Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel
Summary
Hier bieden we een gedetailleerd protocol om te isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (EVs) hele weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor exemplaren. Deze methode biedt een reproduceerbare techniek om EVs extract van solide weefsel voor verder stroomafwaarts analyses.
Abstract
Circulerende en interstitiële kleine membraan-gebonden extracellulaire blaasjes (EVs) vertegenwoordigen veelbelovende doelstellingen voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische of voorspellende biomarker tests en waarschijnlijk fungeren als belangrijke spelers in de progressie van een groot spectrum van ziekten. Huidige onderzoek is gericht op de karakterisatie van blaasjes uitgescheiden door meerdere cel en weefseltypes (HLA) om beter begrijpen van de rol van het EVW in de pathogenese van voorwaarden waaronder neurodegeneratie, ontsteking en kanker. Wereldwijd consistente en reproduceerbare technieken te isoleren en te zuiveren van blaasjes blijven echter aan de gang. Methoden voor de winning van EVs uit solide weefsel ex vivo zijn bovendien nauwelijks beschreven. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het extraheren van kleine EVs van belang heel vers of bevroren weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor specimens, voor verdere karakterisering. We tonen het aanpassingsvermogen van deze methode voor meerdere stroomafwaartse analyses, met inbegrip van elektronenmicroscopie en immunophenotypic karakterisering van blaasjes, alsmede kwantitatieve massaspectrometrie van EV eiwitten.
Introduction
Kleine extracellulaire blaasjes (EVs) omvatten endosomal afkomstige exosomes en kleine membraan-loods microvesicles die brede biomedische aanbelangen. Kleine EVs zijn samengesteld uit een heterogene populatie van 50-250 nm membraan-gebonden blaasjes met biologisch actieve eiwitten, lipiden en nucleïnezuren die gezamenlijk worden verondersteld een belangrijke rol spelen in een veelheid van ziekteprocessen. Bevordering van onderzoek is met name betrokken deze blaasjes in neurodegeneratieve en prion aandoeningen, besmettelijke processen, auto-immune of inflammatoire voorwaarden, en tumorgroei en uitzaaiing1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. parallel belang bij de ontwikkeling van reproduceerbaar en rigoureuze methoden voor de isolatie en zuivering van deze blaasjes snel groeiende biomedisch onderzoek in de betekenis van het EVW in de pathogenese van de ziekte heeft gegenereerd.
Een historische en actuele uitdaging in EV karakterisering is het onvermogen om volledig aparte kleine EV subpopulaties. Deze uitdaging is grotendeels te wijten aan ons beperkte begrip van de verschillende moleculaire mechanismen inzake de biogenese van verschillende blaasjes. Overlappende omvang, dichtheid en biologische lading tussen subpopulaties verder windingen dit onderscheid. Een deel van deze uitdaging is ook het gebruik van de wijd uiteenlopende verrijking technieken, verstrekken van inconsistentie in downstream analyse van geïsoleerde blaasjes in laboratoria en ondermijning van de wereldwijde inspanningen voor het verlichten van de categorische EV populaties.
Het is vermeldenswaard dat de meerderheid van de karakterisering van het EV uit in vitro collectie van celkweek supernatant, werd uitgevoerd met recentere in vivo onderzoek met een beschrijving van technieken om te isoleren van de blaasjes van menselijke of dierlijke lichaam vloeistoffen, met inbegrip van plasma, urine , en speeksel. Terwijl EVs aanwezig in grote hoeveelheden in omloop zijn, is het ook erkend dat deze blaasjes spelen een belangrijke rol in de cel-naar-cel communicatie evenementen en aanwezig zijn in het interstitium van cellulaire weefsels. In het kader van kanker, kunnen interstitiële EVs worden met name van belang bij het moduleren van de tumor communicatie voor kankercel zaaien en metastatische groei14,15. Bijgevolg is er waarde in de ontwikkeling en de optimalisatie van technieken om de blaasjes uittreksel uit solide weefsel monsters. Deze methoden zullen een manier bieden waarmee zij rechtstreeks studie orgel – of tumor afkomstige EVs geoogst van klinische specimens, met inbegrip van kleine biopsieën en orgel van de gedeeltelijke of volledige resections.
In deze studie, en in een vorig rapport gepubliceerd door onze laboratorium16, wij streven ernaar te houden met verschillende belangrijke huidige problemen in EV verrijking methodologie: 1) om een reproduceerbare techniek om te isoleren en zuiveren van EVs volgens de hoogste normen momenteel te beschrijven geaccepteerd in het veld; 2) om te proberen om te isoleren van kleine EV subpopulaties hoogverrijkt in endosomal-afgeleide exosomes; en 3) om een protocol voor de winning van deze blaasjes uit solide weefsel monsters met het oog op verdere karakterisering.
Onlangs, Kowal en collega’s beschreven een relatief kleinschalige iodixanol dichtheid verloop om te scheiden en zuiveren van EV subpopulaties met grotere werkzaamheid dan vergelijkbare sacharose dichtheid verlopen17. In de aangehaalde studie, werden dendritische cel-afgeleide EVs gevangen in een relatief lichte dichtheid Fractie, overeenstemming met een dichtheid van 1.1 g/mL, hoogverrijkt in endosomal eiwitten beschouwd als meest consistente met een groot aantal exosomes aanwezig in dit breuk. Volgens de auteurs opgenomen deze eiwitten “bonafide” exosomal tumor gevoeligheid gene 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 en verschillende annexin eiwitten17. Wij later deze techniek om te slagen voor een methode van weefsel dissociatie beschreven door Perez-Gonzalez et al.18 en een daaropvolgende differentiële centrifugeren protocol te isoleren van de hele hersenen-afgeleide EVs16aangepast. We toonden ook aan het nut van deze methode in het karakteriseren van EV proteomes door het combineren van een sequentiële protocol voor downstream kwantitatieve en vergelijkende massaspectrometrie van vesiculaire eiwit, beschreven door onze laboratorium-19. Dit werk parallel die van het laboratorium van de heuvel, waarin EVs van de frontale cortex van de hersenen20werden verrijkt.
In deze studie, wij ingaan op deze techniek en verlenging van het protocol onlangs gepubliceerd van onze laboratorium aan het isolement van het EVW van solide Long tumoren. Om onze kennis is dit de eerste studie om te beschrijven een protocol om te verrijken EVs van ex vivo tumor exemplaren. Gezien de grote belangstelling in EVW als nieuwe diagnostische biomarkers en hun rol in de tumorigenesis, zal deze methode waarschijnlijk waardevol voor een toenemend aantal wetenschappelijke onderzoekers blijken. Vanuit het oogpunt van klinische kon interstitiële EVs haven grote diagnostische waarde, met name in specimens waar histologische evaluatie beperkt is. Onze hoop is dat de hier geschetste methode voor een basis voor een reproduceerbare techniek om te oogsten EVs uit vers of bevroren dier of mens chirurgische monsters zorgen zal, de weg vrijmaakt voor toekomstige werkzaamheden aan het licht brengen de belangrijke rol in de pathogenese van de ziekte deze kleine blaasjes kunnen spelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veel wetenschappelijke belang is gegenereerd met betrekking tot de rollen die kleine EVs in de communicatie van de tumor, evenals in de ontwikkeling van het orgel, rijping en functie spelen. Over het geheel genomen, deze studie biedt een geoptimaliseerde workflow voor de winning van intact EVs uit hele hersenen of tumor exemplaren. Terwijl wij hier gewoon de toepasselijkheid van deze techniek aan longkanker tumor afkomstige EVs tonen, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor werk aan andere stevige weefsels, bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Richard Nowakowski en de Florida State University laboratorium dier Resources voor de verlening en zorg voor de dieren gebruikt voor het ontwikkelen van dit protocol, met alle respect. Wij danken Liu Xia, Dr. Rakesh Singh en de Florida staat University translationeel Science Laboratory voor hulp met het werk van de Spectrometrie van de massa gebruikt voor downstream vesikel karakterisering, evenals de FSU biologische wetenschap Imaging Resource faciliteit voor het gebruik van het transmissie-elektronenmicroscoop in deze studie. Tot slot bedanken wij Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) voor donatie van de specimens van de tumor in de ontwikkeling van deze methode gebruikt. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Florida departement van gezondheid Ed en Ethel Moore Alzheimer’s Disease Research Program toegekend aan D.G.M. en J.M.O (6AZ11) en het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award nummer R01CA204621 toegekend aan D.G.M.
Materials
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
References
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer’s disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
- Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
- Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
- Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
- Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
- Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer’s disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
- Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
- Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
- Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
- Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes – large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).
