Utvinning av ekstracellulære blemmer fra hele vev
Summary
Her gir vi en detaljert protokoll for å isolere små ekstracellulære blemmer (EVs) fra hele vev, inkludert hjernen og tumor prøver. Denne metoden gir en reproduserbar teknikk for å trekke ut EVs fra solid vev for videre nedstrøms analyser.
Abstract
Sirkulerende og interstitiell små membran-bundet ekstracellulære blemmer (EVs) representerer lovende mål for utviklingen av romanen diagnostiske eller prognostiske biomarkør analyser, og trolig tjene som viktige spillere i utviklingen av et stort spekter av sykdommer. Nåværende forskning fokuserer på karakterisering av blemmer skilles ut fra flere celle og vev typer for å bedre forstå EVs rolle i patogenesen av inkludert neurodegeneration, betennelse og kreft. Imidlertid fortsatt globalt konsistent og reproduserbar teknikker å isolere og rense blemmer pågår. Videre beskrives metoder for utvinning av EVs fra solid vev ex vivo knapt. Her gir vi en detaljert protokoll for å trekke ut små EVs rundt fra helt friske eller frosne vev, inkludert hjernen og tumor eksemplarer, for ytterligere karakterisering. Viser vi tilpasningsevne denne metoden for flere nedstrøms analyser, inkludert elektronmikroskop og immunophenotypic karakteristikk av blemmer og kvantitative massespektrometri EV proteiner.
Introduction
Små ekstracellulære blemmer (EVs) inkluderer endosomal-avledet exosomes og små membran-skur microvesicles av bred biomedisinsk interesse. Liten EVs består av en heterogen befolkning av 50-250 nm membran-bundet blemmer som inneholder biologisk aktive proteiner og lipider nukleinsyrer som kollektivt spille en viktig rolle i et mangfold av sykdom prosesser. Fremme forskning har spesielt innblandet disse vesikler i nevrodegenerative og prion sykdommer, smittsomme prosesser, autoimmune eller inflammatorisk forhold, og tumor vekst og metastasering1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. raskt voksende biomedisinsk forskning inn i betydningen av EVs i sykdom patogenesen har generert parallelle interesse i å utvikle reproduserbare og strenge metoder for isolasjon og rensing av disse vesikler.
Historiske og dagens utfordring i EV karakterisering har vært manglende evne å fullt skille små EV subpopulasjoner. Denne utfordringen er vår begrensede forståelse av de ulike molekylære mekanismene som styrer biogenesis av forskjellige blemmer. Overlappende størrelse, tetthet og biologiske Last mellom subpopulasjoner ytterligere convolutes disse forskjellene. En del av denne utfordringen har også vært bruken av mye forskjellig berikelse teknikker, gir inkonsekvens i nedstrøms analyse av isolerte blemmer over laboratorier og undergrave global innsats for å belyse kategoriske EV populasjoner.
Det er verdt å merke seg at fleste EV karakteristikk er utført fra i vitro samling av cellekultur supernatant, med nyere i vivo studier som beskriver teknikker for å isolere blemmer fra dyr eller human kroppsvæsker, inkludert plasma, urin , og spytt. Mens EVs finnes i store mengder i omløp, anerkjent det også at disse vesikler spille en viktig rolle i celle til celle kommunikasjon arrangementer og i interstitium av mobilnettet vev. I forbindelse med kreft være interstitiell EVs spesielt viktig i modulerende svulst microenvironment for kreftcelle såing og metastatisk vekst14,15. Derfor er det verdi i utvikling og optimalisering av teknikker for å trekke ut blemmer fra solid vevsprøver. Disse metodene vil gi et middel til å direkte studere orgel – eller svulst – avledet EVs høstet fra klinisk eksemplarer, inkludert små biopsier og delvis eller full organ resections.
I denne studien, og i en tidligere rapport utgitt av vårt laboratorium16, vi rettet mot flere store gjeldende bekymringer i EV berikelse metodikk: 1) å beskrive en reproduserbar teknikk for å isolere og rense EVs til de høyeste standardene for øyeblikket akseptert i feltet. 2) å forsøke å isolere liten EV subpopulasjoner høyanriket i endosomal-avledet exosomes; og 3) å gi en protokoll for utvinning av disse vesikler fra solid vevsprøver for ytterligere karakterisering.
Nylig beskrevet Kowal og kolleger en relativt mindre iodixanol tetthet gradert å skille og rense EV subpopulasjoner med større effekt enn sammenlignbare sukrose tetthet forløpninger17. I den siterte studien, var dendrittiske celle-avledet EVs fanget i en relativt lett tetthet brøk, samsvarer med en tetthet på 1,1 g/mL, svært beriket i endosomal proteiner antas å være mest konsistente med en høy andel exosomes i dette brøk. Ifølge forfatterne inkludert disse “bona fide” exosomal proteiner svulst mottakelighet genet 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 og flere annexin proteiner17. Vi tilpasset senere denne teknikken for å lykkes en metode for vev dissosiasjon beskrevet av Perez-Gonzalez et al18 og en påfølgende differensial sentrifugering protokoll isolere hele hjerne-avledet EVs16. Vi viste også nytten av denne metoden i karakteriserer EV proteomes ved å kombinere en sekvensiell protokoll for nedstrøms kvantitative og komparativ massespektrometri vesicula protein, tidligere beskrevet av vårt laboratorium19. Dette arbeidet paralleller som fra Hill laboratoriet, der EVs ble beriket fra frontal cortex av hjernen20.
I denne studien vi utdype denne teknikken og utvide bruken av protokollen nylig publisert fra vårt laboratorium i isolasjon av EVs fra solid lunge svulst. Vi vet er dette den første studien å beskrive en protokoll for å berike EVs fra ex vivo svulst prøver. Gitt den utbredte interessen EVs som roman diagnostiske biomarkers og deres rolle i tumorigenesis, vil denne metoden trolig være verdifulle for et økende antall forskere. Fra en klinisk perspektiv, kan interstitiell EVs havn stor diagnostiske verdi, spesielt i prøver der histologic evaluering er begrenset. Vårt håp er at metoden skissert her vil gi grunnlag for en reproduserbar metode å høste EVs fra friske eller frosne dyr eller human kirurgisk prøver, banet vei for fremtiden å avdekke den betydelige roller i sykdom patogenesen disse små blemmer kan spille.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mye vitenskapelig interesse er generert med hensyn til rollene liten EVs spiller i svulst microenvironment og orgel utvikling, modning og funksjon. Total, denne studien gir en optimalisert arbeidsflyt for utvinning av intakt EVs fra hele hjernen eller svulst prøver. Mens her viser vi bare anvendelse av denne teknikken til lunge svulst-avledet EVs, kan denne metoden lett tilpasses for arbeid på andre solid vev, gir muligheter for ytterligere ex vivo karakteristikk av små utskilles blemmer av bred biomedisinsk interesse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Richard Nowakowski og Florida State University laboratorium dyr ressurser gir og omsorg for dyr som brukes til å utvikle denne protokollen, ærbødig. Vi takker Xia Liu, Dr. Rakesh Singh og Florida State University translasjonsforskning Science laboratorium for hjelp med massespektrometri arbeidet brukes for nedstrøms vesicle karakterisering, samt FSU biologisk vitenskap tenkelig ressurs anlegg for bruken av elektronmikroskop overføring i denne studien. Til slutt, vi takker Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) for donasjon av svulst prøver brukes i utviklingen av denne metoden. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Florida Department of Health Ed og Ethel Moore Alzheimers sykdom Research Program til D.G.M. og J.M.O (6AZ11) og National Cancer Institute av National Institutes of Health Award nummer R01CA204621 til D.G.M.
Materials
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
References
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer’s disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
- Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
- Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
- Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
- Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
- Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer’s disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
- Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
- Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
- Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
- Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes – large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).
