Summary
Den gnager venstre år er en verdifull teknikk i pulmonal hypertensjon forskning. Her presenterer vi en protokoll for å beskrive rat år prosedyre og postoperativ pleie å sikre minimal sykelighet og dødelighet.
Abstract
I denne protokollen, detalj vi riktig fremgangsmåter for trinnene og nødvendige forholdsregler å utføre en venstre år og indusere PAH i rotter med ekstra administrasjonen av monocrotaline (MCT) eller SU5416 (Sugen). Vi kan også sammenligne disse to modeller til andre PAH modeller brukt i forskning. I de siste årene, har fokus for PAH dyremodeller flyttet mot studere mekanismen av angioproliferation av plexiform lesjoner, der rollen økt lunge blodstrøm er regnet som en viktig utløser i utviklingen av alvorlige lunge vaskulær remodeling. En av de mest lovende gnager modellene av økt lunge flyt er den ensidige venstre år kombinert med en "andre hit" MCT eller Sugen. Fjerning av venstre lungene fører til økt og turbulente lunge blodstrøm og vaskulær remodeling. Foreløpig er det ingen detaljert prosedyre år kirurgi i rotter. Denne artikkelen omhandler en trinnvis protokoll år kirurgisk prosedyre og postoperativ omsorg i hannrotter Sprague-Dawley. Kort, dyret er anesthetized og brystet åpnes. Når den venstre lungearterien, pulmonary blodåre, og bronchus er visualisert, de er samskrevet og venstre lunge er fjernet. Brystet deretter lukket og dyret utvinnes. Blod er tvunget til å sirkulere bare på høyre lunge. Denne økte vaskulær trykket fører til en progressiv remodeling og okklusjon av små pulmonary arterier. Den andre slo MCT eller Sugen er brukt en uke etter operasjonen å indusere endotelial dysfunksjon. Kombinasjonen av økt blodstrøm i lungene og endotelial dysfunksjon produserer alvorlig PAH. Den største begrensningen i denne fremgangsmåten er at det krever de generelle kirurgiske ferdigheter.
Introduction
Pulmonal arteriell hypertensjon (PAH) er en progressiv og dødelig sykdom karakterisert ved en økning i lunge blodstrøm, økt vascular motstand, betennelse og ombygging av små lunge blodkar1. Denne remodeling vanligvis fører vaskulær lesjoner som hindrer og utslette liten pulmonary arteriene, forårsaker vasokonstriksjon og øke høyre ventrikkel afterload2. Få vellykket farmakologiske behandlinger for PAH eksisterer; som en konsekvens, PAH dødelighet fortsatt høyt. Nylig har fokus for forskning på pathobiology av pulmonal hypertensjon flyttet mot en mekanisme for angio-spredning der rollen økt lunge blodstrøm er regnet som en viktig utløser i utviklingen av lunge vaskulære remodeling3,4.
Dyr modeller av pulmonal hypertensjon har gitt kritisk innsikt som hjelper å forklare i patofysiologien av sykdom og har fungert som en plattform for narkotika, celle, gene og protein levering. Tradisjonelt, har kronisk hypoksi-indusert pulmonal hypertensjon modellen og MCT lungen skade modellen vært de viktigste modellene som brukes til å studere PAH patofysiologi5. Men er de ikke tilstrekkelig til å produsere økt lunge blodet flyt og neointimal mønster av remodeling sammenlignet endringer beskrevet i menneskelige pasienter. Kronisk hypoksi modellen i gnagere resulterer i jevning av fartøyet vegger med hypoxic vasokonstriksjon uten angio-utslettelse av små lunge fartøy6. I tillegg er hypoksi betingelsen reversibel. Dermed er hypoksi modellen heller ikke tilstrekkelig til å produsere alvorlig PAH. MCT lungen skade modellen framprovosere noen endotelial dysfunksjon men komplekse vaskulær obliterative lesjoner funnet hos mennesker med alvorlige primære PAH utvikle ikke i rotter2. I tillegg MCT-behandlet rotter har tendens til å dø fra MCT-indusert lunge toksisitet, veno-occlusive leversykdom og Myokarditt fremfor PAH2. Til slutt, i år alene er ikke tilstrekkelig til å produsere neointimal lesjoner i små lunge fartøyer i en kort periode. Etter år er det minimal høyde i pulmonal arteriell press7. Hos mennesker, er i år godt tolerert når kontralateral lunge er sunn7.
Venstre år prosedyren kombinert med MCT eller Sugen er imidlertid en fordel siden den etterligner økt lunge blodstrøm og resulterer i lunge vaskulær remodeling sammenlignes med alvorlig klinisk PAH. I år er utført på den venstre lungen, som har bare 1 lobe, i stedet for til høyre, som har fire lobes. Hvis høyre lunge ble fjernet, vil dyret kan ikke kompensere for åndedretts insuffisiens. I år-MCT-modellen utvikler neointimal mønster av remodeling i over 90% av drives-dyr behandlet7. Tilsvarende kombinasjonen av Sugen og år fører alvorlig PAH, preget av angio-obliterative vaskulære lesjoner, spredning, apoptose og RV dysfunksjon8. Venstre år prosedyren er også en fordel i forhold til andre kirurgiske prosedyrer å indusere PAH. Tidligere inkludere beskrevet modeller i rotter å øke lunge blodstrømmen til lungene by-pass aorto-caval shunt eller subclavia-lunge arterien anastomose. Disse modellene er ekstremt komplisert7,9,10,11. For å utføre en by-pass aorto-caval shunt, har dyrets bakkroppen åpnes. Shunt plasseres i abdominal aorta, som øker blodtilførselen til alle abdominal organer i stedet for bare i lungene, dermed PAH tar mye lengre tid å utvikle. I tillegg er det vanskelig å fastslå blodstrømmen gjennom shunt, mens med år blodstrømmen til gjenværende lunge Double. Subclavia-lunge arterien anastomose har også mange komplikasjoner. Flyten av arteriell blod i venen kan føre til blodpropp anastomose og blødning. Som by-pass aorto-caval shunt er det vanskelig å fastslå blodstrømmen gjennom anastomose. Det er et dyrt og vanskelig teknikk som krever vaskulær kirurgiske ferdigheter. Den ensidige venstre år dobler blodstrøm og skjæring stress i kontralateral lungene og, i kombinasjon med MCT eller Sugen, forårsaker typisk hemodynamic og histopathological resultatene av PAH som endothelial celle skade8, 12.
Nyheten av dette manuskriptet er presentert i svært detaljerte og omfattende kirurgisk protokollen til den venstre år i rotter og diskusjon om tekniske og fysiologiske utfordringene i disse modellene. Fordi denne protokollen ikke er tilgjengelig, tror mange etterforskerne modellen er for vanskelig. Etterforskerne som har utført den venstre år har møtt høy dødelighet og sykelighet priser forbundet med unødvendige tap av dyr, at vitenskapelig vurdering. I stedet bruker mange klassiske modeller som MCT injeksjon, kronisk hypoksi eller bare år for å opprette PAH. Disse modellene er imidlertid mindre effektiv enn kombinasjonen av MCT eller Sugen med den venstre år. Hovedformålet med denne artikkelen er å gi første detaljert og reproduserbar kirurgisk protokollen for den venstre ensidige år i rotter og gi det beste kirurgiske modellen for PAH. Kombinere denne protokollen for venstre ensidige år med MCT eller SU5416 vil tillate etterforskere til å opprette en langt mer effektiv og klinisk relevant modell av alvorlig PAH å studere patogenesen av denne dødelige sykdommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fremgangsmåtene nedenfor har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Icahn School of Medicine i Sinai. Alle rotter mottatt Human omsorg i henhold til Mount Sinai "Guide og bruk av forsøksdyr".
1. forberedelse til operasjon
- Autoclave Cooley-Mayo buet saks (store saks), rett Iris saks (liten saks), McPherson-Vannas Iris saks (tilbake saks), Wangensteen tissue tang (atraumatiske tang), Gerald tissue tang, vanlig wire spekulum (selv beholde festepunkt), små fartøy cauterizer, gasbind, dobbel endte sonde, tynne vaskulær nål holder og mikro-Jacobson mygg hemostatic tang (myggen).
2. forberedelse og intubasjon rotter
- Administrere en subcutaneous injeksjon av buprenorfin analgesi (0,1 mg/kg) i 6-8 uke gammel mann, Sprague-Dawley rotter, 30 min før kirurgi.
- Sett rotta individuelt i et kammer utsatt for isoflurane 4% og oksygen (1 L/min) i 3-4 min til rotta er riktig anesthetized (dvs., bevisstløs, puster sakte, og reagerer å berøre eller lyd).
-
Intubasjon rotter
- Fjern rotta fra kammeret og tape rotta til et styre slik rotta ligger flatt på ryggen, med munnen på kanten av bordet. Bruk streng for å avholde rotta av to fortennene slik at halsen ikke flat/straight.
- Plasser en fiber optisk gås lyskilde over halsen over strupehode, løfte og holde tungen med fingrene og flytte at epiglottis å visualisere stemmebåndene. Luftrøret bør være lyse bak på stemmebåndene; Juster plasseringen av lyset til luftrøret er lys.
- Intubate rotter ved å sette inn et 16 G kateter i strupehodet i 60 s fjerne rotta fra kammeret som de våkner raskt. Hvis rotta våkner før vellykket intubasjon, putte rotta tilbake og gjenta.
- Umiddelbart koble rotta til ventilen for å fortsette isoflurane og oksygen levering. Bekreft intubasjon bruker et kaldt speil for å observere kondensering av fuktigheten i utåndet pusten fra kateter. Kontroller at dyret er fortsatt puste av brystet.
- Koble rotta til ventilen. Angi oksygen til å strømme på 1 L/min. satt ventilasjon hastigheten til 70 åndedrag/min med en Tidalvolum på 0,35 – 0.45 mL. Angi positiv slutt ekspiratorisk Press (PIP) 2 – 4 cm H2O. Reduser isoflurane 2-3%.
- Plass rotta under mikroskopet i høyre liggesår posisjon på en varmeputen på 37 ° C. Tape forbena ned. Barbere venstre thorax bak forsiden beinet til slutten av ribbe buret med avklipt. Rengjør kirurgiske området med gasbind og 10% povidon-jod løsning, etterfulgt av 70% etanol (tre ganger).
- Plasser puls oksymeter fots rottas og overvåke hjertefrekvens og oksygenmetning hele operasjonen. Hjertefrekvensen skal være mellom 200-500 bpm og oksygen metning skal > 95%.
3. forberedelse av sterilt miljø
- Visualisere det kirurgiske området under mikroskopet. Dette må gjøres først fordi mikroskopet ikke kan justeres når miljøet er sterilt.
- Sette på sterilt, kirurgiske hansker. Ikke røre noe foruten steriliserte instrumenter, de kirurgiske gardiner og det kirurgiske området av rottenes kropp.
- Plass en steril drapere over rottenes kropp og instrument skuffen å skape et sterilt miljø.
- Med sterilt hansker, plassere sterilt instrumenter sterilt instrument skuffen.
4. venstre år kirurgisk prosedyre
- Bruk Cooley-Mayo saks og Gerald tissue tang for å klippe et lite hull i det kirurgiske drapere. Hullet skal være ca 2-3 cm i diameter å visualisere fullt innsnitt, men ikke for stor slik at bare steriliseres huden er utsatt.
- Gjøre en 2 cm lange lateral snitt i venstre thorax med et kirurgisk blad. Bruk gasbind og electrocautery pennen til å behandle blødning/opprettholde hemostasen. Bruk Cooley-Mayo saksen for å klippe hvert lag av vev til ribbeina og interkostalrom musklene er utsatt.
-
Angi interkostalrom
- Bruk mosquito for å lage et hull gjennom muskler av den tredje interkostalrom plassen.
- Bruk dobbel endte sonden for å flytte lungene ut av veien å visualisere lungearterien. Etterforskeren kan angi en annen interkostalrom hvis lungearterien ikke er tilgjengelig.
- Bruk iris saks og McPherson-Vannas iris saks (tilbake saks) åpne interkostalrom musklene til ca 1-2 cm. Bruk electrocautery pennen til å stoppe blødninger.
- Plasser en liten, selv beholde festepunkt å holde ribbeina og muskler åpne.
- Åpne bare venstre pleura og Flytt venstre lunge lavere i magen til lungearterien og bronchus. Laste inn en middels hemoclip i ligating klipp applikatoren.
-
Ligation av den venstre viktigste Bronchus og venstre viktigste lungearterien
- Løft den øvre delen av venstre lunge nøye med Wangensteen atraumatiske tang å avsløre lungearterien.
- Klipp lungearterien lukke klippet og applikatoren rundt arterien. Vær forsiktig med å lukke eller ruptur venstre azygos venen. Klemme ikke for kraftfullt ellers, fartøyet kan brudd.
- Åpne innsnitt ytterligere ved hjelp av mandel skille muskelfibre.
- Laste inn en annen middels hemoclip i ligating klipp applikatoren slik at den er klar.
- Bruk atraumatiske tang for å løfte den nedre delen av lungene av innsnitt inntil den venstre viktigste bronchus og venstre pulmonary vene er visualisert. Atraumatiske tang må brukes trekk flytte lungene opp og ut av innsnitt. Siden lungene er for stor til å bli trukket i én bevegelse uten å rive vevet, er problemet tang nødvendig å holde lungene på plass mens atraumatiske tang brukes forsiktig å trekke mer lunge ut.
- Ligate venstre viktigste bronchus og venstre viktigste pulmonary venen sammen ved å lukke applikatoren rundt seg. Klemme ikke vene og bronchus også kraftig ellers, fartøyet kan brudd.
- Fjerne lungene med saks. Vær forsiktig med å kutte eller rive ut klippet. Bruk en liten bit av sterilt gasbind å absorbere alle blod og kontroller at det er ingen blødninger.
-
Nedleggelsen av ribbeina og interkostalrom muskler
- Før du lukker interkostalrom musklene, setter du inn en 16 G kateter i bryst hulrom fra den kirurgiske snittet og i den sjuende interkostalrom plassen. Kontroller at etterforskeren kan visualisere nålen ikke å punktere noen vitale organer eller fartøy.
- Umiddelbart fjerne nålen, forlater kateter på plass. Dette vil bli brukt som et bryst rør.
- Lukk ribbeina og interkostalrom muskler med en 4-0 prolene Sutur.
- Lukk huden og underhud plass med en kjører 5-0 Sutur (Tabell for materiale).
- Sted en 5-0 Sutur (Tabell for materiale) inn i huden og rundt rør så når brystet røret er fjernet, hullet knyttes stengt.
- Evakuere luften fra pleural hulrommet med en 3 mL sprøyte gjennom kateter å gjenvinne den negative normal trykket i thorax. Umiddelbart klemme kateter med en nål holder hindrer luft i å gå tilbake til bryst hulrom. Raskt fjerne kateter og knytte suture for å lukke hullet.
5. postoperativ utvinning
- Plassere dyret i sternal posisjon. Slå på isoflurane, men fortsetter å gi rotte oksygen via Villena. Ikke la dyret uovervåket helst før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å ambulate og dyret er trygt i buret sitt.
- Administrere 2-3 mL steril lactated Ringer i løsningen subcutaneously.
- Overvåke hjertefrekvens (≈200-500 bpm), oksygenmetning (≥95%) og dyr farge å bekrefte dyr puster godt.
- Når Dyret begynner å spontan pusting bevegelser og halsen bevegelser og reagerer på fysiske stimuli (for eksempel øyne utvide, nese flytte og ører å svare på lyd), extubate dyr ved å trekke ut kateter og koble ventilen.
- Tilbake dyret til en tom bur, fra selskapet av andre dyr. Dyret må være alene minst 3 dager.
- Smerte kontroll, administrere 0,1 mg/kg av buprenorfin subcutaneously hver 12 h for 3 dager.
6. administrasjon av "Andre Hit" MCT eller Sugen
- Administrere 1 mL av MCT (60 mg/kg) eller 1 mL av Sugen (25 mg/kg) via injeksjon, 1 uke etter operasjonen.
7. terminal Harvest
- Syv uker etter MCT eller Sugen administrasjon, plassere dyret i et kammer med flytende oksygen (1 L/min) og 4% isoflurane.
- Koble dyret til ventilen via nesen kjegle. Holde oksygen flyter og lavere isoflurane 2.5-3%. Lå dyret på hans rygg og tape ned alle lemmer.
- Barbere dyr langs hele magen.
-
Åpne brystet
- Lage et snitt ned brystet med en skalpell fra subclavian hakk til xyphoid.
- Bruke tissue tang for å holde xyphoid. Skjære gjennom sternum med Cooley-Mayo saksen til hjertet og lungearterien er fullt tilgjengelig. Bruk electrocautery for å stoppe blødningen. Hold ribben åpnes med et festepunkt.
- Identifisere lungearterien. Juster retningen på hjertet, eventuelt ved å legge gasbind under. Bruk et 20 G IV kateter for å punktere lungearterien mellom lunge ventilen og bifurkasjonen av viktigste lungearterien. Fremme bare 20 G kateter inn arterien og fjerne nålen. Forhånd 1,2 Fr transonic press kateter inn IV kateter i lungearterien. Når PA kurven er jevn, registrere trykket for minst 10 s. Gjenta disse trinnene for å registrere trykket i høyre ventrikkel.
- Fjerne hjertet og lungene. Sett biter av lunge i formalin fast i parafin og farget med hematoxylin og eosin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ifølge akseptert klassifikasjonssystem, er pulmonal hypertensjon preget av en mener lungearterien Press (mPAP) overskride øvre normal lungearterien Press (dvs. 25 mm Hg). I år + MCT gruppe, alvorlig PAH utviklet av dagen 21 med en økt mPAP (figur 1). MPAP beregnes formelen:
Systolisk og diastolisk RV og PA press og ble målt med press kateter i viktigste lungearterien koblet til fordel PV systemet. Mener pulmonal arteriell presset (mPAP) ble beregnet ved hjelp av formelen ovenfor. I kontrollgruppen (n = 20), mener PA presset var 18.6±1.76 mm Hg (figur 1). I år + MCT gruppe (n = 30), mPAP økt 2,25 ganger mer sammenlignet med kontrollgruppen (41.9±2.89 mm Hg) (figur 1). I år + Sugen gruppe (n = 30), mPAP var tre ganger høyere enn i kontrollgruppen (53±6.60 mm Hg). I både MCT og Sugen grupper, var RVSP mye høyere sammenlignet med kontrollgruppen (figur 1).
Histopatologi av rotte lungevev ble utført ved hjelp av hematoxylin og eosin flekker etterfulgt av bildebehandling med en optisk lys mikroskop. I normale lungene, det er plass mellom alveoler og alveolar strukturer er tydelige. Fartøyene er tydelige og av vanlig tykkelse (figur 2A). I PAH lungene er det bevis på remodeling, fortykkelse av fartøy vegger, alvorlig innsnevring av fartøy, betennelse og fokal lunge arteritt (figur 2B, C).
Figur 1: alvorlig pulmonal arteriell hypertensjon i den venstre år kombinert med MCT modell. Betydelige forskjeller i mPAP og RVSP mellom kontrollgruppen og år + MCT-gruppen og kontrollgruppen og år + Sugen gruppe. Dataene presenteres som betyr SEM. P-verdiene ble beregnet ved hjelp av en enveis ANOVA og Tukey post hoc test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative photomicrographs med H & E farging av lungevev. (A) Normal lungevev. I normal rotte lunge, arteriene (rød pil) er åpne og fartøyet veggene er normal størrelse. (B) patologiske vaskulær remodeling i pulmonal arteriell hypertensjon rotter behandlet med år og MCT. Lungene viser fokal lunge arteritt og betennelse, konsentriske mediale fortykkelse av fartøyet vegger (hvit pil) og konsentriske intimal fortykkelse av fartøy vegger (svart pil), som resulterer i svært trange fartøy. (C) patologiske vaskulær remodeling i PAH rotter behandlet med år og Sugen. Disse lungene også vise fokal lunge arteritt og betennelse, konsentriske mediale fortykkelse av fartøy vegger (hvit pil) og konsentriske intimal fortykkelse av fartøy vegger (svart pil). Lumen av disse fartøyene er alvorlig trange og/eller helt stengt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I PAH-berørte lungene, vaskulære spredning med neointimal formasjon og utslettelse av pulmonary arteriene resultere i alvorlig hemodynamic endringer, høyre ventrikkel svikt og tidlig dødelighet7,8. Endringene i fartøyet vegger øke motstand mot blodstrøm, økende arterielle og høyre ventrikkel press. I de tidlige stadiene av PAH utviklet vanligvis 3 uker etter administrerer MCT eller Sugen, rotter uspesifikke histologiske endringer som mediale hypertrofi, adventitial fortykkelse og muscularization av små arterier og arterioler. Disse endringene er potensielt reversibel. I fasen ca 6-8 uker etter administrerer MCT eller Sugen, rottas lungene har neointimal og plexiform vasculopathy som hindrer og utslette middels og liten pulmonary arterier og arterioler, mobilnettet intimal spredning, og konsentriske intimal fibrose. Plexiform lesjoner består vanligvis av en plexus kanaler omgitt av endotelceller og myofibroblasts. I mange tilfeller disse endringene er tilknyttet interstitiell ødem og fibrosis, thromboembolic obstruksjon av distale liten pulmonary arteriene, delvis recanalization av en thrombosed muskel fartøyer, og fibrinoid nekrose12.
Som nevnt tidligere, utvikle rotter i andre PAH modeller ikke karsystemet utslettelse av små båter, neointimal og plexiform lesjoner og høy PA og RV press. Behandling med kronisk hypoksi PAH modellen ble funnet for å produsere noen fortykkelse av fartøy men fartøyene forbli åpen og det er ingen vaskulær obliterative lesjoner og lite betennelse5. RVSP og mPAP er litt forhøyet sammenlignet med kontrollere5. Tilsvarende resulterte behandling med MCT eller år i pulmonal arteriell presset som ikke var betydelig høyere enn kontroll rotter og litt remodeled fartøy7,9.
Derimot fant vi at den venstre år kombinert med MCT eller Sugen er en effektiv modell å lage alvorlige PAH. Sammenlignet med kontrollgruppen, doblet mener pulmonal arteriell trykket (mPAP) og høyre ventrikkel systolisk trykk (RVSP) i rotter med alvorlig PAH nesten (figur 1). I tillegg utviklet disse rottene plexiform lesjoner, konsentriske mediale og intimal jevning, thromboembolic obstruksjon av distale liten pulmonary arteriene, betennelse, og veldig forhøyet lungearterien og høyre ventrikkel Press (figur 2 ). I forhold til kroniske-hypoksi, MCT injeksjon og år bare modeller av PAH i andre studier, oppretter år kombinert med MCT eller Sugen en klinisk relevant forutsetning. Videre, denne modellen, om gjennomført riktig, har en nesten 0% intra operative dødelighet og bare en 10% dødeligheten rate etter gjenoppretting av feil høyre lunge å kompensere åndedretts insuffisiens. Høyere priser på intra operativ eller etter gjenoppretting dødelighet er vanligvis veiledende at menneskelige eller utstyr har funnet sted.
For å kunne utføre den venstre år og skape PAH, er det flere viktige trinn i denne protokollen som må fullføres. Først, er det svært viktig å overvåke dyrets oksygenmetning, capnography og telle hjertefrekvens gjennom hele prosedyren for å sikre dyr puster og hans hjerte slår. Overvåking oksygenmetning videre bekrefter riktig endotracheal intubasjon. Intubere dyret er absolutt nødvendig for denne prosedyren. Når dyrets brysthulen åpnes, er den negative trykket som normalt finnes i bryst hulrom flyttet til atmosfæriske positivt trykk. Dermed nød rotter å bli forsynt med positivt trykk via kunstig ventilasjon. Uten riktig intubasjon vil dyrets lungene kollapse fra den positive lufttrykk.
Den kirurgiske snittet må gjøres sidelengs eller posterolaterally og i den tredje interkostalrom plassen. Avhengig av rottes anatomi må kirurgen åpne en annen interkostalrom plass for å få tilgang til lungene og visualisere fartøyene. Bruke andre metoder vil gjøre det svært vanskelig å nå venstre lungearterien. Når åpning brystet hulrom, er det svært viktig å bruke en electrocautery penn for å stoppe blødning fra huden, muskler, og rundt fartøy. Hvis etterforskeren hopper over dette trinnet, dyret mister blod og mindre oksygen vil sirkulere. I snitt må være minst 2 cm lange slik at det er nok plass til å ta ut hele lungene når ligating. Ellers vil etterforskeren rive vevet når du prøver å fjerne lungene fra en liten åpning. Det er også viktig å bruke atraumatiske tang når du flytter lungene for å unngå rupturing vevet og hemorrhaging. Lungearterien lukkes først for å hindre blødning fra manipulering av lungene. Etterforskeren bør være svært forsiktig når ligating fartøy for å unngå avsluttende de venstre azygos vene eller rive fartøyene ellers, dyret vil dø. I tillegg er det mye enklere for kirurgen bruke Titan hemoclips stedet suturer til ligate venstre lungearterien, venstre viktigste bronchus og venstre pulmonary vener med en Sutur. Fordi etterforskeren har å gjøre en relativt lange snitt i interkostalrom plass, er det nødvendig å lukke interkostalrom muskler og ribben med suturer. Når brystet er lukket, luften må evakueres fra brystet gjenopprette negative trykket og det er viktig å unngå kontralateral lunge og hjerte forvrengning med en lukket pneumotoraks.
Endelig er utvinning en av de viktigste trinnene etter rat år. En thoracotomy er ansett som en svært smertefull operasjon og smertestillende er viktig å fremme tilstrekkelig ventilasjon, bedre lunge utflukter i postoperativ perioden og redusere smerte. Rotter skal gjenopprettes i sternal posisjon til å maksimere lunge inflasjon. Etter 10 min, kan investigator redusere ventilasjon hastigheten for å stimulere dyret å puste på egen hånd og våkne. Hvis dyret blir cyanotisk og metning oksygennivået reduseres, er det nødvendig å øke oksygen, ventilasjon rate og øke Tidalvolum 5 mL eller mer avhengig av ventilen. Extubation av rotter bør gjøres så sent som mulig, når dyret er fullt våken. Etterforskeren kan sette extubated rotta i et kammer med bare flytende oksygen å hjelpe videre utvinning.
Hvis teknikken utføres riktig og de nevnte hensyn er adressert, utføre en venstre ensidige år kombinert med MCT eller Sugen skaper en pålitelig modell av alvorlig PAH enn MCT alene, hypoksi eller andre metoder. Når år utføres riktig, dyret overlever, prosedyren har en kort varighet (15 – 30 min) og etterforskeren trenger ikke spesifikke vaskulære kirurgiske ferdigheter. Videre er etterforskeren kjøpedyktig opprette PAH. Begrensningene i denne metoden er at en thoracotomy er en invasiv prosedyre, endotracheal intubasjon kreves og etterforskeren trenger noen generelle kirurgiske ferdigheter. Neointimal pulmonal vaskulær occlusive lesjoner og uttales øker i lungearterien press ligner menneskelige pulmonal hypertensjon pasienter er tydelig i rotter etter kombinasjonen av år med MCT eller SU5416 injeksjon7 , 8 , 9. den nåværende modellen er en pålitelig metode for å studere rollen til lunge overflyt i kontralateral lunge og flyt-indusert pulmonal hypertensjon.
Denne protokollen kan være nyttig for å studere andre sykdommer. Det er mulig å bruke denne modellen for å studere kompenserende veksten av lunge vev i lungene kontralateral. Denne teknikken kan også brukes til å studere og utvikle behandlinger for høyre ventrikkel svikt (RVF). Alvorlig høyre ventrikkel hypertrofi utvikler i dyrene det utvikle neointimal lesjoner økt arteriell press7. RVF forårsaker død i ca 70% av pasienter med PAH13. Økende lunge blodstrøm kan være nyttig for å studere og utvikle behandlinger for pasienter som lider av medfødt hjerte sykdommer også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen mulige interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette manuskriptet ble støttet av NIH gir 7R01 HL083078-10 tilskudd fra American Heart Association AHA-17SDG33370112 og fra den nasjonale institutter for helse NIH K01 HL135474 til utleid og den nasjonale institutter helse R01 HL133554 til L.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
References
- Leopold, J., Maron, B. Molecular Mechanisms of Pulmonary Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 761 (2016).
- Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L363-L369 (2012).
- van Albada, M. E., et al. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. European Respiratory Journal. 26 (3), 487-493 (2005).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A. J., Berger, R. M. F. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: lessons from preclinical animal models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (6), L1013-L1032 (2009).
- Cahill, E., et al. The pathophysiological basis of chronic hypoxic pulmonary hypertension in the mouse: vasoconstrictor and structural mechanisms contribute equally. Experimental Physiology. 97 (6), 796-806 (2012).
- Okada, K., et al. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. American Journal of Pathology. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- Happé, C. M., et al. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Tanaka, Y., Schuster, D. P., Davis, E. C., Patterson, G. A., Botney, M. D. The role of vascular injury and hemodynamics in rat pulmonary artery remodeling. Journal of Clinical Investigation. 98 (2), 434-442 (1996).
- Nishimura, T., Faul, J. L., Berry, G. J., Kao, P. N., Pearl, R. G. Effect of a surgical aortocaval fistula on monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Critical Care Medicine. 31 (4), 1213-1218 (2003).
- Linardi, D., et al. Ventricular and pulmonary vascular remodeling induced by pulmonary overflow in a chronic model of pretricuspid shunt. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (6), 2609-2617 (2014).
- White, R. J., et al. Plexiform-like lesions and increased tissue factor expression in a rat model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L583-L590 (2007).
- Samson, N., Paulin, R. Epigenetics, inflammation and metabolism in right heart failure associated with pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (3), 572-587 (2017).
