Summary
De knaagdieren links Pneumectomie is een waardevolle techniek in pulmonale hypertensie onderzoek. Hier presenteren we een protocol om te beschrijven de rat Pneumectomie procedure en postoperatieve zorg aan minimale morbiditeit en mortaliteit.
Abstract
In dit protocol, detailleren wij de juiste procedurele stappen en de nodige voorzorgsmaatregelen nemen om met succes uitvoeren van een linker Pneumectomie en PAH induceren bij ratten met de extra toediening van monocrotaline (MCT) of SU5416 (Sugen). Ook vergelijken we deze twee modellen tot andere PAH-modellen vaak in onderzoek worden gebruikt. In de afgelopen jaren, is de focus van PAH diermodellen verhuisd naar het bestuderen van het mechanisme van de angioproliferation van Meervormige laesies, waarin de rol van pulmonaire verhoogde bloedtoevoer wordt beschouwd als een belangrijke trigger in de ontwikkeling van ernstige pulmonale vasculaire remodeling. Een van de meest veelbelovende knaagdier modellen van verhoogde pulmonaire flow is de eenzijdige linker Pneumectomie gecombineerd met een 'tweede hit' van MCT of Sugen. De verwijdering van de linker long leidt tot verhoogde en turbulente pulmonaire doorbloeding en vasculaire remodeling. Op dit moment is er geen gedetailleerde procedure voor de chirurgie van de Pneumectomie bij ratten. Dit artikel geeft een stapsgewijze protocol van de Pneumectomie chirurgische ingreep en post-operatieve zorg bij mannelijke Sprague-Dawley ratten. Kortom, het dier wordt verdoofd en de borst wordt geopend. Zodra de linker longslagader longader en de bronchiën worden gevisualiseerd, ze als ligatuur zijn verbonden en de linker long wordt verwijderd. De borst is dan gesloten en het dier teruggevorderd. Bloed is gedwongen om te circuleren alleen op de juiste Long. Deze toegenomen vasculaire druk leidt tot een progressieve remodelleren en occlusie van kleine pulmonary slagaders. De tweede honkslag van MCT of Sugen is gebruikte een week na operatie voor het opwekken van endotheel disfunctie. De combinatie van verhoogde bloedstroom in de longen en endotheel disfunctie produceert ernstige PAH. De belangrijkste beperking van deze procedure is dat het algemene chirurgische vaardigheden vereist.
Introduction
Pulmonale arteriële hypertensie (PAH) is een progressieve en dodelijke ziekte die wordt gekenmerkt door een toename van de pulmonaire bloedstroom, toegenomen vasculaire weerstand, ontsteking en verbouwing van kleine pulmonaire bloedvaten1. Deze remodelleren meestal resulteert in vasculaire laesies die te belemmeren en vernietigen van kleine pulmonary slagaders, waardoor de vasoconstrictie en toenemende rechterventrikel afterload2. Enkele succesvolle farmacologische behandelingen van PAH bestaan; Als gevolg, PAH-gerelateerde sterfte blijft hoog. Onlangs, de focus van het onderzoek naar de pathobiology van pulmonale hypertensie is verhuisd naar een mechanisme van angio-proliferatie waarin de rol van pulmonaire verhoogde bloedtoevoer wordt beschouwd als een belangrijke trigger in de ontwikkeling van de pulmonaire vasculaire het remodelleren van3,4.
Dierlijke modellen van pulmonale hypertensie hebben verstrekt kritische inzichten die helpen verklaren de pathofysiologie van de ziekte te hebben gediend als een platform voor drug-, cel-, gen- en eiwit levering. De chronische hypoxie-geïnduceerde pulmonale hypertensie en de MCT long letsel model hebben van oudsher de belangrijkste modellen gebruikt bij het bestuderen van PAH pathofysiologie5. Nochtans, zijn zij niet volstaat om verhoogde pulmonaire bloed stroom en neointimal patroon aan het remodelleren van in vergelijking tot wijzigingen beschreven in menselijke patiënten. Het model van chronische hypoxie in knaagdieren resulteert in verdikking van wanden met hypoxische vasoconstrictie zonder angio-vernietiging van kleine pulmonaire vaartuigen6. Bovendien is de toestand van hypoxie omkeerbaar. Het model van hypoxie is dus ook niet volstaat om ernstige PAH. De MCT long letsel model sommige endotheel disfunctie uitlokken maar de complexe vasculaire obliterative laesies gevonden bij mensen met ernstige primaire PAH niet ontwikkelen in de ratten2. Bovendien hebben MCT-behandelde ratten de neiging om te sterven uit Long MCT-geïnduceerde toxiciteit, veno-occlusieve leverziekte en myocarditis, in plaats van PAH2. Tenslotte is de Pneumectomie alleen niet voldoende voor de productie van neointimal laesies in de kleine pulmonaire bakken in een korte periode van tijd. Na de Pneumectomie is er minimale hoogte in pulmonaire arteriële druk7. Bij de mens, is de Pneumectomie wanneer de contralaterale Long gezonde7 isgoed verdragen.
De procedure van de linker Pneumectomie gecombineerd met MCT of Sugen is echter gunstig omdat het pulmonaire verhoogde bloedtoevoer nabootst en in de pulmonaire vasculaire remodeling vergelijkbaar met ernstige klinische PAH resulteert. De Pneumectomie wordt uitgevoerd op de linker long, die heeft slechts 1 kwab, in plaats van aan de rechterkant, die heeft vier kwabben. Als de juiste Long werd verwijderd, is het dier zou niet in staat om te compenseren voor de respiratoire insufficiëntie. In het Pneumectomie-MCT-model ontwikkelt neointimal patroon van het remodelleren in meer dan 90% van geëxploiteerd-behandelde dieren7. Ook de combinatie van Sugen en Pneumectomie resulteert in ernstige PAH, gekenmerkt door angio-obliterative vasculaire laesies, proliferatie, apoptosis en RV dysfunctie8. De linker Pneumectomie-procedure is ook voordelig in vergelijking met andere chirurgische procedures voor het opwekken van PAH. Eerder omvatten beschreven modellen bij ratten te verhogen van pulmonaire bloedtoevoer naar de longen de aorto-caval shunt of subclavian-pulmonaire slagader anastomose. Deze modellen zijn zeer ingewikkeld7,9,10,11. Voor het uitvoeren van een aorto-caval shunt, moet de buik van het dier worden geopend. De shunt wordt geplaatst in de abdominale aorta, waardoor de bloedtoevoer naar alle buikorganen in plaats van alleen de longen, dus pak duurt veel langer om te ontwikkelen. Bovendien is het moeilijk om te bepalen van de bloedstroom door de shunt, overwegende dat met de Pneumectomie het bloed stroom naar het resterende Long dubbelspel. De subclavian-pulmonaire slagader wapendrager heeft ook veel complicaties. De stroom van arteriële bloed in de ader kan leiden tot trombose van anastomose en bloeden. Zoals de aorto-caval shunt is het moeilijk om te bepalen van de bloedstroom door de anastomose. Bovendien, het is een dure en moeilijk techniek waarvoor vasculaire chirurgische vaardigheden. De unilaterale linker Pneumectomie verdubbelt bloedstroom en shear stress in de contralaterale Long en, in combinatie met MCT of Sugen, veroorzaakt de typische hemodynamische en histopathologische bevindingen van PAH oftewel endothelial cel schade8, 12.
De nieuwheid van dit manuscript wordt gepresenteerd in het zeer gedetailleerde en uitgebreide chirurgische protocol van de linker Pneumectomie bij ratten en bij de bespreking van de technische en fysiologische uitdagingen van deze modellen. Omdat dit protocol momenteel niet beschikbaar is, veel onderzoekers geloven dat het model is te moeilijk gebruik. Onderzoekers die tot het verrichten van de linker Pneumectomie geconfronteerd met hoge sterfte en morbiditeit tarieven die zijn gekoppeld aan het geen onnodige verlies van dieren, afbreuk te doen aan de wetenschappelijke beoordeling. In plaats daarvan zal veel klassieke modellen zoals MCT injectie, chronische hypoxie, of gewoon de Pneumectomie gebruiken om te maken van PAH. Deze modellen zijn echter veel minder effectief dan de combinatie van MCT of Sugen met de linker Pneumectomie. Het primaire doel van dit artikel is het eerste gedetailleerde en reproduceerbare chirurgische protocol voorzien de linker eenzijdige Pneumectomie bij ratten en bieden de beste chirurgische model van PAH. Dit protocol voor linker eenzijdige Pneumectomie te combineren met MCT of SU5416 kunnen onderzoekers om een veel effectiever en klinisch relevante model van ernstige pak te bestuderen van de pathogenese van deze fatale ziekte te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hieronder beschreven procedures zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de School of Medicine van Icahn op de berg Sinaï. Alle ratten ontvangen humane zorg met inachtneming van de berg Sinaï "Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren".
1. voorbereiding op de operatie
- Autoclaaf Cooley-Mayo gebogen schaar (grote schaar) met rechte Iris schaar (kleine schaar), McPherson-Vannas Iris schaar (terug schaar), Wangensteen weefsel pincet (atraumatische verlostang), Gerald weefsel pincet, gewone draad speculum (zelf behouden oprolmechanisme), klein schip cauterizer, gaas, tweepuntige sonde, dunne vasculaire naald houder en Micro-Jacobson mug hemostatische pincet (mug).
2. voorbereiding en intubatie van ratten
- Het beheren van een subcutane injectie van buprenorfine analgesie (0,1 mg/kg) in 6-8 weekse oude mannelijke, Sprague-Dawley ratten, 30 min. vóór de ingreep.
- De rat individueel plaatsen in een ruimte die is blootgesteld aan Isofluraan 4% en zuurstof (1 L/min) voor 3-4 minuten totdat de rat is goed verdoofd (d.w.z., onbewuste, langzaam, ademhaling en niet reageert op de aanraking of geluid).
-
Intubatie van ratten
- Verwijder de rat uit de zaal en tape van de rat op een bord, zodat de rat plat op zijn rug, met de mond op de rand van het bord legt. Gebruik string te houden van de rat door de twee voorste tanden zodat de nek flat/hetero blijft.
- Plaatst u een fiber optic gans-lichtbron boven de hals op het strottenhoofd, heffen en houdt de tong met vingers en het strotklepje omhoog naar het visualiseren van de stembanden. De luchtpijp moet fel verlicht worden achter de stembanden; de positie van het licht aanpassen totdat de luchtpijp helder is.
- Intubate van de ratten door het invoegen van een 16 G katheter in het strottenhoofd binnen 60 s van het verwijderen van de rat uit de zaal zoals ze wakker snel. Als de rat voor succesvolle intubatie ontwaakt, zet de rat terug en herhaal.
- Onmiddellijk de rat verbinding te maken met de ventilator te hervatten Isofluraan en zuurstof levering. Bevestig de intubatie met behulp van een koude spiegel te observeren condensatie van de luchtvochtigheid in de uitgeademde adem van de katheter. Zorg ervoor dat het dier is nog steeds ademhalen door de uitbreiding van de borst.
- De rat verbinden met de ventilator. Stel de zuurstof te stromen op 1 L/min. het ventilatie-tarief ingesteld op 70 adem/min met een ademhalingsvolume van 0.35 – 0,45 mL. Positief einde expiratoire druk (GLUREN) ingesteld op 2-4 cm H2O. verminderen Isofluraan tot 2 – 3%.
- Plaats de rat onder de Microscoop in de juiste decubitus positie op een verwarming pad bij 37 ° C. Tape de voorpoten naar beneden. Het scheren van de linker borstkas achter het voorste been tot het einde van de ribbenkast met clippers. Schoonmaken van het chirurgische gebied met gaas en 10% oplossing van Povidon-Jood, gevolgd door 70% ethanol (drie keer).
- Plaats van de Pulsoximeter voet van de rat en bewaken de hartslag en zuurstof saturatie gedurende de operatie. Hartslag moet tussen 200-500 bpm en zuurstof saturatie moet > 95%.
3. voorbereiding van de steriele omgeving
- Visualiseer het chirurgische gebied onder de Microscoop. Dit moet eerst worden gedaan omdat de microscoop kan niet worden aangepast zodra het milieu steriel is.
- Steriele chirurgische handschoenen zetten. Raak niet aan om het even wat naast de gesteriliseerde instrumenten, de afdeklakens en het chirurgische gebied van de rat's lichaam.
- Plaats een steriele draperen over de rat's lichaam en op de lade instrument een steriele omgeving te creëren.
- Met steriele handschoenen, steriele instrumenten op de steriele instrument lade te plaatsen.
4. linker Pneumectomie chirurgische ingreep
- Cooley-Mayo schaar en Gerald weefsel pincet gebruiken om een klein gat in de chirurgische draperen. Het gat moet ongeveer 2-3 cm in diameter volledig visualiseren de incisie maar niet te groot zodat alleen gesteriliseerd huid wordt blootgesteld.
- Maak een lang laterale incisie van 2 cm in de linker borstkas met een chirurgisch mes. Gaas en de elektrocauterisatie-pen gebruiken om te bloeden/handhaven hemostase beheren. Gebruik de schaar Cooley-Mayo te snijden van elke laag van weefsel, totdat de ribben en intercostale spieren worden blootgesteld.
-
Invoeren van intercostale ruimte
- Gebruik de mug om een gat in de spier van de derde intercostaalruimte.
- Gebruik de tweepuntige sonde te verplaatsen van de longen uit de weg te visualiseren van de longslagader. De onderzoeker kan een ander intercostale ruimte Voer als de longslagader niet toegankelijk is.
- Gebruik iris schaar en McPherson-Vannas iris schaar (terug schaar) om te openen de intercostale spieren tot ongeveer 1-2 cm. met de pen elektrocauterisatie gebruiken elke bloeden te stoppen.
- Plaats een kleine, zelfstandige behoud oprolmechanisme te houden van de ribben en spieren openen.
- Open alleen de linker pleura en de linker long omlaag lager in de buik toegang te verlenen tot de longslagader en de bronchiën. Laad een middellange hemoclip in de ligating clip-applicator.
-
Afbinding van de linker belangrijkste bronchiën en linker belangrijkste longslagader
- Til het bovenste gedeelte van de linker long zorgvuldig met de verlostang atraumatische Wangensteen bloot van de longslagader.
- Het bijknippen van de longslagader door het sluiten van de clip en de applicator rond de slagader. Wees voorzichtig niet te sluiten of scheuren van de ader van de linker azygos. Doe er niet te krachtig klem anders, het schip kan scheuren.
- Open de incisie verder met behulp van de tonsillen te scheiden van de spiervezels.
- Laad een andere middellange hemoclip in de ligating clip-applicator, zodat het klaar is.
- Gebruik van de atraumatische verlostang om te heffen van het onderste gedeelte van de longen uit de incisie tot de linker belangrijkste bronchiën en linker longader worden gevisualiseerd. Atraumatische verlostang moet trekken gebruikt voor het verplaatsen van de Long en buiten de incisie. Aangezien de Long te groot is om in één beweging zonder scheuren van het weefsel worden teruggetrokken, zijn de kwestie verlostang nodig om de Long op zijn plaats houden terwijl de atraumatische verlostang gewend bent zorgvuldig meer Long uitlichten.
- Afbinden de linker belangrijkste bronchiën en linker belangrijkste longader samen door het sluiten van de applicator om hen heen. Doen niet klem de ader en de bronchiën te krachtig anders, het schip kan scheuren.
- De longen verwijderen met een schaar. Wees voorzichtig niet te knippen of te scheuren uit de clip. Gebruik een kleine stuk steriel gaas te absorberen alle bloed en zorg ervoor dat er geen bloeding.
-
Sluiting van de ribben en intercostale spieren
- Alvorens te sluiten de intercostale spieren, plaatst u een 16 G katheter in de borstholte uit de buurt van de chirurgische incisie in de zevende intercostale ruimte. Zorg ervoor dat de onderzoeker de naald om niet doorprikken van vitale organen of vaartuigen kunt visualiseren.
- Onmiddellijk verwijderen van de naald, verlaten van de katheter op zijn plaats. Dit zal worden gebruikt als een buis van de borst.
- Sluit de ribben en intercostale spieren met een 4-0 prolene hechtdraad.
- Sluit de huid en de subcutane ruimte met een lopende 5-0 hechtdraad (Tabel van materialen).
- Plaats een 5-0 hechtdraad (Tabel van materialen) in de huid en rond de borst tube zodat wanneer de buis van de borst is verwijderd, het gat zal worden gekoppeld sluiten.
- Het evacueren van de lucht uit de pleurale holte met een spuit met 3 mL via de katheter te herwinnen van de normale onderdruk in de thorax. Klem onmiddellijk de katheter met een naald houder om te voorkomen dat lucht terug te gaan in de borstholte. Snel verwijderen van de katheter en binden van de hechtdraad om te sluiten van het gat.
5. post-operatieve herstel
- Plaats het dier in de sternale positie. De Isofluraan uitschakelen, maar blijven geven de rat zuurstof via endotracheale buis. Laat niet het dier zonder toezicht op elk gewenst moment totdat het voldoende bewustzijn om te ambulate heeft herwonnen en het dier veilig in zijn kooi is.
- 2 tot 3 mL steriele lactated Ringer's oplossing subcutaan beheren.
- Bewaken de hartslag (HSM ≈200-500), zuurstof saturatie (≥95%) en dierlijke kleur te bevestigen van het dier goed ademt.
- Wanneer het dier begint met het maken van spontane ademhaling bewegingen en bewegingen van de nek en reageert op fysieke stimuli (zoals ogen verbreding verplaatsen neus en oren reageren op geluid), extubate het dier door te trekken uit de katheter en verbreken van de ventilator.
- Het dier terug naar een lege kooi, uit de buurt van het gezelschap van andere dieren. Het dier moet alleen gedurende ten minste 3 dagen.
- Voor pijnbestrijding, 0,1 mg/kg van buprenorfine subcutaan elke 12 h voor 3 dagen te beheren.
6. beheer van de "Tweede Hit" MCT of Sugen
- 1 mL van MCT (60 mg/kg) of 1 mL Sugen (25 mg/kg) beheren via subcutane injectie, 1 week na de operatie.
7. de terminal oogst
- Zeven weken na toediening van MCT of Sugen, plaats het dier in een kamer met vloeiende zuurstof (1 L/min) en 4% Isofluraan.
- Sluit het dier aan de ventilator via de neus. Houden zuurstof stroomt en de Isofluraan tot 2,5-3% lager. Leg het dier op zijn rug en tape beneden alle ledematen.
- Het dier langs de hele buik scheren.
-
Opening van de borst
- Maken van een incisie beneden de borst met een scalpel vanaf de subclavian inkeping aan de xyphoid.
- Gebruik de verlostang weefsel te houden de xyphoid. Doorsnijden het borstbeen met de schaar Cooley-Mayo tot het hart en de longslagader volledig toegankelijk zijn. Gebruik de elektrocauterisatie om te stoppen met het bloeden. Houd dat de ribben openen met een oprolmechanisme.
- Het identificeren van de longslagader. De richting van het hart, indien nodig, aanpassen door het toevoegen van gaas onder. Gebruik een 20 G IV-katheter om het doorprikken van de longslagader tussen de pulmonale klep en de bifurcatie voor de belangrijkste longslagader. Verder alleen de 20 G katheter in de slagader en verwijder de naald. Voorschot de 1.2 Fr transsonische druk katheter in IV-katheter die is in de longslagader. Zodra de kromme PA stabiel is, opnemen de druk voor ten minste 10 s. Herhaal deze stappen om te nemen van de druk in het rechterventrikel.
- Verwijder het hart en de longen. Leg stukjes van de longen in formaline te worden vastgesteld in paraffine en gekleurd met haematoxyline en eosine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de geaccepteerde classificatiesysteem, wordt pulmonale hypertensie gekenmerkt door een gemiddelde longslagader druk (mPAP) meer dan de bovengrenzen van normale longslagader druk (dat wil zeggen, 25 mm Hg). In de Pneumectomie + MCT groep, ernstige PAH ontwikkeld door dag 21 met een verhoogde mPAP (Figuur 1). De mPAP wordt berekend door de formule:
Systolische en diastolische druk van RV en PA en werden gemeten met de katheter druk in de belangrijkste longslagader verbonden met het voordeel PV-systeem. De gemiddelde pulmonaire arteriële druk (mPAP) werd berekend aan de hand van de bovenstaande formule. In de controlegroep (n = 20), was de gemiddelde PA druk 18.6±1.76 mm Hg (Figuur 1). In de Pneumectomie + MCT groep (n = 30), de mPAP verhoogd 2,25 maal meer in vergelijking met de controlegroep (41.9±2.89 mm Hg) (Figuur 1). In de Pneumectomie + Sugen groep (n = 30), de mPAP was driemaal hoger dan in de controlegroep (53±6.60 mm Hg). In zowel de MCT en Sugen groepen, de RVSP was veel hoger ten opzichte van de controlegroep (Figuur 1).
Histopathologisch onderzoek van rat longweefsel werd uitgevoerd met behulp van de haematoxyline en eosine-kleuring gevolgd door beeldvorming met een optische licht microscope. In de normale Long, er is ruimte tussen de longblaasjes en de alveolaire structuren zijn duidelijk. De schepen zijn duidelijk en normale dikte (figuur 2A). In de PAH-Long is er bewijs van het remodelleren, verdikking van de wanden, ernstige vernauwing van schepen, ontsteking en focale pulmonaire arteritis (figuur 2B, C).
Figuur 1: ernstige pulmonale arteriële hypertensie in de linker Pneumectomie gecombineerd met MCT model. Significante verschillen in mPAP en RVSP tussen de controlegroep en Pneumectomie + MCT-groep en de controlegroep en Pneumectomie + Sugen groep. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel SEM. De p-waarden werden berekend aan de hand van een one-way ANOVA en Tukey post hoc test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: representatieve photomicrographs van H & E kleuring van longweefsel. (A) normaal longweefsel. In de normale rat Long, de slagaders (rode pijl) staan open en de wanden zijn normale grootte. (B) pathologische vasculaire remodeling bij ratten van pulmonale arteriële hypertensie behandeld met Pneumectomie en MCT. De Long toont focal pulmonaire arteritis en ontsteking, concentrische mediale verdikking van de wanden (witte pijl) en concentrische intima verdikking van de wanden (zwarte pijl), resulterend in ernstig beperkt vaartuigen. (C) pathologische vasculaire remodeling bij PAH ratten behandeld met Pneumectomie en Sugen. Deze longen Toon ook focal pulmonaire arteritis en ontsteking, concentrische mediale verdikking van de wanden (witte pijl) en concentrische intima verdikking van de wanden (zwarte pijl). De lumen van deze schepen zijn ernstig beperkt en/of volledig gesloten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In pak geteisterde longen, vasculaire proliferatie met neointimal formatie en de vernietiging van de pulmonary slagaders leiden tot ernstige hemodynamische veranderingen, rechts-ventriculaire storingen en vroegtijdige sterfte7,8. De wijzigingen in de wanden vergroten resistentie tegen doorbloeding, toenemende druk van arteriële en rechts ventriculaire In de vroege stadia van PAH ontwikkelde meestal 3 weken na het beheren van MCT of Sugen, ratten niet-specifieke histologische wijzigingen zoals mediale hypertrofie, adventitial verdikking en muscularization van de kleine slagaders en de arteriolen. Deze wijzigingen zijn potentieel omkeerbaar. In de latere stadia, ongeveer 6 tot 8 weken na de MCT of Sugen, beheert de rat's longen hebben neointimal en Meervormige vasculopathy die te belemmeren en vernietigen van middelgrote en kleine pulmonary slagaders en arteriolen, cellulaire intima proliferatie, en concentrisch Intima fibrose. Meervormige laesies bestaan meestal uit een plexus van kanalen omzoomd door endotheliale cellen en myofibroblasts. In veel gevallen deze wijzigingen zijn geassocieerd met interstitiële oedeem en fibrose, trombo-embolische obstructie van de distale kleine pulmonary slagaders, gedeeltelijke recanalization van een gespierde schepen van thrombosed, en fibrinoid necrose12.
Zoals eerder vermeld, ontwikkelen ratten in andere modellen van PAH vasculaire vernietiging van de kleine vaartuigen, neointimal en Meervormige laesies en hoge druk van de PA en RV niet. Behandeling met de chronische hypoxie PAH model werd gevonden om te produceren wat verdikking van schepen, maar de schepen blijven open en er zijn geen obliterative vasculaire laesies en weinig ontsteking5. RVSP en mPAP waarden zijn licht verhoogde vergeleken om te bepalen van5. Ook resulteerde behandeling met MCT of Pneumectomie in de pulmonaire arteriële druk die waren niet significant hoger dan controle ratten en lichtjes gerenoveerd vaartuigen7,9.
Omgekeerd, vonden we dat de linker Pneumectomie gecombineerd met MCT of Sugen een effectief model is te maken van ernstige PAH. In vergelijking met de controlegroep, verdubbeld de gemiddelde pulmonaire arteriële druk (mPAP) en de rechts-ventriculaire systolische druk (RVSP) bij ratten met ernstige PAH bijna (Figuur 1). Bovendien, ontwikkelde deze ratten Meervormige laesies, concentrische mediale en intima verdikking, trombo-embolische obstructie van de distale kleine pulmonary slagaders, ontsteking, en zeer verhoogde longslagader en rechts ventriculaire belasting (Figuur 2 ). Vergeleken met de chronische hypoxie, MCT injectie en de enige modellen Pneumectomie van PAK's uitgevoerd in andere studies, creëert de Pneumectomie gecombineerd met MCT of Sugen model een klinisch relevante voorwaarde. Bovendien, dit model als correct uitgevoerd heeft een bijna 0% intra-operatieve sterfte en slechts een 10% sterfte tarief na herstel van falen van de rechter long ter compensatie van respiratoire insufficiëntie. Hogere tarieven van intra-operatieve of na herstel sterfte is meestal indicatieve dat mens of apparatuur fout heeft plaatsgevonden.
Om met succes uitvoeren van het linker Pneumectomie en maakt van PAH, zijn er verschillende kritische stappen in dit protocol die moet worden voltooid. Ten eerste, het is zeer belangrijk voor het bewaken van het dier zuurstof saturatie, capnography en tellen van de hartslag tijdens de gehele procedure om het dier is ademen en zijn hart klopt. Controle van zuurstof saturatie verder bevestigt goede Endotracheale intubatie. Intubating van het dier is absoluut noodzakelijk voor deze procedure. Wanneer het dier de borstholte wordt geopend, is de onderdruk die normaal in de borstholte bestaat verschoven naar atmosferisch overdruk. Aldus, ratten moeten worden voorzien van positieve druk via kunstmatige ventilatie. Zonder juiste intubatie, zal het dier de longen instorten van de positieve luchtdruk.
De chirurgische incisie moet lateraal worden gemaakt of posterolaterally en in de derde intercostaalruimte. Afhankelijk van de anatomie van de rat wellicht de chirurg openen een verschillende intercostale ruimte om de toegang van de Long en visualiseren van de schepen. Met behulp van andere benaderingen zal het zeer moeilijk te bereiken de linker longslagader maken. Bij het openen van de borstholte, is het zeer belangrijk een elektrocauterisatie om pen te gebruiken om te stoppen met bloeden uit de huid, spieren, en de omliggende vaartuigen. Als de onderzoeker wordt deze stap overgeslagen, het dier bloed verliest en minder zuurstof zal circuleren. De incisie moet een minimum van 2 cm lang, zodat er voldoende ruimte om de hele Long als ligating. Anders, zal de onderzoeker de weefsel scheuren wanneer het proberen om de longen van een kleine opening. Het is ook essentieel om te atraumatische pincet gebruiken wanneer het bewegen van de longen om bezwijken van het weefsel en bloedingen te voorkomen. De longslagader is eerst gesloten om te voorkomen dat bloeden uit de manipulatie van de longen. De onderzoeker moet heel voorzichtig zijn wanneer de vaartuigen Voorkom sluiting ligating de linker azygos ader of scheuren van de vaartuigen anders, het dier zal sterven. Bovendien is het veel gemakkelijker voor de chirurg titanium hemoclips gebruiken in plaats van de hechtingen aan het afbinden van de linker longslagader, links belangrijkste bronchiën en linker pulmonary aders met een hechtdraad. Omdat de onderzoeker een relatief lange incisie in de intercostale ruimte maken moet, is het noodzakelijk om de intercostale spieren en ribben met hechtingen te sluiten. Zodra de borst wordt gesloten, lucht moet worden geëvacueerd uit de borst te herstellen van de negatieve druk en het is belangrijk om te voorkomen dat de contralaterale longen en hart vervorming met een gesloten pneumothorax.
Ten slotte is herstel een van de meest kritische stappen na de Pneumectomie van de rat. Een Thoracotomie wordt beschouwd als een zeer pijnlijke operatie en analgetica zijn essentieel voor voldoende ventilatie te bevorderen, Long excursies in de postoperatieve periode te verbeteren en pijn verminderen. Ratten zouden moeten sternale kunnen maximaliseren van longkanker inflatie hersteld worden. Na 10 min, kan de onderzoeker verminderen het ventilatie-tarief om te helpen stimuleren het dier om te ademen op eigen en wakker worden. Als het dier cyanotisch wordt en zuurstof saturatie niveaus dalen, is het noodzakelijke verhoging van de zuurstof, ventilatie tarief en ademhalingsvolume tot 5 mL of meer afhankelijk van de capaciteit van de ventilator verhoogd. Extubation van de ratten moet worden zo laat mogelijk, zodra het dier volledig wakker is. De onderzoeker kan de extubated rat gestoken in een kamer met alleen stromend zuurstof om het verdere herstel.
Als de techniek juist is uitgevoerd en de eerder genoemde overwegingen komen aan bod, het uitvoeren van een linker eenzijdige Pneumectomie gecombineerd met MCT of Sugen creëert een betrouwbaar model van ernstige pak dan MCT alleen, hypoxie of andere methoden. Wanneer de Pneumectomie wordt correct uitgevoerd, het dier overleeft, de procedure heeft een korte duur (15-30 min) en de onderzoeker heeft geen behoefte aan specifieke vasculaire chirurgische vaardigheden. Bovendien kan de onderzoeker PAH herstelpunt kunt maken. De beperkingen van deze methode zijn dat een Thoracotomie een invasieve procedure is Endotracheale intubatie vereist is en de onderzoeker sommige algemene chirurgische vaardigheden hoeft. De neointimal pulmonaire vasculaire occlusieve laesies en de uitgesproken stijging van de longslagader druk vergelijkbaar met menselijke pulmonale hypertensie patiënten zijn evident bij ratten na de combinatie van Pneumectomie met MCT of SU5416 injectie7 , 8 , 9. het huidige model is een betrouwbare methode om te studeren van de rol van pulmonaire overloop in de contralaterale Long- en stroom-geïnduceerde pulmonale hypertensie.
Dit protocol kan zinvol zijn voor de studie van andere ziekten. Het is mogelijk om dit model te gebruiken om te bestuderen van de compenserende groei van pulmonaire weefsel in de contralaterale Long. Deze techniek kan ook worden gebruikt om te bestuderen en ontwikkelen van behandelingen voor rechts-ventriculaire mislukking (RVF). Ernstige Rechterventrikel hypertrofie ontwikkelt in dieren die het ontwikkelen van neointimal laesies van verhoogde arteriële druk7. RVF veroorzaakt dood in ongeveer 70% van de patiënten met PAH13. Verhoging van de pulmonaire bloedstroom kan nuttig zijn voor studeren en het ontwikkelen van behandelingen voor patiënten die lijden aan congenitale hartziekten ook.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen potentiële conflicten van belang.
Acknowledgments
Dit manuscript werd gesteund door de NIH verlenen 7R01 HL083078-10 verleent van de American Heart Association AHA-17SDG33370112 en uit de nationale instituten van gezondheid NIH K01 HL135474 tot aan en van de nationale instituten van gezondheid R01 HL133554 aan L.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
References
- Leopold, J., Maron, B. Molecular Mechanisms of Pulmonary Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 761 (2016).
- Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L363-L369 (2012).
- van Albada, M. E., et al. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. European Respiratory Journal. 26 (3), 487-493 (2005).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A. J., Berger, R. M. F. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: lessons from preclinical animal models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (6), L1013-L1032 (2009).
- Cahill, E., et al. The pathophysiological basis of chronic hypoxic pulmonary hypertension in the mouse: vasoconstrictor and structural mechanisms contribute equally. Experimental Physiology. 97 (6), 796-806 (2012).
- Okada, K., et al. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. American Journal of Pathology. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- Happé, C. M., et al. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Tanaka, Y., Schuster, D. P., Davis, E. C., Patterson, G. A., Botney, M. D. The role of vascular injury and hemodynamics in rat pulmonary artery remodeling. Journal of Clinical Investigation. 98 (2), 434-442 (1996).
- Nishimura, T., Faul, J. L., Berry, G. J., Kao, P. N., Pearl, R. G. Effect of a surgical aortocaval fistula on monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Critical Care Medicine. 31 (4), 1213-1218 (2003).
- Linardi, D., et al. Ventricular and pulmonary vascular remodeling induced by pulmonary overflow in a chronic model of pretricuspid shunt. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (6), 2609-2617 (2014).
- White, R. J., et al. Plexiform-like lesions and increased tissue factor expression in a rat model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L583-L590 (2007).
- Samson, N., Paulin, R. Epigenetics, inflammation and metabolism in right heart failure associated with pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (3), 572-587 (2017).
