Summary
La pneumonectomie gauche rongeur est une technique utile dans la recherche d’une hypertension artérielle pulmonaire. Nous présentons ici un protocole visant à décrire la procédure de pneumonectomie rat et les soins post-opératoires afin d’assurer la mortalité et la morbidité minime.
Abstract
Dans ce protocole, nous détaillons les étapes de la procédure correctes et précautions nécessaires pour effectuer une pneumonectomie gauche et induisent des HAP chez les rats avec l’administration supplémentaire de monocrotaline (MCT) ou SU5416 (Sugen). Nous comparons également ces deux modèles à d’autres modèles de HAP couramment utilisés dans la recherche. Ces dernières années, la mise au point des modèles animaux de HAP a poussé vers l’étude du mécanisme d’angioproliferation des lésions plexiforme, dans laquelle le rôle de la circulation sanguine pulmonaire accrue est considéré comme un déclencheur important dans le développement de graves pulmonaire le remodelage vasculaire. Un des modèles rongeurs plus prometteurs de l’augmentation du débit pulmonaire est la pneumonectomie gauche unilatérale combinée avec un « second coup » de MCT ou Sugen. La suppression du poumon gauche mène à la circulation sanguine pulmonaire accrue et turbulent et remodelage vasculaire. Il n’existe actuellement aucune procédure détaillée de la chirurgie de la pneumonectomie chez les rats. Cet article décrit un protocole étape par étape de la procédure chirurgicale pneumonectomie et soins postopératoires chez les rats Sprague-Dawley. En bref, l’animal est anesthésié et le coffre est ouvert. Une fois que l’artère pulmonaire gauche, veines pulmonaires et des bronches sont visualisées, ils sont ligaturés et le poumon gauche est supprimé. La poitrine puis fermé et récupéré l’animal. Sang est obligé de circuler uniquement sur le poumon droit. Cette augmentation de la pression vasculaire entraîne un remodelage progressif et l’occlusion des petites artères pulmonaires. Le deuxième coup de MCT ou Sugen est utilisé une semaine après la chirurgie pour induire la dysfonction endothéliale. La combinaison de l’augmentation du débit sanguin dans le poumon et la dysfonction endothéliale produit HAP sévère. La principale limite de cette procédure est qu’il exige des compétences chirurgicales générales.
Introduction
Hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie progressive et mortelle caractérisée par une augmentation du débit sanguin pulmonaire, augmentation de la résistance vasculaire, l’inflammation et remodelage des petits vaisseaux sanguins pulmonaires1. Ce remodelage habituellement se traduit par des lésions vasculaires qui obstruent et oblitérer les petites artères pulmonaires, provoquant une vasoconstriction et augmentant le ventricule droit postcharge2. Il existe peu de traitements pharmacologiques réussie de HAP ; en conséquence, vestiges de la mortalité liée au HAP hautes. Récemment, au centre de recherche sur la pathologie de l’hypertension pulmonaire a déménagé vers un mécanisme d’angio-prolifération dans laquelle le rôle de la circulation sanguine pulmonaire accrue est considéré comme un déclencheur important dans le développement de pulmonaire vasculaire remodelage des3,4.
Modèles animaux d’hypertension pulmonaire ont fourni des idées essentielles qui aident à expliquer la physiopathologie de la maladie et ont servi de plateforme pour drogue, cellule, gène et la protéine livraison. Traditionnellement, le modèle de l’hypertension pulmonaire induite par l’hypoxie chronique et le modèle de lésion pulmonaire MCT ont été les principaux modèles utilisés pour étudier les HAP physiopathologie5. Toutefois, ils ne sont pas suffisants pour produire une augmentation artérielle pulmonaire flux néointimale tendance et du remodelage par rapport aux modifications décrites chez des patients humains. Le modèle de l’hypoxie chronique chez les rongeurs se traduit par l’épaississement des parois des vaisseaux avec vasoconstriction hypoxique sans angio-oblitération des petits vaisseaux pulmonaires6. En outre, la condition d’hypoxie est réversible. Ainsi, le modèle de l’hypoxie n’est également pas suffisant pour produire des HAP sévère. Le modèle de lésion pulmonaire MCT provoquer une dysfonction endothéliale, mais les lésions vasculaires oblitérante complexes, trouvées chez l’homme avec le PAH primaire sévère ne se développent pas dans le rat2. En outre, chez les rats traités MCT ont tendance à mourir de la toxicité pulmonaire induite par le MCT, maladie veino-occlusive du foie et la myocardite plutôt que de PAH2. Enfin, la pneumonectomie seule ne suffit pas produire des lésions néointimale dans les petits vaisseaux pulmonaires dans un court laps de temps. Après la pneumonectomie, il y a élévation minimale dans la pression artérielle pulmonaire7. Chez l’homme, la pneumonectomie est bien tolérée lorsque le poumon controlatéral est saine7.
Toutefois, la procédure de pneumonectomie gauche associée à MCT ou Sugen est avantageuse car elle imite la circulation sanguine pulmonaire accrue et se traduit par remodelage vasculaire pulmonaire comparable aux HAP clinique sévère. La pneumonectomie est effectuée sur le poumon gauche, qui a seulement 1 lobe, plutôt que sur la droite, qui a quatre lobes. Si le poumon droit a été supprimé, l’animal serait incapable de compenser l’insuffisance respiratoire. Dans le modèle de la pneumonectomie-MCT, néointimale modèle de remodelage se développe dans plus de 90 % des assurés-animaux traités7. De même, la combinaison des résultats Sugen et pneumonectomie en HAP grave, caractérisée par des lésions vasculaires angio-oblitérante, prolifération, apoptose et RV dysfonction8. La procédure de pneumonectomie gauche est également avantageuse par rapport aux autres interventions chirurgicales pour induire des HAP. Précédemment décrits chez les rats pour augmenter le débit sanguin pulmonaire vers les poumons ultrarésistant le shunt aorto-caval ou anastomose de l’artère sous-clavière-pulmonaire. Ces modèles sont extrêmement compliqués7,9,10,11. Pour effectuer un shunt aorto-caval, abdomen de l’animal doit être ouvert. Le shunt est placé dans l’aorte abdominale, ce qui augmente le flux sanguin vers les organes abdominaux au lieu de juste les poumons, donc, Hap prend beaucoup plus de temps à développer. En outre, il est difficile de déterminer le débit sanguin à travers le shunt, alors qu’avec la pneumonectomie le sang couler à la doublette de poumon restant. L’anastomose de l’artère sous-clavière-pulmonaire a aussi beaucoup de complications. Le flux du sang artériel dans la veine peut mener à la thrombose de l’anastomose et saignements. Comme le shunt aorto-caval, il est difficile de déterminer la circulation sanguine par l’intermédiaire de l’anastomose. En outre, c’est une technique coûteuse et difficile qui nécessite des compétences chirurgicales vasculaires. La pneumonectomie gauche unilatérale double du débit sanguin et la contrainte de cisaillement dans le poumon controlatérale et, en combinaison avec MCT ou Sugen, provoque les constatations histopathologiques et hémodynamiques typiques des HAP qui est la cellule endothéliale dommages8, 12.
La nouveauté de ce manuscrit est présentée dans le protocole chirurgical très détaillé et complet de la pneumonectomie gauche chez des rats et à la discussion des défis techniques et physiologiques de ces modèles. Parce que ce protocole n’est pas disponible, de nombreux chercheurs croient que le modèle est trop difficile. Les enquêteurs qui ont exercé la pneumonectomie gauche ont été confrontés à une mortalité élevée et des taux de morbidité associées à la perte inutile d’animaux, compromettre l’évaluation scientifique. Au lieu de cela, beaucoup utilisera des modèles classiques telles que l’injection, l’hypoxie chronique ou juste la pneumonectomie MCT pour créer des HAP. Toutefois, ces modèles sont beaucoup moins efficaces que la combinaison de MCT ou Sugen avec la pneumonectomie gauche. L’objectif principal de cet article est de fournir le protocole chirurgical d’abord détaillé et reproductible pour la pneumonectomie unilatérale gauche chez le rat et fournir le meilleur modèle chirurgical de HAP. Combinant ce protocole pour pneumonectomie unilatérale gauche avec MCT ou SU5416 permettra aux chercheurs de créer un modèle beaucoup plus efficace et cliniquement pertinent de HAP sévère pour l’étude de la pathogenèse de cette maladie mortelle.
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Protocol
Les procédures décrites ci-dessous ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’école de médecine de l’Icahn au mont Sinaï. Tous les rats ont reçu des soins compatissants en conformité avec le mont Sinaï « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals ».
1. préparation pour la chirurgie
- Autoclave Cooley-Mayo courbes droites ciseaux Iris (petits ciseaux), ciseaux de Vannas McPherson Iris (dos ciseaux), forceps de tissue Wangensteen (pince atraumatique), ciseaux (grands ciseaux), forceps tissue de Gerald, spéculum ordinaire brins (self en conservant rétracteur), cauterizer de petit bateau, gaze, sonde amphidrome, mince porte-aiguille vasculaire et Micro-Jacobson pinces hémostatiques de moustique (mosquito).
2. préparation et Intubation des Rats
- Administrer une injection sous-cutanée de buprénorphine analgésie (0,1 mg/kg) chez les rats Sprague-Dawley mâles, de vieux de 6 à 8 semaine, 30 min avant la chirurgie.
- Placez le rat individuellement dans une chambre exposée à l’isoflurane 4 % et d’oxygène (1 L/min) pendant 3-4 min jusqu'à ce que le rat est correctement anesthésié (c.-à-d., inconscient, respirer lentement et ne répond plus à toucher ou à paraître).
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Intubation de Rats
- Retirer le rat de la chambre et le rat à un conseil d’administration du ruban adhésif pour le rat repose à plat sur le dos, la bouche au bord du Conseil d’administration. Chaîne permet de tenir le rat par les deux dents de devant pour que le col reste plates/droites.
- Placer une source de lumière de fibre optique oie au-dessus du cou sur le larynx, soulever et tenir avec les doigts, la langue et remonter l’épiglotte pour visualiser les cordes vocales. La trachée doit être illuminée derrière les cordes vocales ; Ajustez la position de la lumière jusqu'à ce que la trachée est lumineuse.
- Intuber les rats en insérant un cathéter 16 G dans le larynx dans les 60 s d’éliminer le rat de la chambre, comme ils se réveiller rapidement. Si le rat se réveille avant intubation réussie, replacez le rat et répéter.
- Se brancher instantanément le rat au ventilateur de reprendre livraison isoflurane et oxygène. Confirmer l’intubation en utilisant un miroir froid d’observer la condensation de l’humidité dans l’air expiré du cathéter. Assurez-vous que l’animal est toujours respirer par l’expansion de la poitrine.
- Connectez le rat au ventilateur. Définie l’oxygène de circuler à 1 L/min. le cas le taux de ventilation à 70 respirations/mn avec un volume de marée de 0,35 à 0,45 mL. La valeur de pression expiratoire positive (PEP) pour 2 à 4 cm H2O. Reduce isoflurane à 2 – 3 %.
- Placez le rat sous le microscope dans la position de décubitus droit sur un coussin chauffant à 37 ° C. Les pattes avant du ruban vers le bas. Raser le thorax gauche derrière le pied avant jusqu'à la fin de la cage thoracique avec une tondeuse. Nettoyer la zone chirurgicale avec solution de povidone-iode gaze et 10 %, suivie de l’éthanol à 70 % (trois fois).
- Placez l’oxymètre à pied de la rat et surveiller la fréquence cardiaque et la saturation en oxygène tout au long de la chirurgie. Fréquence cardiaque devrait se situer entre 200 et 500 bpm et oxygène la saturation doit être > 95 %.
3. préparation du milieu stérile
- Visualiser la zone chirurgicale sous le microscope. Cela doit être fait tout d’abord parce que le microscope ne peut être modifié une fois que l’environnement est stérile.
- Enfilez des gants chirurgicaux stériles. Ne pas toucher quoi que ce soit en dehors de la zone chirurgicale du corps du rat, les draps chirurgicaux et les instruments stérilisés.
- Placez un drap stérile sur le corps du rat et sur le plateau à instruments pour créer un environnement stérile.
- Avec des gants stériles, placer les instruments stériles sur le plateau à instruments stériles.
4. gauche pneumonectomie chirurgicale
- Utiliser les ciseaux Cooley-Mayo et forceps tissue Gerald pour découper un petit trou dans le champ chirurgical. Le trou doit être d’environ 2 à 3 cm de diamètre pour visualiser pleinement l’incision, mais pas trop grosses pour que stérilisé uniquement la peau sont exposée.
- Faire une incision latérales longues de 2 cm dans le thorax gauche à l’aide d’une lame chirurgicale. Utilisation de gaze et la plume de bistouri électrique pour gérer les saignement/maintiennent hémostase. Utiliser les ciseaux Cooley-Mayo pour couper chaque couche du tissu jusqu'à ce que les côtes et les muscles intercostaux sont exposés.
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Entrer dans l’espace Intercostal
- Le moustique permet de faire un trou à travers le muscle du troisième espace intercostal.
- La sonde double culot permet de déplacer le poumon de la manière de visualiser l’artère pulmonaire. L’enquêteur peut pénétrer dans un autre espace intercostal si l’artère pulmonaire n’est pas accessible.
- Utilisation iris ciseaux et ciseaux d’iris de Vannas McPherson (dos ciseaux) pour ouvrir les muscles intercostaux à environ 1 à 2 cm. utilise le crayon de bistouri électrique pour arrêter tout saignement.
- Placer une petite auto maintien rétracteur de tenir les côtes et les muscles ouvrir.
- Ouvrez seulement la plèvre gauche et descendre plus bas dans l’abdomen pour permettre l’accès à l’artère pulmonaire et des bronches, le poumon gauche. Charger un hemoclip moyen dans l’applicateur pince ligature.
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Ligature de la bronche gauche et l’artère pulmonaire principale gauche
- Soulever la partie supérieure du poumon gauche soigneusement avec la pince atraumatique de Wangensteen d’exposer l’artère pulmonaire.
- Clip de l’artère pulmonaire en fermant le clip et l’applicateur autour de l’artère. Veillez à ne pas fermer ou rupture de la veine azygos gauche. Ne pas serrer trop fortement dans le cas contraire, le navire peut se rompre.
- Ouvrez l’incision en utilisant l’amygdale pour séparer les fibres musculaires.
- Charger un autre moyen hemoclip dans l’applicateur pince ligature afin qu’il soit prêt.
- Utiliser la pince atraumatique pour soulever la partie inférieure du poumon hors de l’incision jusqu'à ce que la bronche gauche et la veine pulmonaire gauche sont visualisées. Pince atraumatique doit être utilisé pull pour déplacer le poumon et hors de l’incision. Le poumon étant trop volumineux pour être sorti en un seul mouvement sans se déchirer le tissu, la pince de la question est nécessaire pour maintenir le poumon en place tandis que la pince atraumatique servent soigneusement pour retirer plus de poumon.
- Ligaturer ensemble la bronche gauche et gauche veine pulmonaire principale en fermant l’applicateur autour d’eux. Ne pas serrer la veine et bronches trop vigoureusement sinon, le navire peut se rompre.
- Retirer le poumon avec des ciseaux. Veillez à ne pas couper ou déchirer le clip. Utiliser un petit morceau de gaze stérile pour absorber le sang et assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement.
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Fermeture des côtes et des Muscles intercostaux
- Avant de fermer les muscles intercostaux, insérer un cathéter 16 G dans la cavité thoracique de l’incision chirurgicale et dans le septième espace intercostal. Veillez à ce que le chercheur peut visualiser l’aiguille pour ne pas percer des organes vitaux ou les vaisseaux.
- Retirer immédiatement l’aiguille, en laissant le cathéter en place. Cela servira un drain thoracique.
- Fermer les côtes et les muscles intercostaux avec une suture de Prolène 4-0.
- Proche de la peau et l’espace sous-cutané avec une suture de 5-0 en cours d’exécution (Table des matières).
- Placer une suture de 5-0 (Table des matières) dans la peau et autour de sa poitrine le tube donc quand le drain thoracique est enlevé, le trou sera lié fermée.
- Évacuer l’air de la cavité pleurale avec une seringue de 3 mL par le cathéter de retrouver la dépression normale dans le thorax. Clamper immédiatement le cathéter avec un porte-aiguille pour empêcher l’air de refluer dans la cavité thoracique. Retirer le cathéter et attacher la suture pour fermer le trou rapidement.
5. post-opératoire récupération
- Mettre l’animal en position sternale. Désactiver l’isoflurane, mais continuer à donner de l’oxygène de rat par le tube endotrachéal. N’abandonnez pas l’animal à tout moment jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour se déplacer et l’animal est en sécurité dans sa cage.
- Administrer par voie sous-cutanée à 2 – 3 mL de solution de Ringer amorcez stérile.
- Surveiller la fréquence cardiaque (≈200 – 500 bpm), de la saturation en oxygène (≥ 95 %), et couleur animale pour confirmer l’animal respire bien.
- Quand l’animal commence à faire des mouvements de respiration spontanée et les mouvements du cou et répond à des stimuli physiques (par exemple les yeux élargissement, nez se déplaçant et oreilles répondant aux sons), sortir l’animal en tirant sur le cathéter et débrancher le respirateur.
- Retourner l’animal à une cage vide, loin de la compagnie des autres animaux. L’animal doit être seul pendant au moins 3 jours.
- Pour le contrôle de la douleur, administrer 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée toutes les 12 h pendant 3 jours.
6. l’administration de « Second coup » MCT ou Sugen
- Administrer 1 mL de MCT (60 mg/kg) ou 1 mL de Sugen (25 mg/kg) par injection sous-cutanée, 1 semaine après la chirurgie.
7. terminal récolte
- Sept semaines après l’administration de MCT ou Sugen, placer l’animal dans une chambre avec fluide oxygène (1 L/min) et 4 % isoflurane.
- Connectez l’animal au ventilateur par l’intermédiaire de coiffe. Garder l’oxygène circulant et abaissez l’isoflurane à 2,5 à 3 %. Placez l’animal sur son dos et de la bande vers le bas de tous les membres.
- Se raser l’animal le long de l’abdomen entier.
-
Ouverture de la poitrine
- Faire une incision vers le bas de la poitrine avec un scalpel du cran sous-clavière pour le xyphoid.
- Utiliser la pince de tissu pour tenir le xyphoid. Couper à travers le sternum avec les ciseaux Cooley-Mayo jusqu'à ce que le cœur et l’artère pulmonaire sont entièrement accessibles. Utiliser le bistouri électrique pour arrêter le saignement. Tenir que les côtes ouverts avec un rétracteur.
- Identifier l’artère pulmonaire. Ajustez l’orientation du cœur, si nécessaire, en ajoutant la gaze dessous. Utiliser un cathéter IV de 20 G à la perforation de l’artère pulmonaire entre la valve pulmonaire et la bifurcation de l’artère pulmonaire principale. Avancer seulement le cathéter de 20 G dans l’artère et retirer l’aiguille. Avancez la sonde de pression transsonique Fr 1.2 dans le cathéter IV qui est dans l’artère pulmonaire. Une fois la courbe PA stable, enregistrer la pression au moins 10 s. Répétez ces étapes pour enregistrer la pression dans le ventricule droit.
- Retirer le cœur et les poumons. Placer les morceaux du poumon dans du formol à être fixé à la paraffine et coloration à l’hématoxyline et éosine.
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Representative Results
Selon le système de classification reconnus, une hypertension artérielle pulmonaire se caractérise par une pression de l’artère pulmonaire moyenne (Papm) dépassant les limites maximales de pression de l’artère pulmonaire normale (c'est-à-dire, 25 mm Hg). Dans la pneumonectomie + groupe MCT, Hap sévère développé par 21 jours avec une augmentation Papm (Figure 1). La Papm est calculée par la formule :
Les pressions de RV et PA systoliques et diastoliques et ont été mesurés avec le cathéter de pression dans l’artère pulmonaire principale connecté au système PV d’avantage. Les moyennes pressions artérielles pulmonaires (Papm) a été calculée selon la formule ci-dessus. Dans le groupe témoin (n = 20), la pression moyenne de la PA a été 18.6±1.76 mm Hg (Figure 1). Dans la pneumonectomie + groupe MCT (n = 30), la Papm a augmenté de 2,25 fois plus par rapport au groupe témoin (41.9±2.89 mm Hg) (Figure 1). Dans la pneumonectomie + Sugen groupe (n = 30), la Papm était trois fois plus élevé que dans le groupe témoin (53±6.60 mm Hg). Dans les groupes de la MCT et Sugen, la RVSP était beaucoup plus élevé par rapport au groupe témoin (Figure 1).
Histopathologie du tissu de poumon de rat a été effectuée à l’aide de l’hématoxyline et éosine coloration suivie d’imagerie avec un microscope optique de lumière. Dans le poumon normal, il y a l’espace entre les alvéoles et les structures alvéolaires sont apparents. Les vaisseaux sont clairs et d’épaisseur normale (Figure 2 a). Dans le poumon de HAP, il y a des preuves de remodelage, épaississement des parois des vaisseaux, grave constriction des vaisseaux, l’inflammation et focal artérite pulmonaire (Figure 2 b, C).
Figure 1 : l’hypertension artérielle pulmonaire sévère dans la pneumonectomie gauche combiné avec le modèle MCT. Différences significatives dans Papm et RVSP entre le groupe témoin et pneumonectomie + groupe MCT et le groupe témoin et pneumonectomie + Sugen groupe. Les données sont présentées en moyenne de sem Les p-valeurs ont été calculées en utilisant un test post-hoc unidirectionnel de l’ANOVA et Tukey. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : photomicrographies représentatifs de la coloration H & E des tissus pulmonaires. (A) du tissu pulmonaire normale. Dans le poumon de rat normal, les artères (flèche rouge) sont ouvertes et les parois des vaisseaux sont normaux de taille. (B) pathologique vasculaire remodelage chez les rats de l’hypertension artérielle pulmonaire traitée avec pneumonectomie et MCT. Le poumon montre focal artérite pulmonaire et l’inflammation, concentrique médial épaississement des parois vasculaires (flèche blanche) et concentrique intima épaississement des parois des vaisseaux (flèche noire), entraînant sévèrement constriction des vaisseaux. (C) pathologique transformant en HAP chez les rats traités avec pneumonectomie et Sugen vasculaire. Ces poumons montrent également artérite pulmonaire focal et inflammation, concentrique médial épaississement des parois des vaisseaux (flèche blanche) et concentrique intima épaississement des parois des vaisseaux (flèche noire). Les lumières de ces navires sont sévèrement restreints ou entièrement fermés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans les poumons touchés par la PAH, prolifération vasculaire avec formation néointimale et l’oblitération des artères pulmonaires se traduire par modifications hémodynamiques graves, l’insuffisance ventriculaire droite et précoce mortalité7,8. Les modifications apportées aux parois des vaisseaux augmentent la résistance à la circulation sanguine, augmentant la pression artérielle et ventriculaire droite. Dans les premiers stades de la PAH, généralement 3 semaines après l’administration de MCT ou Sugen, rats ont développé des modifications histologiques non spécifiques comme l’hypertrophie médial, épaississement adventitiels et muscularization des petites artères et artérioles. Ces changements sont potentiellement réversibles. Dans les derniers stades, environ 6 à 8 semaines après l’administration de MCT ou Sugen, poumons de rat ont néointimale et plexiforme vasculopathie qui obstruent et oblitérer les moyennes et les petites artères pulmonaires et les artérioles, prolifération intimale cellulaire, et concentrique fibrose intimale. Lésions plexiforme se composent généralement d’un plexus de canaux bordés par les cellules endothéliales et myofibroblastes. Dans de nombreux cas, ces changements sont associés à un oedème interstitiel et fibrose, thrombo-embolique obstruction des artères distales de pulmonaires petits, reperméabilisation partielle d’un navire de musculaire thrombosées et nécrose fibrinoïde12.
Comme indiqué précédemment, des rats dans d’autres modèles de HAP ne développent pas une oblitération vasculaire des petits vaisseaux, néointimale et lésions plexiforme et hautes pressions PA et RV. Traitement avec le modèle de HAP-l’hypoxie chronique a été trouvé pour produire un épaississement des navires, mais les navires restent ouverts et il y a aucune lésion vasculaire oblitérante et petite inflammation5. Les valeurs RVSP et Papm sont légèrement surélevées par rapport pour contrôler5. De même, le traitement avec MCT ou pneumonectomie conduit à des pressions artérielles pulmonaires qui n’étaient pas significativement plus élevée que les rats témoins et légèrement remodelé bateaux7,9.
À l’inverse, nous avons constaté que la pneumonectomie gauche associée à MCT ou Sugen est un modèle efficace pour créer des HAP sévère. Comparativement au groupe témoin, la pression artérielle pulmonaire moyenne (Papm) et la pression systolique ventriculaire droite (RVSP) chez des rats souffrant de grave PAH a presque doublé (Figure 1). En outre, ces rats ont développé des lésions plexiforme, épaississement concentrique de médial et intima, obstruction thrombo-embolique distale des petites artères pulmonaires, l’inflammation et l’artère pulmonaire très élevée et pression ventriculaire droite (Figure 2 ). Comparativement à l’hypoxie chronique, injection de MCT et de HAP effectuées dans d’autres études, les seuls modèles de pneumonectomie, la pneumonectomie combinée avec le modèle MCT ou Sugen crée une condition cliniquement pertinente. En outre, ce modèle, si effectuée correctement, a un taux de mortalité peropératoire presque 0 % et seulement une 10 % mortalité taux après récupération du défaut du poumon droit de compenser une insuffisance respiratoire. Des taux plus élevés de mortalité peropératoire ou après récupération est généralement révélateur qu’une erreur humaine ou matériel a eu lieu.
Afin d’effectuer la pneumonectomie gauche et créer des HAP avec succès, il y a plusieurs étapes cruciales dans le présent protocole qui doit être complété. Tout d’abord, il est très important de surveiller de l’animal saturation en oxygène, capnographie et comptage de la fréquence cardiaque pendant toute la procédure pour s’assurer que l’animal respire et son cœur bat. Surveillance de la saturation en oxygène confirme bonne intubation endotrachéale. D’intubation de l’animal est absolument nécessaire pour cette procédure. Lorsque la cage thoracique de l’animal est ouvert, la pression négative qui existe normalement dans la cavité thoracique est décalée à surpression atmosphérique. Ainsi, des rats doivent être munies d’une pression positive par l’intermédiaire de ventilation artificielle. Sans intubation correcte, poumons de l’animal vont s’effondrer de la pression atmosphérique positive.
L’incision chirurgicale doit être faite latéralement ou posterolaterally et dans le troisième espace intercostal. Selon l’anatomie du rat, le chirurgien peut avoir ouvrir un espace intercostal différent afin d’accéder le poumon et visualiser les vaisseaux. À l’aide d’autres approches rendra très difficile d’atteindre l’artère pulmonaire gauche. Lors de l’ouverture de la cage thoracique, il est très important d’utiliser un stylo de bistouri électrique pour arrêter le saignement de la peau, les muscles et entourant les vaisseaux. Si l’enquêteur saute cette étape, l’animal va perdre le sang et vont circuler moins d’oxygène. L’incision doit être un minimum de 2 cm de long alors qu’il y ait suffisamment d’espace pour sortir de l’ensemble du poumon quand ligaturant. Dans le cas contraire, l’enquêteur va déchirer le tissu, en essayant d’enlever le poumon d’une petite ouverture. Il est également essentiel d’utiliser des pinces atraumatiques lors du déplacement du poumon afin d’éviter une rupture du tissu et une hémorragie. L’artère pulmonaire est fermé en premier lieu pour prévenir les saignements de la manipulation des poumons. L’enquêteur doit être très prudent lorsque l’azygos gauche ligaturant les navires afin d’éviter la fermeture de la veine ou de déchirer les vaisseaux dans le cas contraire, l’animal va mourir. En outre, il est beaucoup plus facile pour le chirurgien d’utiliser titane hemoclips plutôt que les sutures à ligaturer l’artère pulmonaire gauche, gauche bronche et gauche des veines pulmonaires par une suture. Parce que le chercheur doit faire une incision relativement longue dans l’espace intercostal, il est nécessaire de fermer les muscles intercostaux et les côtes avec des sutures. Une fois que le coffre est fermé, air doit être évacué de la poitrine pour restaurer une pression négative et il est important de prévenir la distorsion controlatérale de poumon et le cœur avec un pneumothorax fermé.
Enfin, le recouvrement est une des étapes plus critiques après la pneumonectomie rat. Une thoracotomie est considérée comme une chirurgie très douloureuse et analgésiques sont indispensables pour promouvoir une ventilation adéquate, améliorer les excursions du poumon dans la période post-opératoire et réduire la douleur. Des rats devraient être recouvrés en position sternale pour maximiser l’inflation pulmonaire. Après 10 min, l’enquêteur peut diminuer le taux de ventilation pour aider à stimuler l’animal pour respirer seul et se réveiller. Si l’animal devient cyanosé et diminuent les niveaux de saturation d’oxygène, il est nécessaire d’augmenter l’oxygène, le débit de ventilation et augmenter le volume de marée à 5 mL ou plus selon la capacité du ventilateur. Extubation des rats doit être effectuée aussi tard que possible, une fois que l’animal est tout à fait réveillé. L’enquêteur peut mettre le rat extubé dans une chambre avec juste fluide oxygène pour faciliter la récupération.
Si la technique est exécutée correctement, et des considérations susmentionnées sont adressées, effectuer une pneumonectomie unilatérale gauche associé à MCT ou Sugen crée un modèle fiable de HAP sévère que l’hypoxie seul, MCT ou d’autres méthodes. Lorsque la pneumonectomie est effectuée correctement, l’animal survit, la procédure a une courte durée (15 à 30 min), et l’enquêteur n’a pas besoin des compétences chirurgicales vasculaires spécifiques. En outre, le chercheur est en mesure de créer avec succès des HAP. Les limitations de cette méthode sont qu’une thoracotomie est une procédure invasive, l’intubation endotrachéale est requise, et le chercheur doit-il certaines compétences chirurgicales générales. Les lésions occlusives vasculaires pulmonaires de néointimale et les augmentations de la pression artérielle pulmonaire semblable aux patients de l’hypertension pulmonaire humain prononcées sont évidentes chez les rats après la combinaison de pneumonectomie avec MCT ou SU5416 injection7 , 8 , 9. le présent modèle est une méthode fiable pour étudier le rôle de dépassement de capacité pulmonaire dans le poumon controlatéral et l’hypertension pulmonaire induite par l’écoulement.
Ce protocole peut être utile pour l’étude d’autres maladies. Il est possible d’utiliser ce modèle pour étudier la croissance compensatoire du tissu pulmonaire dans le poumon controlatéral. Cette technique peut également être utilisée pour étudier et développer des traitements pour l’insuffisance ventriculaire droite (RVF). Hypertrophie du ventricule droit sévère se développe chez les animaux qui développent des lésions néointimale d’augmentation de la pression artérielle,7. RVF entraîne la mort dans environ 70 % des patients atteints de HAP13. Augmente le flux sanguin pulmonaire peut être utile pour l’étude et le développement de traitements pour les patients qui souffrent de maladies cardiaques congénitales ainsi.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt potentiel.
Acknowledgments
Ce manuscrit a été pris en charge par les NIH accorder des subventions 7R01 HL083078-10 de l’American Heart Association AHA-17SDG33370112 et de la National instituts de la santé NIH K01 HL135474 à Y.S. et des instituts nationaux de santé R01 HL133554 à L.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
References
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