Alveolära makrofag fagocytos och bakterier Clearance hos möss
Summary
Här rapporterar vi gemensamma metoder för att analysera fagocytisk funktion murina alveolära makrofager och bakteriell clearance från lungan. Dessa metoder studera in vitro-fagocytos av fluorescein Isotiocyanat pärlor och Invivo fagocytos av Pseudomonas aeruginosa grönt fluorescerande Protein. Vi beskriver också en metod för att rensa P. aeruginosa hos möss.
Abstract
Alveolära makrofager (AMs) vakt alveolära utrymmet i lungan. Fagocytos av AMs spelar en avgörande roll i försvaret mot invaderande patogener, borttagning av döda celler eller främmande partiklar, och i resolutionen av inflammatoriskt svar och vävnad remodeling, processer som förmedlas av olika yta receptorer av AMs. Här, rapporterar vi metoder för analys av AMs med in vitro- och in vivo analyser och experimentella strategier för att skilja mellan de mönster erkännande receptor-, Komplettera receptor- och Fc gamma receptor-medierad fagocytos funktion fagocytos. Slutligen diskuterar vi en metod för att fastställa och karaktärisera en P. aeruginosa lunginflammation modell i möss att bedöma bakteriell clearance Invivo. Dessa analyser representerar de vanligaste metoderna för att utvärdera AM funktioner och kan också användas för att studera makrofag funktion och bakteriell clearance i andra organ.
Introduction
AMs är stora bosatt fagocyter i alveolerna vilande skedet, och en av de största aktörerna av medfödda immunsvaret genom erkännandet och internalisering av inhalerade patogener och främmande partiklar1,2. Det har rapporterats att AMs är avgörande för snabb clearance av många pulmonell patogener såsom P. aeruginosa och Klebsiella pneumoni3,4, så en brist i AM fagocytos ofta resulterar i luftvägarna infektioner, såsom akut lunginflammation, som orsakar dödlighet och sjuklighet högre.
AMs också initiera medfödda inflammatoriskt svar i lungan genom att producera cytokiner och chemokiner såsom TNF-α och IL-1β, som överhörning med andra celler av alveolära miljön att producera chemokiner och rekrytera inflammatorisk neutrofiler, monocyter, och adaptiv immunceller i lungan5. Till exempel, hjälper IL-1β produceras av AMs till prime frisläppandet av de neutrofila chemokine CXCL8 från epitelceller6. Dessutom bidra AMs till fagocytos av apoptotiska polymorfonukleära leukocyter (PMNs), bristande vilket leder till ihållande läckage av intracellulära enzymer från PMNs till omgivande vävnad, vilket resulterar i vävnadsskada och långvarig inflammation 7 , 8 , 9.
Fagocytos av AMs medieras av ett direkt erkännande av patogen-associerade molekylära mönster på patogen ytan av de mönster erkännande receptorsna (PRRs) av AMs eller bindning av opsonized patogener med immun effektor receptorer av AMs 10. det senare, AMs kan känna igen de mål som opsonized med immunglobulin (IgG) genom deras Fcγ-receptorer (FcγR) eller patogener belagda med komplement fragment, C3b och C3bi, genom deras komplement receptorer (CR)11. Bland komplement receptorer, CR av immunglobulin superfamiljen (CRIg) uttrycks selektivt i vävnad makrofager12, och en nyligen upptäckt markeras rollen av CRIg i AM fagocytos i samband med P. aeruginosa lunginflammation 13.
Många ursprungliga studierna använder metoder för att utvärdera makrofag fagocytos för att beskriva de molekylära mekanismerna makrofag funktion14,15. Metoder som i vivo fagocytos kräver dock en exakt kvantifiering av fagocytos. Här sammanfattar vi en detaljerad metod för både in vitro- och in vivo fagocytos med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-glas pärlor och P. aeruginosa grönt fluorescerande protein (GFP), respektive. Dessutom förklarar vi metoden för att skilja mellan PRR-, CR- och FcγR-medierad fagocytos. Slutligen rapporterar vi en metod att karakterisera bakteriell clearance i musen med avseende på P. aeruginosa lunginflammation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan du utför en gas exchange funktion, konfronterar lungan envist främmande partiklar, patogener och allergener. AMs ger den första försvarslinjen enligt deras huvuduppgift, nämligen fagocytos. AMs också samordna med andra immunceller förstöra patogener och i resolutionen av inflammation. Här, beskrivs vi metoder för att särskilt bedöma fagocytos av AMs isolerade från mus lungan. Det protokoll som presenteras i detta manuskript förklarar en detaljerad studie av fagocytos både in vivo och in vitro som ock…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av grant R01HL116826 till X. Zhao.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
