Summary
La neumonectomía izquierda roedor es una técnica valiosa en la investigación de la hipertensión pulmonar. Aquí, presentamos un protocolo para describir el procedimiento de Neumonectomía de rata y cuidado postoperatorio para mortalidad y morbilidad mínima.
Abstract
En este protocolo, detallamos el procedimiento correcto y las precauciones necesarias para realizar una Neumonectomía izquierda y PAH de inducir en las ratas con la administración adicional de monocrotaline (MCT) con éxito o SU5416 (Sugen). También comparamos estos dos modelos a otros modelos PAH usados en la investigación. En los últimos años, el enfoque de modelos animales de la PAH ha avanzado hacia el estudiar el mecanismo de angioproliferation de las lesiones plexiformes, en el que el papel del flujo de sangre pulmonar creciente es considerado como un disparador importante en el desarrollo de severa pulmonar remodelado vascular. Uno de los modelos de roedores más prometedoras de aumento del flujo pulmonar es el unilateral Neumonectomía izquierda combinado con un "segundo golpe" de MCT o Sugen. La eliminación del pulmón izquierdo conduce al flujo sanguíneo pulmonar creciente y turbulento y remodelado vascular. Actualmente, no hay ningún procedimiento detallado de la cirugía de Neumonectomía en ratas. Este artículo detalla un protocolo paso a paso del procedimiento quirúrgico de Neumonectomía y cuidados postoperatorios en ratas Sprague-Dawley macho. Brevemente, el animal está anestesiado y el pecho se abre. Una vez que se visualizaron la arteria pulmonar izquierda, la vena pulmonar y el bronquio, se unen y se extrae el pulmón izquierdo. Luego cerró el pecho y el animal se recuperó. Sangre es forzada a circular sólo en el pulmón derecho. Este aumento de la presión vascular conduce a una progresiva remodelación y oclusión de pequeñas arterias pulmonares. El segundo golpe de MCT o Sugen es usada una semana después de la cirugía para inducir disfunción endotelial. La combinación de aumento del flujo sanguíneo en el pulmón y la disfunción endotelial produce HAP severa. La principal limitación de este procedimiento es que requiere habilidades quirúrgicas generales.
Introduction
Hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad progresiva y fatal caracterizada por un aumento de flujo sanguíneo pulmonar, aumento de la resistencia vascular, inflamación y remodelación de los vasos sanguíneos pulmonares pequeños1. Esta remodelación usualmente resulta en lesiones vasculares que obstruyen y borrar pequeñas arterias pulmonares, causando vasoconstricción y aumento de la poscarga del ventrículo derecho2. Existen algunos tratamientos farmacológicos Exitos de PAH; como consecuencia, restos de PAH la mortalidad alta. Recientemente, el foco de investigación en Patobiología de la hipertensión pulmonar se ha movido hacia un mecanismo en el que el papel del flujo de sangre pulmonar creciente es considerado como un disparador importante en el desarrollo de pulmonar vascular angio-proliferación remodelación de3,4.
Modelos animales de hipertensión pulmonar han proporcionado penetraciones críticas que ayudan a explicar la fisiopatología de la enfermedad y han servido como una plataforma para drogas, celulares, gene y proteína entrega. Tradicionalmente, el modelo de hipertensión pulmonar inducida por hipoxia crónica y el modelo de lesión de pulmón MCT han sido los principales modelos utilizados para el estudio de la patofisiología PAH5. Sin embargo, no son suficientes para producir el patrón creciente de la sangre pulmonar flujo y neointimal de remodelación frente a las alteraciones descritas en pacientes humanos. El modelo de hipoxia crónica en roedores produce engrosamiento de las paredes del recipiente con la vasoconstricción hipóxica sin angio-obliteración de los vasos pulmonares pequeños6. Además, la condición de hipoxia es reversible. Así, el modelo de hipoxia también no es suficiente para producir HAP severa. El modelo de lesión pulmonar MCT provocar alguna disfunción endotelial pero el complejo obliterativa las lesiones vasculares encontradas los seres humanos con HAP primaria severa no se convierten en ratas2. Además, las ratas tratadas con MCT tienden a morir de la toxicidad pulmonar inducida por el MCT, Enfermedad veno-oclusiva del hígado y miocarditis en lugar de PAH2. Finalmente, la neumonectomía sola no es suficiente para producir lesiones neointimal en los pequeños vasos pulmonares en un período corto de tiempo. Después de la Neumonectomía, hay mínima elevación en la presión arterial pulmonar7. En los seres humanos, la neumonectomía es bien tolerada cuando el pulmón contralateral es sano7.
Sin embargo, el procedimiento de Neumonectomía izquierda combinado con MCT o Sugen es ventajoso ya que imita el flujo de sangre pulmonar creciente y resultados en la remodelación vascular pulmonar comparable a PAH clínica severa. La neumonectomía se realiza en el pulmón izquierdo, que tiene sólo 1 lóbulo, en lugar de a la derecha, que tiene cuatro lóbulos. Si le extirparon el pulmón derecho, el animal sería incapaz de compensar la insuficiencia respiratoria. En el modelo de Neumonectomía-MCT, neointimal patrón de remodelación se convierte en más del 90% de animales operados tratados7. Del mismo modo, la combinación de resultados Sugen y Neumonectomía en HAP severa, caracterizada por lesiones vasculares angio-obliterativa, proliferación, apoptosis y RV disfunción8. El procedimiento de Neumonectomía izquierda también es ventajoso en comparación con otros procedimientos quirúrgicos para inducir la PAH. Previamente descritos modelos en ratas para aumentar el flujo sanguíneo pulmonar a los pulmones incluyen la derivación aortocaval o anastomosis de arteria subclavia-pulmonar. Estos modelos son extremadamente complicado7,9,10,11. Para realizar una derivación aorto-caval, abdomen del animal tiene que ser abierto. La derivación se coloca en la aorta abdominal, que aumenta el flujo sanguíneo a todos los órganos abdominales en lugar de a los pulmones, por lo tanto, toma mucho más tiempo para desarrollar HAP. Además, es difícil determinar el flujo de sangre a través de la desviación, mientras que con la neumonectomía la sangre fluir a los dobles de pulmón restante. La anastomosis de la arteria subclavia-pulmonar también tiene muchas complicaciones. El flujo de sangre arterial en la vena puede llevar a la trombosis de la anastomosis y sangrado. Como la desviación aorto-caval, es difícil determinar el flujo de sangre a través de la anastomosis. Además, es una técnica costosa y difícil que requiere de habilidades quirúrgicas vasculares. La neumonectomía izquierda unilateral duplica el flujo sanguíneo y la tensión de esquileo en el pulmón contralateral y, en combinación con MCT o Sugen, provoca los resultados hemodinámicos e histopatológicos típicos de PAH que es la célula endotelial daño8, 12.
La novedad de este manuscrito se presenta en el protocolo quirúrgico muy detallado y completo de la neumonectomía izquierda en ratas y en la discusión de los desafíos técnicos y fisiológicos de estos modelos. Ya que este Protocolo no está disponible actualmente, muchos investigadores creen que el modelo es demasiado difícil. Los investigadores que han realizado la neumonectomía izquierda enfrentan alta tasas de mortalidad y morbilidad asociadas a la pérdida innecesaria de animales, comprometer la evaluación científica. En cambio, muchos utilizan modelos clásicos como inyección de MCT, hipoxia crónica o a la neumonectomía para crear PAH. Sin embargo, estos modelos son mucho menos eficaces que la combinación de MCT o Sugen con la neumonectomía izquierda. El propósito principal de este artículo es proporcionar el protocolo quirúrgico primero detallado y reproducible para la neumonectomía izquierda unilateral en ratas y proporcionar el mejor modelo quirúrgico de PAH. Combinar este protocolo para Neumonectomía unilateral izquierda con MCT o SU5416 permitirá a los investigadores a crear un modelo mucho más eficaz y clínicamente relevante de HAP severa para el estudio de la patogenia de esta enfermedad fatal.
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Protocol
Los procedimientos descritos a continuación han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la escuela de medicina de Icahn en el Monte Sinaí. Todas las ratas recibieron atención humanitaria cumple con el Monte Sinaí "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio".
1. preparación para la cirugía
- Autoclave Cooley-Mayo curva tijeras (tijeras grandes), tijera Iris recta (pequeñas tijeras), tijeras de Vannas McPherson Iris (tijera trasera), tejido de Wangensteen pinzas (pinzas atraumáticas), Gerald tejido fórceps, espéculo de alambre llano (uno mismo-conservando retractor), Cauterizador de vaso pequeño, gasas, sonda doble, portaagujas vascular fina y Jacobson Micro pinzas hemostáticas de mosquito (mosquito).
2. preparación e intubación de ratas
- Administrar una inyección subcutánea de buprenorfina analgesia (0.1 mg/kg) en ratas Sprague-Dawley macho, de 6 – 8 semanas de edad, de 30 min antes de la cirugía.
- Colocar la rata individualmente en una cámara expuesta a isoflurano 4% y oxígeno (1 L/min) durante 3-4 minutos hasta que la rata es anestesiada adecuadamente (es decir, inconsciente, respirando lentamente y no responde al tacto o sonido).
-
Intubación de ratas
- Quite la rata de la cámara y la rata a un tablero con cinta adhesiva para que la rata pone plana sobre su espalda, con la boca en el borde de la Junta. Use cadena para sostener la rata por los dos dientes frontales para que el cuello quede plana recta.
- Coloque una fuente luminosa de fibra óptica ganso arriba del cuello sobre la laringe, levante y sostenga la lengüeta con los dedos y mueva la epiglotis hacia arriba para visualizar las cuerdas vocales. La tráquea debe estar brillantemente encendida detrás de las cuerdas vocales; Ajuste la posición de la luz hasta que la tráquea es brillante.
- Intubación las ratas insertando un catéter 16 G en la laringe dentro de 60 s de la eliminación de la rata de la cámara como se despiertan rápidamente. Si la rata despierta antes de la intubación exitosa, volver a la rata y repita.
- Conecte inmediatamente la rata al ventilador para reanudar la entrega de isoflurano y el oxígeno. Confirmar la intubación con un frío espejo para observar la condensación de la humedad en el aire espirado del catéter. Asegúrese de que el animal todavía es respirar por la expansión del pecho.
- Conectarse el ventilador a la rata. Conjunto el oxígeno a flujo de 1 L/min ajustar la velocidad de ventilación a 70 respiraciones/min con un volumen de 0,35-0,45 mL. Establezca la presión final expiratoria positiva (Pío) en 2-4 cm H2O. reducir isoflurano al 2 – 3%.
- Colocar la rata en el microscopio en posición de decúbito derecho sobre una almohadilla térmica a 37 ° C. Las patas delanteras de la cinta hacia abajo. Afeitarse el tórax izquierdo detrás de la pata delantera hasta el final de la caja torácica con clippers. Limpiar la zona quirúrgica con solución de povidona-yodo Gasa y 10%, seguido de etanol al 70% (tres veces).
- Coloque el pulsioxímetro en pie de Ratoncito y monitorear la frecuencia cardíaca y saturación de oxígeno durante la cirugía. Frecuencia cardíaca debe estar entre 200 – 500 bpm y el oxígeno de saturación debe ser > 95%.
3. preparación de ambiente estéril
- Visualizar el área quirúrgico bajo el microscopio. Esto debe hacerse en primer lugar porque el microscopio no se puede ajustar una vez que el ambiente es estéril.
- Colóquese guantes estériles quirúrgicos. ¡No toque nada además de los instrumentos esterilizados, las cortinas quirúrgicas y el área quirúrgico del cuerpo de la rata.
- Colocar un paño estéril sobre el cuerpo de la rata y en la bandeja del instrumento para crear un ambiente estéril.
- Con guantes estériles, colocar instrumentos estériles en la bandeja del instrumento estéril.
4. procedimiento quirúrgico izquierdo Neumonectomía
- Utilice tijeras Mayo Cooley y Gerald tejido pinzas para cortar un pequeño agujero en el paño quirúrgico. El agujero debe ser aproximadamente 2 – 3 cm de diámetro para visualizar completamente la incisión pero no demasiado grande para que solamente esterilizan la piel está expuesta.
- Hacer una incisión de 2 cm largo lateral en el tórax izquierdo utilizando una cuchilla quirúrgica. Utilizar una gasa y el lápiz de electrocauterio para administrar hemostasia hemorragia/mantener. Utilice las tijeras de Mayo Cooley para cortar cada capa de tejido hasta que las costillas y músculos intercostales.
-
Entrar en el espacio Intercostal
- Utilice el mosquito para hacer un agujero a través del músculo del tercer espacio intercostal.
- Utilice la punta de prueba de dos extremos para mover el pulmón hasta visualizar la arteria pulmonar. El investigador puede introducir otro espacio intercostal si la arteria pulmonar no es accesible.
- Uso iris tijeras y tijeras de iris de Vannas McPherson (tijera trasera) para abrir los músculos intercostales a unos 1-2 cm. utilizan el lápiz de electrocauterio para detener cualquier sangrado.
- Colocar un pequeño, uno mismo-conservando retractor para sostener las costillas y los músculos abren.
- Abra sólo la pleura izquierda y bajar el pulmón izquierdo más bajo en el abdomen para permitir el acceso a la arteria pulmonar y bronquio. Cargar un hemoclip mediano en el aplicador de clip adherente.
-
Ligadura del bronquio principal izquierdo y arteria pulmonar principal izquierda
- Levante la parte superior del pulmón izquierdo cuidadosamente con las pinzas atraumáticas de Wangensteen para exponer la arteria pulmonar.
- Clip de la arteria pulmonar por el cierre de la pinza y aplicador alrededor de la arteria. Tenga cuidado de no cerrar o ruptura de la vena ácigos izquierda. No sujetar con demasiada fuerza en caso contrario, el buque puede romperse.
- Abra la incisión utilizando más la amígdala para separar las fibras musculares.
- Cargar otro hemoclip mediano en el aplicador de clip adherente para que esté listo.
- Utilice las pinzas atraumáticas para levantar la parte inferior de los pulmones fuera de la incisión hasta el bronquio principal izquierdo y la vena pulmonar izquierda se visualizan. Pinzas atraumáticas deben ser usado pull para mover los pulmones y salga de la incisión. Puesto que el pulmón es demasiado grande para ser sacado en un solo movimiento sin rasgar el tejido, el fórceps número son necesario para mantener el pulmón en lugar mientras que las pinzas atraumáticas se utilizan cuidadosamente para sacar más del pulmón.
- Ligar el bronquio principal izquierdo y la vena pulmonar principal izquierda juntos cerrando el aplicador a su alrededor. No sujetar la vena y bronquio demasiado enérgicamente lo contrario, el recipiente puede romperse.
- Extirpar el pulmón con unas tijeras. Tenga cuidado de no cortar o rasgar hacia fuera el clip. Utilice un trozo de gasa estéril para absorber sangre y no Asegúrese de sangrado.
-
Cierre de las costillas y músculos intercostales
- Antes de cerrar los musculos intercostales, inserte un catéter 16 G en la cavidad torácica de la incisión quirúrgica y en el séptimo espacio intercostal. Asegúrese de que el investigador puede visualizar la aguja para que no perfore cualquier órganos vitales o vasos.
- Retire inmediatamente la aguja, dejando el catéter en su lugar. Esto se utilizará como un tubo de tórax.
- Cerca de las costillas y músculos intercostales con una sutura de prolene 4-0.
- Cerca de la piel y el espacio subcutáneo con una sutura de 5-0 de corriente (Tabla de materiales).
- Lugar una sutura 5-0 (Tabla de materiales) en la piel y alrededor del pecho del tubo por lo que cuando se retira la sonda, el orificio se va atado cerrado.
- Evacuar el aire de la cavidad pleural con una jeringa de 3 mL a través del catéter para recuperar la presión negativa normal en el tórax. Inmediatamente fijar el catéter con un sostenedor de la aguja para evitar que el aire va hacia atrás en la cavidad torácica. Rápidamente Retire el catéter y la sutura para cerrar el agujero de lazo.
5. postoperatorio recuperación
- Coloque el animal en posición esternal. Apague el isoflurano, pero seguir dando el oxígeno de la rata a través de tubo endotraqueal. No descuide el animal en cualquier momento hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para andar y el animal en su jaula.
- Administrar 2-3 mL de solución de Ringer entibiada estéril por vía subcutánea.
- Monitorear el ritmo cardíaco (≈200 – 500 bpm), saturación de oxígeno (≥95%), y animal color para confirmar el animal está respirando bien.
- Cuando el animal comienza a hacer movimientos de la respiración espontánea y movimientos del cuello y responde a estímulos físicos (tales como ojos ampliación, movimiento de nariz y orejas respondiendo al sonido), extubar el animal tirando hacia afuera de la sonda y desconectar el ventilador.
- Devolver los animales a una jaula vacía, de la compañía de otros animales. El animal debe estar solo durante al menos 3 días.
- Para controlar el dolor, administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea cada 12 h durante 3 días.
6. administración de "Segundo golpe" MCT o Sugen
- Administrar 1 mL de MCT (60 mg/kg) o 1 mL de Sugen (25 mg/kg) vía subcutánea, una semana después de la cirugía.
7. terminal cosecha
- Siete semanas después de la administración de MCT o Sugen, colocar al animal en una cámara con oxígeno que fluye (1 L/min) y 4% de isoflurano.
- Conectar el animal con el ventilador a través del cono de nariz. Mantener el flujo de oxígeno y baje el isoflurano a 2.5 – 3%. Coloque el animal en su espalda y la cinta hacia abajo de todos los miembros.
- Afeitarse el animal a lo largo de la totalidad del abdomen.
-
Abrir el pecho
- Hacer una incisión por el pecho con un bisturí de la muesca de la subclavia al xyphoid.
- Utilice el tejido pinzas para sujetar el xyphoid. Cortar el esternón con las tijeras de Cooley-Mayo hasta que el corazón y la arteria pulmonar son totalmente accesibles. Utilizar el electrocauterio para detener el sangrado. Mantenga que las costillas abiertas con un retractor.
- Identificar la arteria pulmonar. Ajustar la orientación del corazón, si es necesario, mediante la adición de Gasa por debajo. Utilizar un catéter de 20 G IV para punzar la arteria pulmonar entre la válvula pulmonar y la bifurcación de la arteria pulmonar principal. Avance sólo el catéter de 20 G en la arteria y retirar la aguja. Haga avanzar el catéter de presión transónicos 1.2 de Fr en el catéter IV en la arteria pulmonar. Una vez que la curva de la PA es constante, grabar la presión al menos 10 s. repetir estos pasos para registrar la presión en el ventrículo derecho.
- Quitar el corazón y los pulmones. Colocar el pulmón en formol para ser fijados en parafina y teñidas con hematoxilina y eosina.
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Representative Results
Según el sistema de clasificación aceptado, la hipertensión pulmonar se caracteriza por una presión de arteria pulmonar media (PAPM) superior a los límites superiores de presión de arteria pulmonar normal (es decir, de 25 mm Hg). En la neumonectomía + grupo MCT, HAP severa desarrollada por día 21 con una PAPM mayor (figura 1). El mPAP se calcula por la fórmula:
Las presiones sistólicas y diastólicas, RV y PA y fueron medidos con el catéter de presión en la arteria pulmonar principal conectado a la instalación fotovoltaica de ventaja. Las presiones arteriales pulmonares media (PAPM) se calculó mediante la fórmula anterior. En el grupo control (n = 20), la presión media de la PA fue 18.6±1.76 mm Hg (figura 1). En la neumonectomía + grupo MCT (n = 30), la PAPM aumentó 2,25 veces más en comparación con el grupo de control (41.9±2.89 mm Hg) (figura 1). En el grupo Sugen + neumonectomía (n = 30), la PAPM fue tres veces mayor que en el grupo de control (53±6.60 mm Hg). En grupos los MCT y Sugen, la RVSP fue mucho mayor en comparación con el grupo control (figura 1).
La histopatología del tejido pulmonar de rata se realizó con hematoxilina y eosina seguido de la proyección de imagen con un microscopio óptico de luz. En el pulmón normal, hay espacio entre los alvéolos y las estructuras alveolares son evidentes. Los vasos son clara y de grosor normal (figura 2A). En el pulmón de la PAH, hay evidencia de remodelación, engrosamiento de las paredes del vaso, severa constricción de los vasos y arteritis pulmonar focal (figura 2B, C).
Figura 1: hipertensión arterial pulmonar severa en la neumonectomía izquierda combinado con modelo MCT. Diferencias significativas en la PAPM y RVSP entre el grupo control y Neumonectomía grupo MCT y el grupo control y Neumonectomía + grupo Sugen. Los datos se presentan como media SEM. Los valores de p fueron calculados usando una prueba post-hoc ANOVA y Tukey unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: microfotografías representativas de H & E tinción de tejido pulmonar. (A) tejido de pulmón Normal. En el pulmón de la rata normal, las arterias (flecha roja) están abiertas y las paredes del recipiente son normales de tamaño. (B) patológicos vasculares remodelado en ratas de la hipertensión arterial pulmonar tratan con Neumonectomía y MCT. El pulmón muestra arteritis pulmonar focal e inflamación, engrosamiento medial concéntrica de las paredes del vaso (flecha blanca) y engrosamiento intimal concéntrica de las paredes del vaso (flecha negra), dando por resultado severamente estrechos vasos. (C) patológicos vasculares remodelación en PAH ratas tratadas con Neumonectomía y Sugen. Los pulmones muestran también arteritis pulmonar focal e inflamación, engrosamiento medial concéntrico de paredes de los vasos (flecha blanca) y engrosamiento intimal concéntrica de las paredes del vaso (flecha negra). Los lúmenes de estos vasos están severamente restringidos o totalmente cerrados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En pulmones afectados de PAH, proliferación vascular con formación neointimal y obliteración de las arterias pulmonares resultan en cambios hemodinámicos severos, insuficiencia ventricular derecha y temprana mortalidad7,8. Los cambios en las paredes del recipiente aumentan resistencia al flujo sanguíneo, aumento de la presión arterial y ventricular derecha. En las primeras etapas de la PAH, generalmente 3 semanas después de la administración de MCT o Sugen, ratas desarrollaron cambios histológicos inespecíficos como hipertrofia medial, engrosamiento adventicial y muscularization de las arterias pequeñas y arteriolas. Estos cambios son potencialmente reversibles. En los estadios, alrededor de 6 – 8 semanas tras administración de MCT o Sugen, pulmones de rata tienen neointimal y vasculopatía plexiforme que obstruye y destruye medio y arterias pulmonares pequeñas y arteriolas, celular proliferación intimal, y concéntrico fibrosis intimal. Lesiones plexiformes consisten en generalmente un plexo de canales alineados por miofibroblastos y las células endoteliales. En muchos casos, estos cambios se asocian a edema intersticial y fibrosis, obstrucción tromboembólica de distales pequeño las arterias pulmonares, recanalización parcial de una thrombosed vasos musculares y necrosis fibrinoide12.
Como se indicó anteriormente, las ratas en otros modelos de la PAH no desarrollan obliteración vascular de los vasos pequeños, neointimal y lesiones plexiformes y altas presiones PA y RV. Tratamiento con el modelo PAH de hipoxia crónica fue encontrado para producir un engrosamiento de vasos pero los vasos permanecen abiertas y hay ninguna lesión vascular obliterativa y poca inflamación5. Valores RVSP y mPAP son ligeramente elevados en comparación con el control5. Semejantemente, tratamiento con MCT o Neumonectomía dio lugar a las presiones arteriales pulmonares que no fueron significativamente mayores que las ratas control y ligeramente remodelación vasos7,9.
Por el contrario, se encontró que la neumonectomía izquierda combinado con MCT o Sugen es un modelo eficaz para crear HAP severa. En comparación con el grupo control, la presión arterial pulmonar media (PAPM) y la presión sistólica ventricular derecha (RVSP) en ratas con HAP severa casi doblado (figura 1). Además, estas ratas desarrollaron lesiones plexiformes, engrosamiento medial y intimal concéntrico, obstrucción tromboembólica de arterias pulmonares pequeñas distales y muy elevada de la arteria pulmonar y las presiones ventriculares derecha (figura 2 ). Frente a la hipoxia crónica, inyección de MCT y modelos sólo Neumonectomía de PAH en otros estudios, la neumonectomía combinado con modelo MCT o Sugen crea una condición clínicamente relevante. Además, este modelo, si se realiza correctamente, tiene una tasa de casi 0% mortalidad intraoperatoria y sólo un 10% mortalidad tasa después de la recuperación de la falta del pulmón derecho para compensar la insuficiencia respiratoria. Mayores tasas de mortalidad intraoperatoria o después de la recuperación es generalmente indicativo de que ha producido errores humanos o equipos.
Para realizar la neumonectomía izquierda y crear PAH con éxito, hay varios pasos críticos en este protocolo que debe ser completado. En primer lugar, es muy importante vigilar el animal la saturación de oxígeno, capnografía y contando la frecuencia cardíaca a lo largo de todo el procedimiento para asegurar el animal respira y late su corazón. Monitorización de la saturación de oxígeno más confirma la correcta intubación. Intubación del animal es absolutamente necesaria para este procedimiento. Cuando se abre la cavidad de pecho del animal, la presión negativa que existe normalmente en la cavidad torácica se desplaza a presión positiva atmosférica. Así, las ratas necesitan contar con presión positiva mediante ventilación artificial. Sin intubación adecuada, los pulmones del animal se derrumbará de la presión atmosférica positiva.
La incisión quirúrgica debe realizarse lateralmente o posterolaterally y en el tercer espacio intercostal. Dependiendo de la anatomía de la rata, el cirujano puede tener que abrir un espacio intercostal diferente para acceder a los pulmones y visualizar los vasos. Utilizando otros enfoques hará muy difícil llegar a la arteria pulmonar izquierda. Al abrir la cavidad torácica, es muy importante utilizar un lápiz de electrocauterio para detener el sangrado de la piel, los músculos y alrededor de los vasos. Si el investigador omite este paso, el animal pierde sangre y menos oxígeno circulará. La incisión debe ser un mínimo de 2 cm de largo para que haya suficiente espacio para sacar el pulmón entero cuando la ligadura. De lo contrario, el investigador rasgan el tejido al tratar de extirpar el pulmón de una pequeña abertura. También es esencial usar pinzas atraumáticas cuando se mueve el pulmón para evitar la ruptura del tejido y hemorragia. La arteria pulmonar se cierra primero para evitar el sangrado de la manipulación de los pulmones. El investigador debe ser muy cuidadoso cuando la ligadura de los vasos para evitar el cierre de la vena ácigos izquierdas o rasgado de lo contrario los vasos, el animal morirá. Además, es mucho más fácil para el cirujano uso de hemoclips de titanio en lugar de suturas para ligar la arteria pulmonar izquierda, izquierdo el bronquio principal y la izquierda las venas pulmonares con una sutura. Porque el investigador tiene que hacer una incisión relativamente largo en el espacio intercostal, es necesario cerrar los músculos intercostales y las costillas con las suturas. Una vez que el pecho se cierra, aire tiene que ser evacuado del tórax para restaurar la presión negativa y es importante evitar la distorsión de corazón y pulmón contralateral con un neumotórax cerrado.
Por último, recuperación es uno de los pasos más críticos después de la neumonectomía de rata. Una toracotomía es una cirugía muy dolorosa y analgésicos son esenciales para promover la ventilación adecuada, mejorar excursiones de pulmón en el período postoperatorio y reducir el dolor. Las ratas deben recuperarse en posición esternal para maximizar la inflación pulmonar. Después de 10 min, el investigador puede disminuir la tasa de ventilación para ayudar a estimular el animal para respirar por sí mismo y despertar. Si el animal se vuelve cianótico y disminuyen sus niveles de saturación de oxígeno, es necesario aumentar el oxígeno, la tasa de ventilación y aumentar el volumen a 5 mL o más dependiendo de la capacidad del ventilador. Extubación de las ratas debe realizarse lo más tarde posible, una vez que el animal esté totalmente despierto. El investigador puede poner la rata extubados en una cámara con oxígeno a flujo ayuda a la mayor recuperación.
Si la técnica se ejecuta correctamente y se tratan las consideraciones mencionadas, realizar una Neumonectomía izquierda unilateral combinada con MCT o Sugen crea un modelo fiable de HAP severa que hipoxia sola, MCT u otros métodos. La neumonectomía se realiza correctamente, el animal sobrevive, el procedimiento tiene una duración corta (15-30 min) y el investigador no necesita habilidades quirúrgicas vasculares específicos. Además, el investigador es capaz de crear con éxito PAH. Las limitaciones de este método son que una toracotomía es un procedimiento invasivo, se requiere la intubación endotraqueal y el investigador necesita algunas habilidades quirúrgicas generales. Las lesiones oclusivas vasculares pulmonares neointimal y los aumentos pronunciados en la arteria pulmonar presión similar a los pacientes de hipertensión pulmonar humana son evidentes en las ratas después de la combinación de Neumonectomía con MCT o SU5416 inyección7 , 8 , 9. el modelo actual es un método fiable para estudiar el papel de desbordamiento pulmonar en el pulmón contralateral y la hipertensión pulmonar inducida por el flujo.
Este protocolo puede ser útil para el estudio de otras enfermedades. Es posible usar este modelo para estudiar el crecimiento compensatorio del tejido pulmonar en el pulmón contralateral. Esta técnica puede utilizarse también para estudiar y desarrollar tratamientos para la insuficiencia ventricular derecha (RVF). Hipertrofia severa de ventrículo derecho se desarrolla en animales que desarrollan lesiones neointimal de aumento de la presión arterial7. FVR causa la muerte en aproximadamente el 70% de los pacientes con PAH13. Aumentando el flujo sanguíneo pulmonar puede ser útil para el estudio y desarrollo de tratamientos para pacientes que sufren de enfermedades cardiacas congénitas así.
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Disclosures
Los autores no tienen ninguna posibles conflictos de interés.
Acknowledgments
Este manuscrito fue apoyado por los NIH grant 7R01 HL083078-10 becas de la Asociación Americana del corazón AHA-17SDG33370112 y de los institutos nacionales de salud NIH K01 HL135474 a Y.S. y de los institutos nacionales de salud R01 HL133554 a izquierda
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
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