Her rapporterer vi vanlige metoder for å analysere phagocytic funksjon murine alveolar makrofager og bakteriell klaring fra lungene. Disse metodene studere i vitro fagocytose av fluorescein isothiocyanate perler og i vivo fagocytose Pseudomonas aeruginosa Green fluorescerende protein. Vi har også beskriver en metode for å fjerne P. aeruginosa i mus.
Alveolar makrofager (AMs) vakt alveolar løpet av lungene. Fagocytose av AMs spiller en avgjørende rolle i forsvaret mot invaderende patogener, fjerning av død celler eller fremmede partikler og i oppløsning av inflammatoriske svar og vev remodeling, behandler som er formidlet av ulike overflate reseptorer av AMs. Her rapporterer vi metoder for analyse av den phagocytic AMs bruker i vitro og in vivo analyser og eksperimentelle strategier for å skille mellom den mønster anerkjennelse reseptor – supplement reseptor- og Fc gamma reseptor-mediert fagocytose. Til slutt, vi diskuterer en metode for å etablere og karakterisere P. aeruginosa lungebetennelse modell i mus å vurdere bakteriell klarering i vivo. Disse analyser representerer de vanligste metodene for å evaluere AM funksjoner og kan også brukes til å studere macrophage funksjon og bakteriell klarering i andre organer.
AMs er de store bosatt phagocytes i alveoli hvile scenen og en av de store aktørene av medfødte immunreaksjoner gjennom erkjennelsen og internalization inhalert patogener og fremmede partikler1,2. Det har blitt rapportert at AMs er avgjørende for den raske klarering av mange lunge patogener som P. aeruginosa og Klebsiella lungebetennelse3,4, så en mangel på AM fagocytose ofte resulterer i luftveiene infeksjoner, som akutt lungebetennelse, som forårsake høyere dødelighet og sykelighet priser.
AMs også starte medfødte inflammatorisk svar i lungene ved å produsere cytokiner og chemokines som TNF-α og IL-1β, hvilke crosstalk med andre celler av alveolar miljøet å produsere chemokines og rekruttere inflammatorisk nøytrofile, monocytter, og adaptive immunceller i lungene5. For eksempel, hjelper IL-1β produsert av AMs Prime utgivelsen av nøytrofile chemokine CXCL8 fra epitelceller6. Videre bidra AMs til fagocytose av apoptotisk polymorfonukleære leukocytter (PMNs), feil som fører til vedvarende lekkasje av intracellulær enzymer fra PMNs til omkringliggende vev, som resulterer i skade på vev og langvarig betennelse 7 , 8 , 9.
Fagocytose av AMs er formidlet av en direkte anerkjennelse av patogen-forbundet molekylær mønster på patogen overflaten av mønster anerkjennelse receptors (PRRs) av AMs eller ved binding av opsonized patogener med immun effektor reseptorer av AMs 10. for sistnevnte AMs kan gjenkjenne mål opsonized med immunglobulin (IgG) gjennom deres Fcγ reseptorer (FcγR) eller patogener belagt med supplement fragmenter, C3b og C3bi, gjennom deres supplement reseptorer (CR)11. Blant supplement reseptorer, CR av immunglobulin gruppe (CRIg) er uttrykt selektivt i vev makrofager12, og en siste finne valgte CRIg i AM fagocytose i sammenheng med P. aeruginosa lungebetennelse 13.
Mange opprinnelige studier bruk metoder for å vurdere macrophage fagocytose å beskrive molekylære mekanismer macrophage funksjon14,15. Men krever metodene som i vivo fagocytose en presis kvantifisering av fagocytose. Her vi oppsummere en detaljert metodikk for både i vitro og in vivo fagocytose bruker fluorescein isothiocyanate (FITC)-glass perler og P. aeruginosa grønne fluorescerende protein (GFP), henholdsvis. Videre forklare vi metoden skille blant PRR – CR- og FcγR-mediert fagocytose. Til slutt, vi rapportere en metode for å beskrive bakteriell klaring musen med hensyn til P. aeruginosa lungebetennelse.
Når du utfører en gass exchange funksjon, konfronterer lungene vedvarende fremmede partikler, patogener og allergener. AMs gir den første linjen i forsvaret i kraft av deres viktigste funksjon, nemlig fagocytose. AMs også koordinere med andre immunceller i ødelegge patogener og oppløsningen av betennelse. Her beskrevet vi metoder for å vurdere spesielt fagocytose av AMs isolert fra mus lungene. Protokollen presentert i dette manuskriptet forklarer en detaljert studie av fagocytose både i vivo og in vitro, som ogs…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av grant R01HL116826 til X. Zhao.
18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |