da íntima e medial concêntrico, obstrução tromboembólica de distais pequenas artérias pulmonares, inflamação e muito elevado de artéria pulmonar e ventrículo direito pressões (Figura 2 ). Em comparação com a hipóxia crônica, injeção de MCT e pneumonectomia modelos única de PAH realizada em outros estudos, a pneumonectomia combinada com MCT ou Sugen modelo cria uma condição clinicamente relevante. Além disso, este modelo, se realizada corretamente, tem uma taxa de mortalidade intra-operatória quase 0% e apenas uma 10% mortalidade taxa pós-recuperação de falha do pulmão direito para compensar a insuficiência respiratória. Taxas mais elevadas de mortalidade intra-operatória ou pós-recuperação é geralmente indicativo de que o erro humano ou equipamento tenha ocorrido.
A fim de realizar a pneumonectomia esquerda e criar PAH com êxito, há várias etapas críticas neste protocolo que devem ser concluídas. Em primeiro lugar, é muito importante monitorar a saturação de oxigênio do animal, capnografia e contando com a frequência cardíaca ao longo de todo o procedimento para garantir que o animal está a respirar e seu coração está batendo. Monitorização de saturação de oxigênio adicional confirma intubação endotraqueal adequada. Intubar o animal é absolutamente necessário para este procedimento. Quando a cavidade do peito do animal é aberta, a pressão negativa que existe normalmente na cavidade torácica é deslocada para a pressão atmosférica. Ratos, portanto, precisam ser fornecido com pressão positiva através de ventilação artificial. Sem intubação apropriada, os pulmões do animal entrará em colapso da pressão atmosférica positiva.
A incisão cirúrgica deve ser feita lateralmente ou posterolaterally e no terceiro espaço intercostal. Dependendo da anatomia do rato, o cirurgião pode ter que abrir um espaço intercostal diferente a fim de acessar o pulmão e visualizar os vasos. Usar outras abordagens tornará muito difícil chegar a artéria pulmonar esquerda. Ao abrir a cavidade torácica, é muito importante usar uma caneta eletrocautério para parar o sangramento da pele, músculos e em torno dos navios. Se o investigador pula esta etapa, o animal vai perder sangue e menos oxigênio circulará. A incisão deve ser um mínimo de 2 cm de comprimento para que haja espaço suficiente para tirar o pulmão inteiro quando ligar. Caso contrário, o investigador rasgará o tecido ao tentar remover o pulmão de uma pequena abertura. Também é essencial usar Pinças atraumáticas ao mover o pulmão para evitar a ruptura do tecido e hemorragia. A artéria pulmonar é fechada para evitar sangramento da manipulação dos pulmões. O investigador deve ter muito cuidado quando ligar os vasos para evitar fechamento os esquerda ázigos veia ou rasgar os vasos, caso contrário, o animal vai morrer. Além disso, é muito mais fácil para o cirurgião usar hemoclips de titânio ao invés de suturas para ligate a artéria pulmonar esquerda, deixou o brônquio principal e esquerdas veias pulmonares com uma sutura. Porque o investigador tem que fazer uma incisão relativamente longa no espaço intercostal, é necessário fechar os músculos intercostais e costelas com suturas. Quando o peito estiver fechado, o ar tem que ser evacuado do peito para restaurar a pressão negativa e é importante evitar distorção contralateral do pulmão e do coração com um pneumotórax fechado.
Finalmente, recuperação é um dos passos mais importantes após a pneumonectomia de rato. A toracotomia é considerada uma cirurgia muito dolorosa e analgésicos são essenciais para promover uma ventilação adequada, melhorar excursões pulmonar no pós-operatório e reduzir a dor. Ratos devem ser recuperados em posição esternal para maximizar a inflação de pulmão. Depois de 10 min, o investigador pode diminuir a taxa de ventilação para ajudar a estimular o animal para respirar por conta própria e acordar. Se o animal torna-se cianótica e diminuem os níveis de saturação de oxigênio, é necessário aumentar o oxigênio, a taxa de ventilação e aumentar o volume corrente a 5ml ou mais dependendo da capacidade do ventilador. Extubação dos ratos deve ser feita mais tarde possível, uma vez que o animal está totalmente acordado. O investigador pode colocar o rato extubado em uma câmara com o oxigênio só flui para ajuda ainda mais a recuperação.
Se a técnica for executada corretamente e as considerações acima referidas são abordadas, realizar uma pneumonectomia unilateral esquerda combinado com MCT ou Sugen cria um modelo fiável de PAH severa do que a hipóxia sozinha, MCT ou outros métodos. Quando a pneumonectomia é executada corretamente, o animal sobrevive, o procedimento tem uma duração curta (15-30 min) e o investigador não precisa de habilidades cirúrgicas vasculares específicas. Além disso, o investigador é capaz de criar com êxito PAH. As limitações desse método são que uma toracotomia é um procedimento invasivo, intubação endotraqueal é necessária, e o investigador precisa de algumas habilidades cirúrgicas gerais. As lesões neointimal pulmonar vascular oclusiva e no aumento pronunciado da pressão de artéria pulmonar semelhante aos pacientes de hipertensão pulmonar humana é evidente em ratos após a combinação de pneumonectomia com MCT ou SU5416 injeção7 , 8 , 9. o presente modelo é um método confiável para estudar o papel do estouro pulmonar no pulmão contralateral e hipertensão pulmonar induzida por fluxo.
Este protocolo pode ser útil para estudar outras doenças. É possível usar este modelo para estudar o crescimento compensatório de tecido pulmonar no pulmão contralateral. Esta técnica também pode ser usada para estudar e desenvolver tratamentos para a insuficiência de ventrículo direito (RVF). Hipertrofia do ventrículo direito severa se desenvolve em animais que desenvolvem lesões neointimal de aumento da pressão arterial7. RVF provoca a morte em cerca de 70% dos pacientes com HAP13. Aumento do fluxo sanguíneo pulmonar pode ser útil para estudar e desenvolver tratamentos para pacientes que sofrem de doenças cardíacas congênitas também.
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Disclosures
Os autores não têm nenhum potenciais conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este manuscrito foi apoiado pelo NIH conceder 7R01 HL083078-10 concede a AHA American Heart Association-17SDG33370112 e o nacional institutos de saúde NIH K01 HL135474 de Y.S. e institutos nacionais de saúde R01 HL133554, de Sara
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
References
- Leopold, J., Maron, B. Molecular Mechanisms of Pulmonary Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 761 (2016).
- Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L363-L369 (2012).
- van Albada, M. E., et al. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. European Respiratory Journal. 26 (3), 487-493 (2005).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A. J., Berger, R. M. F. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: lessons from preclinical animal models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (6), L1013-L1032 (2009).
- Cahill, E., et al. The pathophysiological basis of chronic hypoxic pulmonary hypertension in the mouse: vasoconstrictor and structural mechanisms contribute equally. Experimental Physiology. 97 (6), 796-806 (2012).
- Okada, K., et al. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. American Journal of Pathology. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- Happé, C. M., et al. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Tanaka, Y., Schuster, D. P., Davis, E. C., Patterson, G. A., Botney, M. D. The role of vascular injury and hemodynamics in rat pulmonary artery remodeling. Journal of Clinical Investigation. 98 (2), 434-442 (1996).
- Nishimura, T., Faul, J. L., Berry, G. J., Kao, P. N., Pearl, R. G. Effect of a surgical aortocaval fistula on monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Critical Care Medicine. 31 (4), 1213-1218 (2003).
- Linardi, D., et al. Ventricular and pulmonary vascular remodeling induced by pulmonary overflow in a chronic model of pretricuspid shunt. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (6), 2609-2617 (2014).
- White, R. J., et al. Plexiform-like lesions and increased tissue factor expression in a rat model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L583-L590 (2007).
- Samson, N., Paulin, R. Epigenetics, inflammation and metabolism in right heart failure associated with pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (3), 572-587 (2017).
