Summary

肺胞マクロファージの貧食能およびマウスにおける細菌クリアランス

Published: March 02, 2019
doi:

Summary

ここでマウス肺胞マクロファージおよび肺から細菌クリアランスの貪食能を分析するための一般的な方法を報告します。これらのメソッドは、フルオレセイン イソチオ シアン酸ビーズの貪食および緑膿菌緑色蛍光タンパク質の生体内で貪食能を検討します。マウスでをクリアするための方法について述べる。

Abstract

肺胞マクロファージ (AMs) は、肺の肺胞腔をガードします。AMs によって貪食病原体、死んだ細胞や異物の除去に侵入戦防衛で重要な役割を果たしている、炎症反応、組織改造の解像度では、処理の様々 な表面の受容器によって仲介されます。AMs。ここで、in vitro および in vivo アッセイおよび実験的戦略を使用してパターン認識受容体-、補体受容体 – と受容体を介した Fc ガンマを区別する AMs の貪食能の分析方法を報告します。貪食。最後に、我々 は確立し体内細菌クリアランスを評価するためにマウスで性肺炎モデルを特徴付ける方法をについて説明します。これらの試金は午前の機能を評価する最も一般的な方法を表し、マクロファージの機能と他の臓器に細菌クリアランスの勉強にも使えます。

Introduction

AMs は、休止期、1 つ認識を介して免疫反応の主要なプレーヤーと吸入の病原体や異物1,2の内面化、肺胞で主要な居住者食です。午前貪食の欠乏はしばしば呼吸の結果、AMs がクレブシエラ肺炎3,4など多くの肺病原体の迅速なクリアランスに欠かせないことが報告されています。などの感染症、急性肺炎死亡率と罹患率を引き起こす。

AMs は、サイトカインやケモカイン TNF α、il-1、ケモカインを生成し、炎症性好中球、単球を集める歯槽の環境の他の細胞のクロストークなどを生産することによって肺で生得的な炎症反応を開始するも、肺5適応免疫細胞。たとえば、AMs によって生成される il-1 は主要な上皮細胞6から好中球ケモカイン CXCL8 のリリースに役立ちます。また、AMs はアポトーシス多形核白血球 (Pmn) の貪食能、周囲の組織、組織の損傷の結果、長期の炎症細胞内酵素の持続的な漏出につながる Pmn からの失敗に貢献します。7,8,9

AMs が貪食は、AMs のパターン認識受容器 (PRRs)、オプソニン病原体の AMs の免疫エフェクター受容体との結合による病原体の表面に病原体関連分子パターンの直接認識によって媒介されます。10します。 後者の AMs は、Fcγ 受容体 (FcγR) で免疫グロブリン (IgG) とオプソニン ターゲットを認識できるまたは補体の断片、C3b と発見及び C3bi、補体受容体を介して病原体被覆 (CR)11。補体受容体の中で免疫グロブリン スーパーファミリー (CRIg) の CR は組織マクロファージ12で選択的に発現し、最近の知見肺炎のコンテキストで午前食から CRIg の役割を強調表示13

元の多くの研究は、マクロファージ機能14,15の分子メカニズムを記述するのにマクロファージ貪食能を評価するのにメソッドを使用します。しかし、生体内で貪食能のようなメソッドは、貪食の正確な定量を必要です。ここで、かに (FITC) を使用して生体外でそして生体内で貪食能の詳細な方法については要約-ガラス ビーズと緑色蛍光タンパク質 (GFP)、それぞれ。さらに、PRR、CR、および FcγR を介した細胞貪食の間で区別する方法をについて説明します。最後に、P.緑膿菌肺炎に関してマウスにおける細菌クリアランスをキャラクタライズ手法を報告する.

Protocol

このプロトコルの制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 東バージニア医学校のガイドラインに従います。 1. 蛍光ビーズ貪食 マウスを安楽死させる (c57bl/6 j、6 週齢、女性) 動物の倫理的な安楽死のため IACUC プロトコルに従って CO2窒息により。 ペーパー タオルで覆われて解剖基板上腹のマウスを置きます。その手足をイナバウアーで前足をダウ?…

Representative Results

まずマウスで貪食能を分析する実験を行った主な AMs。すべての解析を通して WT ・ TRIM72KOマウスから分離した AMs を比較しました。図 1Aのように、蛍光顕微鏡プライマリ AMs 発生 1 時間後のマウスで FITC ガラスビーズの貪食能を明らかにしました。図 1Bは、フローサイトメトリーによる貪食?…

Discussion

ガス交換機能を実行している間肺永続的異物、病原体、およびアレルゲンを直面しています。AMs は、主な機能、すなわち貪食のおかげで防衛の最初の行を提供します。AMs はまた他の免疫細胞が病原体を破壊して炎症の解像度を調整します。ここでは、具体的にはマウス肺から分離された AMs によって貪食能を評価する方法について述べる。本稿で提示されたプロトコルは、マクロファージの…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、R01HL116826 X. Zhao への交付金によってサポートされます。

Materials

18-G Needle Nipro Medical  CI+1832-2C Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF) Sigma-Aldrich D17106 Molecular Biology grade
70% Ethanol Decon Labs Inc. 18C27B Analytical grade
96-well plate Corning 3603 Cell Biology grade
ACK lysis buffer Life Technologies A10492 Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle Thermofisher Scientific Z23373 Molecular Biology grade
C5 deficient serum  Sigma-Aldrich C1163 Biochemical reagent
Centrifuge Labnet International C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher Scientific A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media Gibco 11995-065 Cell Biology grade
FBS Atlanta Biologicals S11550 Cell Biology grade
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Flow Jo Software FlowJo, LLC
Forceps Dumont 0508-SS/45-PS-1 Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads Sigma-Aldrich L4530 Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa ATCC 101045GFP Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish MatTek Corp. P35G-0.170-14-C Cell Biology grade
High-Pressure Syringe Penn-Century FMJ-250 Suitable for laboratory animal use
Homogenizer Omni International TH-01
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX73
Ketamine Hydrochloride Hospira CA-2904 Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains Thermofisher Scientific 9990700 Cell Biology grade
LB Agar Fisher Scientific BP1425 Molecular Biology grade
LB Broth Fisher Scientific BP1427 Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer Penn-Century IA-1C Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Reagent grade
PBS Gibco 20012-027 Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG  MP Biomedicals 55806 Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM  Cedarline Laboratories CL9000-M Suitable for immuno-assays
Scissors Miltex 5-2 Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope Penn-Century LS-2 Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) BioRad 1610301 Analytical grade
Spring Scissors (Med) Fine Science Tools 15012-12 Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small) Fine Science Tools 91500-09 Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)  MP Biomedicals 55876 Washed, preserved SRBCs
Urea Sigma-Aldrich U5378 Molecular Biology grade
Xylazine  Akorn Animal Health 59399-110-20 Pharmaceutical grade

References

  1. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
  2. Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
  3. Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
  4. Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
  5. Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
  6. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
  7. Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
  8. Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
  9. Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
  10. Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
  11. Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  12. He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
  13. Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
  14. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  15. Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
  16. Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
  17. Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).

Play Video

Cite This Article
Nagre, N., Cong, X., Pearson, A. C., Zhao, X. Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (145), e59088, doi:10.3791/59088 (2019).

View Video