Summary
Das Nagetier linken Pneumonektomie ist eine wertvolle Technik in der pulmonalen Hypertonie-Forschung. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Beschreibung der Ratte Pneumonektomie Verfahren und Nachsorge zu minimalen Morbidität und Mortalität zu gewährleisten.
Abstract
In diesem Protokoll wir ausführlich die richtige Verfahrensschritte und die notwendigen Vorkehrungen, um erfolgreich durchführen einer linken Pneumonektomie und induzieren PAH in Ratten mit die zusätzliche Gabe von Monocrotaline (MCT) oder SU5416 (Sugen). Wir vergleichen auch diese beiden Modelle zu anderen PAH-Modelle, die häufig in der Forschung eingesetzt. In den letzten Jahren hat der Fokus von Tiermodellen PAH verschoben in Richtung Studium des Mechanismus der Angioproliferation von plexiformen Läsionen, in denen die Rolle der erhöhten pulmonalen Blutfluss als ein wichtiger Auslöser in der Entwicklung der schweren pulmonalen gilt vaskuläre remodeling. Eines der vielversprechendsten Nager-Modelle von erhöhten pulmonalen Fluss ist die einseitige linke Pneumonektomie, kombiniert mit einem "zweiten Hit" MCT oder Sugen. Die Entfernung von der linken Lunge führt zu erhöhten und turbulenten pulmonalen Blutfluss und vaskuläre remodeling. Derzeit gibt es keine Einzelheiten des Verfahrens der Pneumonektomie Chirurgie bei Ratten. Dieser Artikel beschreibt Schritt für Schritt Protokoll der Pneumonektomie chirurgischen Eingriff und Nachsorge bei männlichen Sprague-Dawley Ratten. Kurz gesagt, das Tier betäubt und die Truhe geöffnet. Sobald die linke Lungenarterie Pulmonalvene und Bronchus visualisiert werden, sie sind ligiert und die linke Lunge entfernt. Die Brust dann geschlossen und das Tier erholt. Blut ist gezwungen, nur auf der rechten Lunge zirkulieren. Diese erhöhte vaskuläre Druck führt zu einer progressiven Umbau und Verschluss der kleinen Lungenarterien. Der zweite Treffer der MCT oder Sugen ist verwendete eine Woche nach der Operation, endothelialen Dysfunktion zu induzieren. Die Kombination von erhöht den Blutfluss in der Lunge und der endothelialen Dysfunktion produziert schwere Pak. Die größte Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass es allgemeine chirurgische Fähigkeiten erfordert.
Introduction
Pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) ist eine progressive und tödliche Krankheit, gekennzeichnet durch eine Zunahme der pulmonalen Blutfluss, erhöhten Gefäßwiderstand, Entzündungen und Umbau des kleinen Lungengefäße Blut1. Dieser Umbau in der Regel führt zu vaskulären Läsionen, die behindern und kleine Pulmonalarterien, verursacht Vasokonstriktion und Erhöhung der rechten Herzkammer Nachlast2zu verwischen. Einige erfolgreiche pharmakologische Behandlungen von Pak vorhanden sind; als Folge, PAH-Mortalität nach wie vor hoch. Vor kurzem hat sich der Schwerpunkt der Forschung auf der Pathobiologie der pulmonalen Hypertonie auf einen Mechanismus der Angio-Proliferation bewegt in dem die Rolle der erhöhten pulmonalen Blutfluss als ein wichtiger Auslöser in der Entwicklung der pulmonalen vaskulären gilt Umbau3,4.
Tiermodelle der pulmonalen Hypertonie haben entscheidende Einblicke zur Verfügung gestellt, die helfen, die Pathophysiologie der Erkrankung zu erklären und als Plattform für Drogen, Zelle, Gene und Protein Lieferung gedient haben. Traditionell wurden die chronische Hypoxie-induzierten pulmonalen Hypertonie und dem MCT Lunge Verletzungen Modell die wichtigsten Modelle zur Untersuchung der PAH Pathophysiologie5. Sie sind jedoch nicht ausreichend, um erhöhten pulmonalen Blut fließen und Neointimal Muster der Umgestaltung im Vergleich zu Veränderungen bei menschlichen Patienten beschrieben zu erzeugen. Die chronische Hypoxie-Modell bei Nagetieren führt zu Verdickung der Gefäßwände mit hypoxischen Vasokonstriktion ohne Angio-Auslöschung der kleinen Lungengefäße6. Darüber hinaus ist die Hypoxie Zustand reversibel. Somit ist das Hypoxie-Modell auch nicht ausreichen, um schwere Pak zu produzieren. MCT Lunge Verletzungen Modell einige endothelialen Dysfunktion zu entlocken, aber die komplexe obliterans Gefäßläsionen findet man bei Menschen mit schweren primären Pak entstehen nicht in den Ratten2. Darüber hinaus neigen MCT-behandelten Ratten von MCT-induzierte Lunge Toxizität, Veno-okklusive Lebererkrankung und Herzmuskelentzündung (Myokarditis) anstatt von PAH2sterben. Schließlich ist die Pneumonektomie allein nicht ausreicht, um Neointimal Läsionen in die kleinen Lungengefäße in kurzer Zeit zu produzieren. Nach der Pneumonektomie gibt es minimale Höhe in pulmonalen arteriellen Drucks7. Beim Menschen ist die Pneumonektomie gut verträglich, wenn die kontralaterale Lunge gesund7ist.
Das linke Pneumonektomie Verfahren kombiniert mit MCT oder Sugen ist jedoch vorteilhaft, da es erhöhten pulmonalen Blutfluss imitiert und pulmonalen vaskulären Umbau vergleichbar mit schweren klinischen Pak führt. Die Pneumonektomie erfolgt auf der linken Lunge, die nur 1 Lappen hat, anstatt auf der rechten Seite, die vier Lappen hat. Wenn die rechte Lunge entfernt wurde, wäre das Tier nicht kompensieren die respiratorische Insuffizienz. Im Pneumonektomie-MCT-Modell entwickelt sich Neointimal Muster der Umgestaltung in über 90 % der behandelten mit betrieben Tiere7. Ebenso führt die Kombination von Sugen und Pneumonektomie schwere Pak, gekennzeichnet durch Angio-obliterans vaskulären Läsionen, Proliferation, Apoptose und RV-Dysfunktion-8. Die linke Pneumonektomie Vorgehensweise ist auch vorteilhaft im Vergleich zu anderen chirurgischen Eingriffen, PAH zu induzieren. Bisher gehören beschriebenen Modelle bei Ratten zu pulmonalen Blutfluss in die Lunge zu erhöhen Aorto-Caval Shunt oder subclavia-pulmonale Arterie Anastomose. Diese Modelle sind äußerst kompliziert7,9,10,11. Um ein Aorto-Caval Shunt durchzuführen, muss das Tier Bauch geöffnet werden. Der Shunt befindet sich in der abdominalen Aorta, die Durchblutung aller Bauchorgane statt nur die Lunge erhöht, somit PAH dauert wesentlich länger, zu entwickeln. Darüber hinaus ist es schwierig zu bestimmen, den Blutfluss durch den Shunt, während mit der Pneumonektomie der Blutfluss zu den verbleibenden Lunge Doppel. Die Anastomose subclavia-pulmonale Arterie hat auch viele Komplikationen. Der arteriellen Blutfluss in der Vene kann zur Thrombose der Anastomose und Blutungen führen. Wie die Aorto-Caval Shunt ist es schwierig zu bestimmen, den Blutfluss durch die Anastomose. Darüber hinaus ist es eine teure und schwierige Technik, die vaskuläre chirurgische Fähigkeiten erfordert. Die einseitige linke Pneumonektomie verdoppelt Blutfluss und Schubspannung in der kontralateralen Lunge und in Kombination mit MCT oder Sugen, verursacht die typischen hämodynamischen und histopathologischen Befunde der PAH der Endothelzellen Schaden8, 12.
Die Neuheit dieser Handschrift ist in das sehr detaillierte und umfassende chirurgische Protokoll von der linken Pneumonektomie bei Ratten und in der Diskussion über die technischen und physiologischen Anforderungen dieser Modelle vorgestellt. Da dieses Protokoll nicht verfügbar ist, halte viele Forscher das Modell schwer Verwendung. Ermittler, die die linke Pneumonektomie durchgeführt haben hohe Mortalität und Morbidität verbunden mit den unnötigen Verlust von Tieren, Kompromisse bei der wissenschaftlichen Bewertung konfrontiert. Stattdessen verwenden viele klassische Modelle wie MCT-Injektion, chronische Hypoxie oder nur die Pneumonektomie Pak zu erstellen. Diese Modelle sind jedoch weit weniger effizient als die Kombination von MCT oder Sugen mit der linken Pneumonektomie. Der primäre Zweck dieses Artikels ist es, zunächst detailliert und reproduzierbar chirurgischen Protokolls für die linken einseitige Pneumonektomie bei Ratten und bieten die beste chirurgische Modell von Pak. Dieses Protokoll für linken einseitige Pneumonektomie mit MCT oder SU5416 kombinieren ermöglicht Ermittler zum Erstellen eines sehr viel effektiveren und klinisch relevanten Modells von schweren Pak, die Pathogenese von dieser tödlichen Krankheit zu studieren.
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Protocol
Die nachstehend beschriebenen Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai genehmigt. Alle Ratten erhielten humane Pflege im Einklang mit dem Mount Sinai "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren".
1. Vorbereitung für die Operation
- Autoklaven Cooley-Mayo gebogene Schere (große Schere), Gerald Gewebe Zange, einfachen Draht Spekulum (selbst behalten gerade Iris-Schere (kleine Schere), McPherson-Vannas Iris Schere (hintere Schere), Wangensteen Gewebe Zange (atraumatische Pinzette) Retraktor), kleines Schiff linken, Gaze, doppelseitigen Sonde, dünne vaskulären Nadelhalter und Mikro-Jacobson Moskito blutstillende Zange (Mücke).
2. Vorbereitung und Intubation von Ratten
- Verwalten Sie eine subkutane Injektion von Buprenorphin Analgesie (0,1 mg/kg) bei 6 – 8 Wochen alten männlichen, Sprague-Dawley Ratten, 30 min vor der Operation.
- Legen Sie die Ratte einzeln in einer Kammer, Isofluran 4 % und Sauerstoff (1 L/min) für 3 – 4 min. ausgesetzt, bis die Ratte richtig betäubt ist (d.h., bewusstlos, atmet langsam und reagiert nicht auf Berührung oder sound).
-
Intubation von Ratten
- Entfernen Sie die Ratte aus der Kammer zu und kleben Sie die Ratte auf ein Brett, damit die Ratte auf den Rücken, mit dem Mund an den Rand des Brettes flach aufliegt. Verwenden Sie die Zeichenfolge, um die Ratte durch die beiden vorderen Zähne zu halten, so dass der Hals flach/gerade bleibt.
- Legen Sie eine Fiber optic Gans Lichtquelle über den Hals über dem Kehlkopf, heben Sie und halten Sie die Zunge mit den Fingern und verschieben Sie der Kehldeckel nach oben, um die Stimmbänder zu visualisieren. Die Luftröhre sollte hinter der Stimmbänder hell; passen Sie die Position des Lichts, bis die Luftröhre hell ist.
- Intubation die Ratten durch Einfügen eines 16 G-Katheters in den Kehlkopf innerhalb von 60 s die Ratte aus der Kammer zu entfernen, da sie schnell aufwachen. Wenn die Ratte vor erfolgreiche Intubation weckt, setzen Sie die Ratte zurück und wiederholen.
- Schließen Sie die Ratte an das Beatmungsgerät wieder Isoflurane und Sauerstoff Lieferung sofort an. Bestätigen Sie die Intubation mit einem kalten Spiegel, um Kondensation der Luftfeuchtigkeit in der Ausatmungsluft vom Katheter zu beobachten. Stellen Sie sicher, dass das Tier noch atmen durch die Ausdehnung der Brust ist.
- Schließen Sie die Ratte an das Beatmungsgerät. Festlegen der Sauerstoff, 1 L/min. fließen die Belüftungsrate voraussichtlich 70 Atemzüge/min mit einem Tidalvolumen von 0,35-0,45 mL. Setzen Sie positive Ende exspiratorischen Druck (PEEP) auf 2 – 4 cm H2O. Reduce Isofluran auf 2 – 3 %.
- Stellen Sie die Ratte unter dem Mikroskop auf richtige Dekubitus auf ein Heizkissen bei 37 ° C. Kleben Sie die Vorderbeine nach unten. Rasieren Sie den linken Brustkorb hinter dem vorderen Bein bis zum Ende des Brustkorbes mit Klipper. Reinigen Sie den OP-Bereich mit Gaze und 10 % Povidon-Jod-Lösung, gefolgt von 70 % igem Ethanol (dreimal).
- Legen Sie das Pulsoximeter auf die Ratte Fuß und Überwachung der Herzfrequenz und Sauerstoffsättigung während der Operation. Herzfrequenz zwischen 200 – 500 Bpm und Sauerstoffsättigung sollte sein soll > 95 %.
3. Vorbereitung der sterilen Umgebung
- Visualisieren Sie den OP-Bereich unter die Lupe genommen. Dies muss zuerst erfolgen, da das Mikroskop nicht eingestellt werden kann, sobald die Umgebung steril ist.
- Steril, chirurgische Handschuhe anziehen. Nicht neben der sterilisierte Instrumente, OP-Abdeckungen und OP-Bereich der Ratte Körper anfassen.
- Legen Sie ein steriles Tuch über die Ratte in den Körper und das Instrument Fach, eine sterile Umgebung zu schaffen.
- Legen Sie mit sterilen Handschuhen sterile Instrumenten auf dem sterilen Instrument tray
4. linke Pneumonektomie chirurgischen Eingriff
- Verwenden Sie Cooley-Mayo Schere und Gerald Gewebe Zange, schneiden Sie ein kleines Loch in die chirurgische drapieren. Das Loch sollte ca. 2 – 3 cm im Durchmesser, den Schnitt voll zu visualisieren, aber nicht zu groß, so dass nur sterilisiert Haut ausgesetzt ist.
- Machen Sie einen 2 cm langen seitlichen Schnitt im linken Thorax mit einer chirurgischen Klinge. Mit Gaze und Elektrokauter Stift Blutungen/pflegen Blutstillung verwaltet werden. Verwenden Sie die Cooley-Mayo Schere, um jede Schicht des Gewebes zu schneiden, bis die Rippen und Zwischenrippenmuskeln ausgesetzt sind.
-
Intercostalneuralgie Leerzeichen eingeben
- Verwenden Sie die Mücke, um ein Loch durch den Muskel der dritten Intercostalneuralgie Platz zu machen.
- Die doppelseitigen Sonde verwendet werden, um die Lunge aus dem Weg zu visualisieren, die Lungenarterie zu bewegen. Der Prüfer kann ein weiteres Intercostalneuralgie Leerzeichen eingeben, wenn der Lungenarterie nicht zugänglich ist.
- Verwendung Iris Schere und McPherson-Vannas Iris Schere (hintere Schere), öffnen Sie die Zwischenrippenmuskeln, ca. 1 – 2 cm. verwenden den Elektrokauter Stift, um eine Blutung zu stoppen.
- Legen Sie ein kleines, selbst behalten Retraktor, die Rippen zu halten und Muskeln öffnen.
- Öffnen Sie nur die linke Pleura und nach der linken Lunge unten unten in den Bauch der Lungenarterie und Bronchus zugänglich. Laden Sie eine mittlere Hemoclip in der Ligation Clip-Applikator.
-
Unterbindung der wichtigsten linken Bronchus und linken Haupt Lungenarterie
- Heben Sie den oberen Teil der linken Lunge sorgfältig mit Wangensteen atraumatische Pinzetten, die Lungenarterie verfügbar zu machen.
- Clip der Lungenarterie durch Schließen der Clips und Applikator in die Arterie. Achten Sie darauf, nicht zu schließen oder Bruch die linken Azygos Ader. Nicht einspannen zu kräftig sonst, das Schiff kann Bruch.
- Öffnen Sie den Schnitt weiter mit der Tonsillen, um die Muskelfasern zu trennen.
- Laden Sie eine andere mittlere Hemoclip in selbstligierendes Clip Applikator, so dass sie bereit ist.
- Verwenden Sie die atraumatische Pinzetten, um den unteren Teil der Lunge aus der Schnitt zu heben, bis die wichtigsten linken Bronchus und linken Pulmonalvene visualisiert werden. Atraumatische Pinzette muss ziehen verwendet, um die Lunge und aus der Schnitt bewegen. Da die Lunge zu groß, um in einer Bewegung herausgezogen werden, ohne zu reißen des Gewebes ist, sind die Problem-Zange notwendig, um die Lunge im Ort zu halten, während die atraumatische Pinzette vorsichtig verwendet werden, um mehr Lunge herausziehen.
- Verbinden Sie die wichtigsten linken Bronchus und linken Haupt Pulmonalvene durch Schließen des Applikators um sie herum zusammen. Die Vene und Bronchus zu kräftig sonst nicht einspannen, das Schiff kann Bruch.
- Entfernen Sie die Lunge mit einer Schere. Achten Sie darauf, nicht zu schneiden oder reißen sich den Clip. Verwenden Sie ein kleines Stück von steriler Gaze, um Blut zu absorbieren und stellen Sie sicher, es gibt keine Blutung.
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Schließung der Rippen und Zwischenrippenmuskeln
- Vor dem Schließen der Zwischenrippenmuskeln, einsetzen Sie einen 16 G-Katheter in die Brusthöhle von der chirurgischen Inzision und in den siebten Intercostalneuralgie Raum. Stellen Sie sicher, dass der Prüfer die Nadel um alle lebenswichtigen Organe oder Gefäße Punktion nicht zu visualisieren kann.
- Entfernen Sie die Nadel, so dass des Katheters an Ort sofort. Dies wird als eine Thoraxdrainage verwendet werden.
- Schließen Sie die Rippen und Zwischenrippenmuskeln mit einer 4: 0 Prolene Naht.
- Schließen Sie die Haut und subkutanen Raum mit einer laufenden 5-0-Naht (Table of Materials).
- Platz 5: 0-Naht (Table of Materials) in der Haut und um die Brust tube, also wenn die Thoraxdrainage entfernt wird, wird das Loch gebunden werden geschlossen.
- Evakuierung der Luft aus der Pleurahöhle mit einer 3 mL Spritze durch den Katheter wieder den normalen Unterdruck im Thorax. Klemmen Sie sofort den Katheter mit einem Nadelhalter zu verhindern, dass Luft in die Brusthöhle zurückzugehen. Schnell entfernen Sie den Katheter und binden Sie die Naht um das Loch zu schließen.
5. postoperative Erholung
- Setzen Sie das Tier auf der sternalen. Schalten Sie die Isoflurane aber auch weiterhin geben die Ratte Sauerstoff über Endotrachealtubus. Nicht unbeaufsichtigt lassen das Tier an jedem beliebigen Punkt bis es genügend Bewusstsein um ambulate wiedererlangt und das Tier sicher in seinem Käfig hat ist.
- Verabreichen Sie 2 – 3 mL sterile gesäugt Ringer-Lösung subkutan.
- Überwachung der Herzfrequenz (≈200 – 500 Bpm), Sauerstoffsättigung (≥95 %) und tierischen Farbe, das Tier zu bestätigen ist gut atmen.
- Wenn das Tier fängt an, Spontanatmung Bewegungen und Hals Bewegungen und reagiert auf physikalische Reize (z. B. Augen Erweiterung, bewegt Nase und Ohren reagieren auf Klang), Extubate das Tier durch Herausziehen des Katheters und trennen Sie den Ventilator.
- Das Tier zu einem leeren Käfig, Weg von der Firma anderer Tiere zurück. Das Tier sollte für mindestens 3 Tage allein sein.
- Zur Schmerzkontrolle verwalten Sie 0,1 mg/kg von Buprenorphin subkutan alle 12 h für 3 Tage.
6. Verwaltung der "Zweiten Hit" MCT oder Sugen
- 1 mL MCT (60 mg/kg) oder 1 mL Sugen (25 mg/kg) durch subkutane Injektion, 1 Woche nach der Operation zu verwalten.
(7) terminal Ernte
- Legen Sie sieben Wochen nach der Verabreichung von MCT oder Sugen, das Tier in eine Kammer mit flüssigen Sauerstoff (1 L/min) und 4 % Isofluran.
- Verbinden Sie das Tier an den Ventilator über Bugnase. Halten Sie fließt Sauerstoff und senken Sie Isofluran auf 2,5-3 % zu. Legen Sie das Tier auf dem Rücken und Band nach unten alle Gliedmaßen.
- Rasieren Sie das Tier entlang der gesamten Bauch.
-
Die Truhe öffnet
- Machen Sie einen Schnitt über der Brust mit einem Skalpell von der subclavian Kerbe an der Xyphoid.
- Verwenden Sie die Gewebe-Zange die Xyphoid halten. Durchschneiden des Brustbeins mit der Cooley-Mayo Schere, bis das Herz und die Lungenarterie voll zugänglich sind. Verwenden Sie die Elektrokauterisation, um die Blutung zu stoppen. Halten Sie die Rippen mit einem Retraktor zu öffnen.
- Identifizieren der Lungenarterie. Stellen Sie die Ausrichtung des Herzens, gegebenenfalls durch Zugabe von Gaze unter. Verwenden Sie einen 20 G-IV-Katheter, um die Lungenarterie zwischen die Pulmonalklappe und die Verzweigung der wichtigsten Lungenarterie zu durchbohren. Vorab nur 20 G Katheter in die Arterie und die Nadel entfernen. Voraus die 1.2 Fr transonic Druck Katheter in IV-Katheter, der in der Lungenarterie ist. Sobald die PA-Kurve stetig ist, zeichnen Sie dem Druck für mindestens 10 S. wiederholen folgendermaßen vor, um den Druck in der rechten Herzkammer aufnehmen auf.
- Entfernen Sie das Herz und die Lunge. Legen Sie die Stücke von der Lunge in Formalin fixiert in Paraffin und mit Hämatoxylin und Eosin befleckt werden.
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Representative Results
Nach der akzeptierten Systematik ist Lungenhochdruck gekennzeichnet durch eine mittlere Lungenarterie Druck (mPAP) über die obere Grenze des normalen Lungenarterie Druck (d. h. 25 mm Hg). In der Pneumonektomie + MCT-Gruppe entwickelt schwere Pak bis Tag 21 mit einer erhöhten mPAP (Abbildung 1). Der mPAP wird nach folgender Formel berechnet:
Systolischen und diastolischen RV und PA Druck und wurden mit dem Druck-Katheter in die wichtigsten Lungenarterie angeschlossen, der Vorteil PV-Anlage gemessen. Der mittlere pulmonalen arteriellen Druck (mPAP) wurde mit der obigen Formel errechnet. In der Kontrollgruppe (n = 20), der mittlere PA Druck war 18.6±1.76 mm Hg (Abbildung 1). In der Pneumonektomie + MCT-Gruppe (n = 30), der mPAP erhöht 2,25 Mal mehr im Vergleich zu der Kontrollgruppe (41.9±2.89 mm Hg) (Abbildung 1). In der Pneumonektomie + Sugen-Gruppe (n = 30), der mPAP war dreimal höher als in der Kontrollgruppe (53±6.60 mm Hg). In der MCT und Sugen war die RVSP viel höher im Vergleich zu der Kontrollgruppe (Abbildung 1).
Histopathologie der Ratte Lungengewebe erfolgte mittels Hämatoxylin und Eosin Färbung Bildgebung mit dem Lichtmikroskop Licht gefolgt. In der normalen Lunge gibt es Platz zwischen den Alveolen und die alveolären Strukturen sind offensichtlich. Die Gefäße sind klar und von normalen Dicke (Abbildung 2A). In der PAH-Lunge ist Beweis der Umgestaltung, Verdickung der Gefäßwände, starke Verengung der Gefäße, Entzündungen und fokale pulmonale Arterienentzündung (Abb. 2 b, C).
Abbildung 1: schwerer pulmonaler arterieller Hypertonie in der linken Pneumonektomie kombiniert mit MCT Modell. Signifikante Unterschiede in mPAP und RVSP zwischen der Kontrollgruppe und Pneumonektomie + MCT-Gruppe und der Kontrollgruppe und Pneumonektomie + Sugen-Gruppe. Daten werden präsentiert, da SEM bedeuten Die p-Werte wurden mit einem One-Way ANOVA und Tukey post-hoc-Test berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: repräsentative Vergößerung der H & E Färbung des Lungengewebes. (A) normale Lungengewebe. In der normalen Ratte Lunge, Arterien (roter Pfeil) öffnen und die Gefäßwände sind normale Größe. (B) pathologische Gefäße Umgestaltung bei pulmonaler arterieller Hypertonie Ratten mit Pneumonektomie und MCT behandelt. Die Lunge zeigt fokale pulmonale Arterienentzündung und Entzündungen, konzentrische mediale Verdickung der Gefäßwände (weißer Pfeil) und konzentrischen Intima-Verdickung der Gefäßwände (schwarzer Pfeil), was zu stark Gefäße verengt. (C) pathologische Gefäße Umgestaltung bei PAH Ratten mit Pneumonektomie und Sugen behandelt. Diese Lungen zeigen auch fokale pulmonale Arterienentzündung und Entzündungen, konzentrische mediale Verdickung der Gefäßwände (weißer Pfeil) und konzentrischen Intima-Verdickung der Gefäßwände (schwarzer Pfeil). Die Lumen dieser Schiffe sind stark eingeengt und/oder ganz geschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In Pak-betroffenen Lungen, vaskuläre Proliferation mit Neointimal Bildung und Auslöschung der Lungenarterien führen zu schweren hämodynamischen Veränderungen, rechtsventrikuläre scheitern und frühe Sterblichkeit7,8. Die Änderungen an den Gefäßwänden erhöhen Widerstandsfähigkeit gegen Blutfluss, arterielle und rechtsventrikulärer Druck. In der Regel in den frühen Stadien der PAH entwickelt das 3 Wochen nach der Verabreichung MCT oder Sugen, Ratten unspezifische histologische Veränderungen wie mediale Hypertrophie, adventitial Verdickung und Muscularization der kleinen Arterien und Arteriolen. Diese Veränderungen sind möglicherweise reversibel. In den späteren Stadien, ca. 6 – 8 Wochen nach der Verabreichung MCT oder Sugen, haben die Ratte Lungen, Neointimal und plexiformen Vaskulopathie, die behindern und verwischen, mittlere und kleine Lungenarterien und Arteriolen, Intima Zellproliferation und konzentrische Intima Fibrose. Plexiformen Läsionen bestehen meist aus einer Plexus der Kanäle von Endothelzellen und Myofibroblasts gesäumt. In vielen Fällen diese Veränderungen stehen im Zusammenhang mit interstitiellen Ödem und Fibrose, thromboembolische Obstruktion der distalen kleinen Pulmonalarterien, teilweise Rekanalisation eines thrombosierten muskuläre Schiffe, und fibrinoid Nekrose12.
Wie bereits erwähnt, entwickeln sich Ratten in anderen PAH-Modellen nicht vaskulären Auslöschung der kleinen Schiffe, Neointimal und plexiformen Läsionen und PA und RV Hochdruck. Behandlung mit dem chronischen Hypoxie-Pak-Modell wurde gefunden, produzieren einige Verdickung der Gefäße aber die Gefäße offen bleiben und es gibt keine obliterans Gefäßläsionen und kleine Entzündungen5. RVSP und mPAP Werte sind leicht erhöht im Vergleich zu5steuern. In ähnlicher Weise führte Behandlung mit MCT oder Pneumonektomie pulmonalen arteriellen Druck, die waren nicht signifikant höher als Kontrolle Ratten und leicht umgebaut Schiffe7,9.
Im Gegensatz dazu fanden wir, dass der linken Pneumonektomie kombiniert mit MCT oder Sugen ein effektives Modell schwere Pak zu erstellen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe, verdoppelt die pulmonale arterielle Mitteldruck (mPAP) und der rechtsventrikuläre systolische Druck (RVSP) bei Ratten mit schweren PAH fast (Abbildung 1). Darüber hinaus entwickelt diese Ratten plexiformen Läsionen, konzentrische mediale und Intima-Verdickung, thromboembolische Obstruktion der distalen kleinen Pulmonalarterien, Entzündung, und sehr erhöhten Lungenarterie und rechtsventrikulärer Druck (Abbildung 2 ). Im Vergleich zu den chronischen Hypoxie, MCT-Injektion und Pneumonektomie nur Modelle von Pak in anderen Studien durchgeführt, schafft die Pneumonektomie kombiniert mit MCT oder Sugen Modell eine klinisch relevante Bedingung. Darüber hinaus hat dieses Modell wenn richtig durchgeführt, ein fast 0 % intraoperativ Sterblichkeit und nur eine 10 % Sterblichkeit Rate nach der Wiederherstellung nach Ausfall der rechten Lunge, respiratorischen Insuffizienz zu kompensieren. Höhere Raten von intraoperativen oder nach der Wiederherstellung Sterblichkeit ist normalerweise bezeichnend, dass Mensch oder Ausrüstung Fehler stattgefunden hat.
Um erfolgreich den linken Pneumonektomie durchzuführen und Pak zu erstellen, gibt es mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, das abgeschlossen werden müssen. Erstens ist es sehr wichtig, des Tieres Sauerstoffsättigung, Capnographie und Herzfrequenz während des gesamten Verfahrens, damit das Tier atmet und sein Herz schlägt zählen zu überwachen. Überwachung der Sauerstoffsättigung weiter bestätigt ordnungsgemäße Endotracheale Intubation. Sondenschaft das Tier ist absolut notwendig für dieses Verfahren. Wenn das Tier Brusthöhle geöffnet wird, wird der Unterdruck, der normalerweise in der Brusthöhle existiert auf atmosphärischen Überdruck verlagert. Ratten müssen also mit Überdruck über künstliche Beatmung zur Verfügung gestellt werden. Ohne korrekte Intubation werden das Tier Lungen aus der atmosphärischen Überdruck zusammenbrechen.
Die chirurgische Inzision muss seitlich erfolgen oder posterolateral und in der dritten Intercostalneuralgie Raum. Je nach Anatomie der Ratte müssen die Chirurgen öffnen einen anderen Intercostalneuralgie Raum um die Lunge und die Gefäße zu visualisieren. Mit anderen Ansätzen machen es sehr schwierig, die linke Lungenarterie zu erreichen. Beim Öffnen der Brusthöhle ist es sehr wichtig eine Elektrokauter Stift verwenden, um Blutungen aus der Haut, Muskeln, und rund um Schiffe zu stoppen. Wenn der Prüfer diesen Schritt überspringt, das Tier Blut verlieren und weniger Sauerstoff zirkulieren wird. Der Schnitt muss mindestens 2 cm lang sein, damit gibt es genug Platz zum Abschluss der gesamten Lunge bei der Ligation. Andernfalls wird der Prüfer das Gewebe reißen, wenn Sie versuchen, eine kleine Öffnung die Lunge entfernt. Es ist auch wichtig, atraumatische Pinzette verwenden, wenn die Lunge bewegen um Bersten des Gewebes und Blutungen zu vermeiden. Der Lungenarterie wird zunächst geschlossen, um zu verhindern, dass Blutungen aus Manipulation der Lunge. Der Prüfer sollte sehr vorsichtig sein, wenn Ligation der Schiffe zur Vermeidung der Schließung der linken Azygos Ader oder die Schiffe sonst reißen, das Tier stirbt. Darüber hinaus ist es viel einfacher für den Chirurgen, Titan-Hemoclips zu verwenden, anstatt Nähte an der linken Lungenarterie verbinden links wichtigsten Bronchus und linken Lungenvenen mit einer Naht. Da der Prüfer hat einen relativ langen Schnitt in der Intercostalneuralgie Raum zu machen, ist es notwendig, die Zwischenrippenmuskeln und Rippen mit Nahtmaterial zu schließen. Sobald die Brust geschlossen wird, Luft hat von der Brust wiederherstellen Unterdruck evakuiert werden und es ist wichtig, kontralaterale Lunge und Herz mit einem geschlossenen Pneumothorax zu vermeiden.
Schließlich ist einer der kritischsten Schritte Erholung nach der Ratte Pneumonektomie. Eine Thorakotomie gilt als eine sehr schmerzhafte Operation und Analgetika sind unerlässlich, um ausreichende Belüftung zu fördern, Lunge Ausflüge in der postoperativen Phase zu verbessern und Schmerzen zu lindern. Ratten sollten sternale Position Lunge Inflation zu maximieren wiederhergestellt werden. Nach 10 Minuten kann die Ermittler die Belüftungsrate um anzuregen das Tier um eigenständig atmen und aufwachen verringern. Wenn das Tier zyanotisch wird und Sauerstoff Sättigung Niveau zu verringern, ist es notwendig, erhöhen den Sauerstoff, Lüftungsrate und Tidalvolumen, 5 mL oder mehr abhängig von der Kapazität des Ventilators. Extubation der Ratten sollte erfolgen, so spät wie möglich, wenn das Tier ganz wach ist. Der Prüfer kann die Extubated Ratte in eine Kammer mit nur fließende Sauerstoff um weitere Genesung helfen setzen.
Wenn die Technik richtig ausgeführt wird und die vorstehenden Erwägungen richten, Durchführung einer linken einseitige Pneumonektomie kombiniert mit MCT oder Sugen schafft ein zuverlässiges Modell des schweren Pak als MCT allein, Hypoxie oder andere Methoden. Wenn die Pneumonektomie korrekt durchgeführt wird, das Tier überlebt, das Verfahren hat eine kurze Dauer (15-30 min) und der Prüfer braucht keine spezielle vaskuläre chirurgische Fähigkeiten. Darüber hinaus kann der Prüfer PAH erfolgreich zu erstellen. Die Grenzen dieser Methode sind, dass eine Thorakotomie ein invasives Verfahren ist, Endotracheale Intubation erforderlich, und der Prüfer einige allgemeine chirurgische Fähigkeiten braucht. Die Neointimal pulmonalen vaskulären okklusiven Läsionen und der ausgeprägten Anstieg der Lungenarterie Druck ähnlich wie bei menschlichen pulmonalen Hypertonie Patienten liegen auf der Hand bei Ratten nach dem Zusammenschluss der Pneumonektomie mit MCT oder SU5416 Injektion7 , 8 , 9. das vorliegende Modell ist eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Rolle von pulmonalen Überlauf in der kontralateralen Lunge und strömungsinduzierte Lungenhochdruck.
Dieses Protokoll möglicherweise nützlich für andere Krankheiten zu studieren. Es ist möglich, dieses Modell verwenden, um die kompensatorischen Wachstum des Lungen-Gewebes in der kontralateralen Lunge untersuchen. Diese Technik kann auch verwendet werden, zu studieren und Behandlungen für rechtsventrikuläre scheitern (RVF) zu entwickeln. Schweren rechten Ventrikels Hypertrophie entsteht bei Tieren, die Neointimal Läsionen von erhöhten arteriellen Druck7zu entwickeln. RVF verursacht Tod in etwa 70 % der Patienten mit PAH13. Erhöhung des pulmonalen Blutflusses kann nützlich sein, für die Untersuchung und Entwicklung von Behandlungen für Patienten sowie angeborene Herzerkrankungen leiden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Dieses Manuskript wurde von NIH unterstützt gewähren 7R01 HL083078-10 Stipendien von der American Heart Association AHA-17SDG33370112 und von den nationalen Instituten der Gesundheit NIH K01 HL135474, ys und von den nationalen Instituten der Gesundheit R01 HL133554, L.H
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps - Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
References
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