Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren.  Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.

Abstract

Van verontreiniging met aflatoxinen in levensmiddelen en diervoeders gewassen is een grote uitdaging wereldwijd. Aflatoxinen, geproduceerd door de schimmel Aspergillus flavus (A. flavus) zijn krachtige carcinogenen zijn die aanzienlijke vermindering van de waarde van het gewas in maïs en andere gewassen olie rijk zoals pinda naast ernstige bedreiging voor de gezondheid van mens en dier. Verschillende benaderingen, met inbegrip van traditionele fokken, transgene uiting van weerstand geassocieerde eiwitten en RNA-interferentie (RNAi)-gebaseerde host-geïnduceerde gene monddood maken van kritische A. flavus gene doelstellingen, worden geëvalueerd om te vergroten aflatoxine resistentie bij gevoelige gewassen. Afgelopen studies hebben aangetoond dat een belangrijke rol van α-amylase in A. flavus pathogenese en aflatoxine productie, suggereert dit gen/enzym is een potentieel doelwit zowel A. flavus groei en aflatoxine productie te verminderen. In dit opzicht werd de huidige studie uitgevoerd om te evalueren van heterologe expressie (onder controle van de constitutieve CaMV 35S promotor) van een Lablab purpureus L. α-amylase Inhibitor van de omwenteling-achtige eiwitten (AILP) in maïs tegen A. flavus. AILP is een 36-kDa proteïne, die een concurrerende Inhibitor van A. flavus α-amylase enzym en behoort tot de familie van de eiwitten lectine – arcelin – α-amylase-remmer gemeen Boon. In vitro onderzoek voorafgaand aan de lopende werkzaamheden had aangetoond de rol van AILP in remming van A. flavus α-amylase activiteit en de groei van zwammen. De groei van zwammen en aflatoxine productie in volwassen kernels werden gevolgd in real time via een uiting van het GFP A. flavus stam. Deze kernel screening test (KSA) is zeer eenvoudig op te zetten en biedt betrouwbare en reproduceerbare gegevens over infectie en de mate van verspreiding, die kan worden gekwantificeerd voor evaluatie van kiemplasma en transgene lijnen. De fluorescentie van het GFP-stam is nauw gecorreleerde aan schimmel groei en in het verlengde daarvan, het is goed gecorreleerd aan aflatoxine waarden.  Het doel van het huidige werk was om deze voorkennis in een commercieel belangrijk gewas als maïs om aflatoxine weerstand te verhogen. Onze resultaten tonen een korting van 35% – 72% in A. flavus groei in AILP-uiten transgene maïs kernels die, beurtelings, vertaald in 62%-88% vermindering aflatoxine.

Introduction

Mycotoxine besmetting door de schimmel geslachten, Aspergillus, Fusariumen Penicillium, Alternaria is een groot probleem van voedsel en diervoeders geteelde gewassen wereldwijd1,2,3. Onder deze plantpathogene schimmels heeft Aspergillus het hoogste nadelige effect op de waarde van het gewas en de gezondheid van mens en dier. Aspergillus flavus (A. flavus) is een opportunistische plant pathogenen die olie rijk gewassen zoals maïs-, katoenzaad- en pinda infecteert en produceert de potente kankerverwekkende stoffen, aflatoxinen, evenals talrijke giftige secundaire metabolieten (SMs). Maïs is een belangrijk voedsel en diervoeders gewas geteeld wereldwijd en is zeer gevoelig voor besmetting door A. flavus. De economische impact van de aflatoxineverontreiniging op verliest en lagere waarde in maïs kunnen maar liefst $686.6 miljoen per jaar in de VS2 met voorspelde veranderingen in het wereldklimaat, de impact van aflatoxinen kan leiden tot grotere economische verliezen in maïs met schatting zo hoog als $1,68 miljard per jaar in de nabije toekomst2. Gezien de negatieve effecten van de economische en de gezondheid van aflatoxinen in mens en vee, misschien controle van de wachttermijnen tot de oogst aflatoxine in maïs wel de meest efficiënte manier ter voorkoming van verontreiniging met aflatoxinen in levensmiddelen en diervoeders.

De aanpak van de grote wachttermijnen tot de oogst controle voor aflatoxine resistentie in maïs die uitgebreid in de afgelopen decennia is gebruikt is voornamelijk door het kweken, waarvoor een aanzienlijke hoeveelheid tijd4. Biocontrol had onlangs, heeft enig succes in vermindering van aflatoxine in grote schaal veld toepassingen5,6. Naast biocontrol heeft toepassing van geavanceerde moleculaire tools zoals 'Host geïnduceerde Gene Silencing' (HIGS) door middel van RNAi en transgene expressie van weerstand-geassocieerde eiwitten enig succes in vermindering van A. flavus groei en aflatoxine productie in kleine schaal laboratorium en veld studies. Deze benaderingen zijn momenteel naast het identificeren van nieuwe A. flavus gene doelwit voor toekomstige manipulatie wordt geoptimaliseerd.

Naast genen die rechtstreeks bij mycotoxine productie als doelwit van transgene bestrijdingsstrategieën betrokken zijn, is schimmel amylasen aangetoond dat ze spelen een cruciale rol bij het handhaven van succesvolle pathogenese en mycotoxine productie tijdens de vroege stadia van host plant infectie. Een paar voorbeelden zijn Pythium pleroticum (causale agent van gember rizoom rot), Fusarium solani (causale agent van bloemkool verwelken), waar positieve correlaties tussen pathogeniteit en α-amylase expressie en activiteit werden waargenomen 7,8. Remming van de activiteit van de α-amylase gen knock-out of vechtpartij benaderingen beïnvloedt negatief schimmel groei en toxine productie. Een α-amylase knockout mutant van A. flavus kon produceren van aflatoxinen als volwassen op zetmeel substraat of degermed maïs kernels9. Evenzo, Fusarium verticillioides een α-amylase knockout stam niet produceren fumonisine B1 (mycotoxine) tijdens de infectie van maïs kernels10. In een meer recente studie, Gilbert et al. (2018) aangetoond dat een RNAi gebaseerde knock down van A. flavus α-amylase meningsuiting via HIGS aanzienlijk verminderd A. flavus groei en aflatoxine productie tijdens maïs kernel infectie11 .

Specifieke remmers van α-amylase activiteit hebben ook soortgelijke resultaten opgeleverd, zoals down-regulatie van α-amylase expressie verkregen. Het eerste verslag over de rol van een α-amylase-remmer in schimmel weerstand kwam uit de isolatie en de karakterisering van een 14-kDa trypsine-α-amylase-remmer van maïs resistent tegen A. flavus12lijnen. Verder screening van honderden plantensoorten door Fakhoury en Woloshuk leidde tot de identificatie van een 36-kDa α-amylase Inhibitor van de omwenteling-achtige eiwitten (AILP) uit de zaden van de hyacint bonen, Lablab purpureus L.13. De volgorde van de peptide van de AILP leek op lectines behorend tot de familie van de lectine-arcelin-α-amylase-remmer gemeld gemeen bean14,15. Gezuiverde AILP doet niet elke inhiberende activiteit naar zoogdieren trypsine en verder in vitro karakterisering toonde significante remming van de groei van A. flavus en conidial kiemkracht13vertonen. De verslagen hier duidelijk toont α-amylase kan dienen als een doel in controle benaderingen te beperken van pathogenen of plagen die afhankelijk zijn van zetmeel mobilisatie (via α-amylase activiteit) en verwerving van oplosbare suikers als energiebron tijdens hun pathogene interactie met waardplanten.

Alpha-amylase is bekend om zijn kritische in A. flavus pathogeniteit9,10,11, en gezien het belang van AILP als een krachtige anti-A. flavus agent (α-amylase remming/antigrowth)13, We genereerden transgene maïs planten uitdrukken Lablab AILP gen onder de constitutieve CaMV 35S promotor. Het doel was om te onderzoeken als heterologe expressie van deze α-amylase-remmer in maïs effectief tegen A. flavus pathogenese en aflatoxine productie tijdens maïs kernel infectie is. Onze resultaten tonen aan dat transgene maïs kernels uiting van AILP aanzienlijk verminderd A. flavus groei en aflatoxine productie tijdens kernel infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmide constructies en maïs transformatie

  1. PCR versterken Lablab AILP invoegen met behulp van de inleidingen 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'en 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. De PCR voorwaarden omvatten een eerste denaturatie stap bij 98 ° C gedurende 30 s (stap 1), gevolgd door denaturatie bij 98 ° C gedurende 10 s (stap 2), gloeien bij 55 ° C gedurende 30 s (stap 3), rek bij 72 ° C gedurende 20 s (stap 4), 31 cycli van stap 2 naar stap 4 , en een definitieve rek stap bij 72 ° C gedurende 5 min. kloon het PCR-product in een gewijzigde pCAMBIA 1.300 vector met behulp van de Xbaik en Pstik beperkingsplaatsen. Het volgnummer van de laatste plant bestemming vector om te bevestigen de oriëntatie en de volgorde van de gekloonde AILP gen in de vector.
  2. Transformeren Agrobacterium stam EHA101 met de definitieve vector construct (Figuur 1) als eerder beschreven 16.
  3. Gebruik getransformeerd Agrobacterium met de laatste plant bestemming vector te transformeren van onrijpe maïs (Zea mays L. Hi-II) embryo's (uitgevoerd op de Plant transformatie faciliteit van Iowa State University) 16.
  4. T0 planten groeien in de kas (26-29 ° C; 16/8 h fotoperiode aangevuld met hogedruk nb-lampen) en herhaaldelijk self-pollinate om te verkrijgen T6 generatie om homozygosity voor de transgene karaktertrek.

2. spore kiemkracht assay

  1. Blad monsters oogsten en opslaan bij-80 ° C. Fijn blad monsters met een mortier en een stamper met behulp van vloeibare stikstof. Weeg 0,5 g in 2 mL microcentrifuge buizen, voeg 17 µL van proteaseinhibitor en buizen te plaatsen op het ijs.
  2. Buizen voor 10 min bij 16.000 x gcentrifugeren. Breng 225 µL van plant extract 0,5 mL microcentrifuge buizen en plaats op ijs.
  3. Maak een suspensie van de spore 5 mL van Aspergillus flavus 70 – GFP in 1% aardappel dextrose Bouillon (w/v) in een centrifugebuis 15 mL. Vortex en spore concentratie tot 105 sporen/mL met een haemocytometer aan te passen.
    Let op: A. flavus produceert aflatoxinen, all work met deze schimmel moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.
  4. Incubeer in VOB bij 28 ° C tot cultuur 50% inleiding van spore kiemkracht behaalt zoals aangegeven door de bolling van sporen.
  5. Vortex en aliquoot 25 µL spore oplossing voor de 225 µL plant extract. Incubeer monsters gedurende 20 uur bij 28 ° C met intermitterende schudden.
  6. Aliquot 25 µL van spore oplossing op een microscoopglaasje en meet de lengte van de kiem buizen sporen met behulp van de software van de digitale camera. Gebruik een minimum van 20 replicate metingen voor elke regel.
    Opmerking: In dit stadium plaats alle culturen bij 4 ° C om kolonie groei tot klaar om te tellen te stoppen.

3. kernel Screening Assay (KSA)

  1. KSA caps construeren door lijmen 4 module caps (22 mm) in een petrischaal 60 x 15 mm. Lijm gedurende 48 uur drogen voordat u caps is toegestaan. Elk KSA cap vormt een rep. (Figuur 2).
  2. In een steriele biologische veiligheidskast, spray een vierkante bioassay lade (24 x 24 cm) met 70% ethanol: H2O (v/v) en laat lucht drogen. Toevoegen steriele chromatografie papier in de lade. Spray 9 KSA caps met 70% ethanol, laat de lucht drogen, en in de bioassay lade plaatsen.
  3. Voor elke transgene maïs regel wordt getest, selecteer 20 onbeschadigd kernels en plaatst in een centrifugebuis 50 mL. Voeg 70% ethanol en laat 4 minuten zitten. Schud zachtjes buizen tijdens sterilisatie. Giet af de ethanol en spoel kernels driemaal in steriel gedeïoniseerd H2O.
  4. Maak een suspensie van de spore van Aspergillus flavus 70 – GFP17 uit een 6 dag oude cultuur geteeld op de drager van de V8 (5% V8 sap, 2% agar, pH 5.2).
    1. Voeg 20 mL steriele 0,02% Triton X-100/gedeïoniseerd H2O (v/v) en schroot uit sporen met een steriele lus. Pipetteer af de plaats in een steriele bekerglas van 300 mL en het entmateriaal.
    2. Maak een 5-fold verdunning met 0,02% Triton X-100, voer een spore count en voorzien van een haemocytometer. Verdun weer eventueel te verkrijgen met een concentratie van 4 x 106 sporen/mL 100 mL.
  5. Plaats de pitten in een steriele 300 mL-bekerglas met een roer-bar. Entmateriaal toevoegen aan het bekerglas.
    Let op: Het toevoegen van kernels aan entmateriaal tot oplossing voor splash. Plaats het bekerglas op een bord roer gedurende 3 minuten. Na 3 minuten, giet af entmateriaal in een bekerglas van leeg.
  6. Plaats met een pincet, kernels in de bioassay schotel (1 kernel/cap). Voeg 30 mL gedeïoniseerd water naar de bodem van elke bioassay-lade en Incubeer bij 31 ° C in het donker gedurende 7 dagen.
  7. Bereiden kernels voor fotografie.
    1. Gereserveerd 4 pitten van elke regel voor microscopische analyse en fotografie.
      Opmerking: Kernels kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C niet langer dan 5 dagen vóór de voltooiing van de fotografie.
    2. Neem foto's van de kernels na zeven dagen na inoculatie met A. flavus (Figuur 3).
    3. Schone buitenkant van kernels met een zacht weefsel en gedeïoniseerd water. Het uitvoeren van de longitudinale secties voor kernels en direct fotograferen onder de fluorescente microscoop.
  8. Bereiden kernels voor analyse.
    1. Schone buitenkant van resterende kernels met een zacht weefsel en gedeïoniseerd water.
    2. Plaats 4 pitten, vormen 1 rep, in een 15 mL schroefdop polycarbonaat ampul met 2 roestvast stalen ballen. Onmiddellijk bevriezen flesjes in vloeibare stikstof en winkel bij-80 ° C tot verdere verwerking en analyse.
    3. Verwijderen van flesjes uit de diepvries-80 ° C en vermalen kernels in een homogenizer bij 1500 t/min gedurende 3 minuten.
      Opmerking: Houd kernels met vloeibare stikstof bevroren.

4. PCR screening van transgene maïs kernels

  1. DNA isolatie kit gebruiken om te isoleren genomic DNA (gDNA) van verpulverde maïs kernels besmet met A. flavus volgens de instructies van de fabrikant. Kort, 280 µL buffer F, 20 µL protease en 3 µL dithiothreitol (DTT) toevoegen aan 10-15 mg van verpulverde maïs kernels. Incubeer en schudden in een thermomixer (56 ° C, 1200 rpm, 30 min). Centrifugeer bij 10.000 x g voor 1 min en overdracht van het supernatans dat duidelijk aan geëquilibreerd kolom. Incubeer bij kamertemperatuur voor 3 min en centrifuge bij 700 x g gedurende 1 minuut te elueren gDNA.
  2. Neem 0.8 µL van uitgepakte gDNA instellen op een 20 µL PCR reactie voor elk monster met behulp van een PCR-kit. Volg thermocycling voorwaarden zoals aanbevolen in het protocol van de fabrikant. De PCR voorwaarden omvatten een eerste denaturatie stap bij 98 ° C gedurende 5 min (stap 1) gevolgd door denaturatie bij 98 ° C gedurende 5 s (stap 2), gloeien bij 55 ° C gedurende 5 s (stap 3), rek bij 72 ° C gedurende 20 s (stap 4), 40 cycli van stap 2 naar stap 4 , en een definitieve rek stap bij 72 ° C gedurende 1 min (stap 5).
  3. Voorwaartse primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3 gebruikt ' en reverse primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' ter bevestiging van de aanwezigheid van de Lablab AILP gen in de transgene maïs kernels.

5. isolatie van de RNA, cDNA synthese en semi-kwantitatieve RT-PCR

  1. Neem gehomogeniseerd A. flavus besmet maïs kernels eerder opgeslagen bij-80 ° C voor RNA extractie. Pak met behulp van een totaal RNA isolatie kit volgens protocol van de fabrikant maar met kleine wijziging18RNA. Na het toevoegen van 50 mg gehomogeniseerde maïs kernel poeder in de buffer van de extractie, meng dit goed (zonder vortexing) met behulp van een 1 mL pipet tip en laat het op ijs voor 5-6 minuten voordat u verdergaat naar latere stappen zoals beschreven in het protocol van de fabrikant.
  2. CDNA met behulp van een cDNA synthese kit volgens de fabrikant protocol 18voor te bereiden.
  3. 0,5 µL van onverdunde cDNA per PCR reactie voor semi-kwantitatieve RT-PCR gebruikt als eerder beschreven18. Gebruik van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' en qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' respectievelijk te detecteren Lablab AILP genexpressie, en forward en reverse van inleidingen qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ en qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ respectievelijk voor expressie van maïs ribosomal structurele gen (Rib), GRMZM2G024838,19 als een huis-houden-gen.

6. GFP kwantificatie

  1. Bereiden van 50 mL elk van 0,2 M monobasisch natriumfosfaat (NaH2PO4) en dibasische natriumfosfaat (nb2HPO4·7H2O) van 0.2 M in gedeïoniseerd H2O.
  2. 100 mL fosfaatbuffer pH 7.0 Sorenson van make-up. Voor pH 7.0, 19.5 mL NaH2PO4 voorraad, 30,5 mL NaHPO4·7H2O voorraad en 50 mL gedeïoniseerd H2O. toevoegen
  3. Weeg 25 mg grond kernel materiaal (vers gewicht, FW) en plaats in een tube van 1,0 mL microcentrifuge. 500 µL fosfaatbuffer toevoegen aan de centrifugebuis en vortex voor 30 s.
  4. Monsters gedurende 15 minuten bij 16.000 x gcentrifugeren. Pipetteer 100 µL bovendrijvende substantie in een zwart 96 goed plaat. Lees de monsters met een Fluorimeter (excitatie 485 nm, emissie 528 nm).

7. totale gehalte aan aflatoxine analyse

  1. Monster verwerking en aflatoxine extractie
    1. Droge kernel monsters in een geforceerde lucht oven voor 2 dagen bij 60 ° C. Weeg monsters en breng in een 50 mL erlenmeyerkolf met een glazen stop.
    2. Voeg 25 mL methyleenchloride aan elke maatkolf in een zuurkast.
      Let op: Methyleenchloride is zeer vluchtig en wordt beschouwd als gevaarlijke (irriterende, kankerverwekkend). Noch latex als nitril handschoenen zijn veilig voor het werken met methyleenchloride. VERBETERDE organisch oplosmiddel bestendige PolyVinylAlcohol handschoenen te gebruiken.
    3. Schud de monsters gedurende 30 minuten op een pols actie shaker. Na 30 min, giet langzaam het extract door een cirkel gecanneleerde filtreerpapier in een bekerglas van 80 mL. Laat de bekerglazen droog 's nachts in een zuurkast.
    4. De volgende dag, spuiten methyleenchloride (circa 5 mL) rond de binnenkant van de rand van de droge bekers, wervelen rond en giet in 2 dram glazen flesjes. Verlof flesjes open's nachts drogen in een zuurkast.
  2. Aflatoxine analyse
    1. Toevoegen van 4,0 mL 80% methanol: gedeïoniseerd H2O (v/v) voor flesjes.
    2. Gebruik een aflatoxine extractie kit voor het filteren van zuiveren methanolische oplossing met de meegeleverde kolom. Analyseren totaalgehalte aan aflatoxine niveaus met een Fluorimeter, volgens de instructies van de fabrikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Maïs transformatie en moleculaire screening van transgene planten

Onrijpe embryo's van maïs Hi-II lijnen werden omgevormd met Agrobacterium tumefaciens EHA101 stam met de laatste plant bestemming vector die de AILP -gen uitdrukt Lablab purpureus onder de controle van de CaMV 35S promotor. Vijf onafhankelijk getransformeerde maïs lijnen werden schoof op naar de T6 generatie voor latere studies. De transgene maïs planten waren veel kleiner en minder krachtig, maar geen eventuele andere afwijkingen t.o.v. de isogene negatieve controle planten vertonen. PCR versterking van de target AILP gen toonde een 548 bp amplicon, alleen in de transgene maïs lijnen ten opzichte van de controle-planten (figuur 4A) waargenomen. Het AILP -gen toonde expressie in de transgene lijnen overwegende dat geen AILP uitdrukking werd waargenomen in de controle-planten (figuur 4B).

Aspergillus flavus Spore assay met blad extracten

Ruwe blad wordt geëxtraheerd uit jonge transgene maïs planten werden voorbereid door slijpen in vloeistof N en bij 16.000 x gcentrifugeren. Vroege fase kiemende sporen werden blootgesteld aan het blad extract voor 20 uur en de gemiddelde spore hyphal lengte is opgenomen van 20 monsters. Hyphal lengte van sporen blootgesteld aan transgene blad extracten een 58%-80% vermindering in vergelijking met de negatieve controle (Figuur 5)

Aspergillus flavus groei tijdens kernel infectie

Een Kernel Screening Assay (KSA) werd uitgevoerd om te onderzoeken de groei van A. flavus in de transgene en controle-kernels. Uitdrukking van het gen AILP in transgene kernels beïnvloed negatief A. flavus groei. De stam van de A. flavus gebruikt in de huidige studie bevat een GFP-verslaggever waarmee de controle op en kwantificering van de groei van zwammen in real-time. Significante vermindering van de fluorescentie GFP werd waargenomen in transgene AILP kernels in vergelijking met de isogene negatieve controle (Figuur 6). AILP lijnen 4 en 5 toonde een significante vermindering in de groei van zwammen, 69 en 72%, respectievelijk, gevolgd door de andere regels waar een 35%-60% vermindering werd waargenomen in vergelijking met de controle-kernels (figuur 7A).

Aflatoxin in de besmette kernels productie

Heterologe expressie van het AILP -gen in maïs resulteerde in aanzienlijke vermindering van het aflatoxinegehalte in de transgene lijnen vs. controle. De aflatoxine gegevens verstrekt hier is het totale aflatoxinegehalte gedetecteerd in de besmette kernels. Een 62-88% daling aflatoxinegehalte werd waargenomen in de AILP-kernels ten opzichte van het besturingselement (figuur 7B). Onder de 5 verschillende lijnen van de AILP toonde lijn 4 het laagste aflatoxinegehalte (486 ng/g DW), gevolgd door andere lijnen variërend tussen 640-1,498 ng/g DW in de kernels vs. controle (3,986 ng/g DW).

Figure 1
Figuur 1: Vector design voor transgene expressie van Lablab AILP gen in maïs. 35S = bloemkool mosaic virus of CaMV constitutieve promotor; RB = rechterrand; LB = rand aan de linkerkant; nptII = neomycine phosphotransferase-kanamycine resistentie gen; amendementen en 35s = transcriptie afsluitweerstanden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Kernel Screening Assay. (A, B) Steriliseren kernels en giet in een steriele bekerglas in een biologische veiligheidskast. (C-E) Inoculeer kernels met A. flavus entsuspensie. (F-H) Plaats met een steriel pincet kernels in bioassay schotel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Licht microfoto van A. flavus groei. (A) isogene negatieve controle. (B – F) Transgene kernels AILP (lijnen 1-5) één week na inoculatie uitdrukken. Schaal bar = 1 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Moleculaire screening van transgene planten. (A) PCR bevestiging van transgene maïs planten (banen 1-5) met Lablab AILP (548 bp diagnostische fragment van DNA; C = isogene negatieve controle; NEB 2-Log DNA ladder gebruikt als een DNA-merker). (B) uitdrukking van Lablab AILP gen in transgene maïs lijnen (banen 1-5) met behulp van de RT-PCR. Lane C vertegenwoordigt isogene negatieve controle. Maïs ribosomal structurele gen (Rib), GRMZM2G02483819 werd gebruikt als een house-keeping gen (NEB 2-Log DNA ladder: DNA marker). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. Effect van ruwe blad wordt geëxtraheerd uit de transgene maïs AILP planten op A. flavus spore kiemkracht ten opzichte van een isogene negatieve controle (neg). Gemiddelde scheiding werd gedaan door de Dunnett post-test na ANOVA. Niveaus van significante vermindering worden aangeduid door sterretjes (***P ≤ 0.0001). Foutbalken geven de standaardfout van middelen voor twintig monsters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6. GFP fluorescentie die afkomstig zijn van de A. flavus stam 70-GFP in transgene kernels uiting van AILP na een week van bioassay. Isogene negatieve controles (A) werden gebruikt om te evalueren van de schimmelinfectie en verspreid in transgene kernels (B-F vertegenwoordigen transgene 1-5). Ten minste vier kernels waren gescreend voor elke regel onder de fluorescente microscoop. Schaal bar = 2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: Een flavus productie op het gebied van groei en aflatoxine. (A) A. flavus 70-GFP infectie en de groei van maïs kernels na 7 dagen in een Kernel Screening test. Gemiddelde van de drie onafhankelijke experimenten met vier biologische repliceert telkens. GFP kwantificering (in relatieve fluorescentie eenheden, RFU) geeft aan dat de groei van zwammen in transgene maïs lijnen uiten AILP een isogene negatieve controle. Gemiddelde scheiding werd gedaan door de Dunnett post-test na ANOVA. Niveaus van significante vermindering wordt aangeduid met een asterisk (*P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001). Foutbalken geven de standaardfout van middelen voor de vier gerandomiseerde biologische wordt gerepliceerd. (B) aflatoxine productie door A. flavus 70-GFP in maïs kernels na 7 dagen in een Kernel Screening test. Gemiddelde van 12 biologische wordt gerepliceerd en elke repliceren bevatte vier pitten. Aflatoxine niveaus in transgene AILP kernels (lijnen 1-5) ten opzichte van een isogene negatieve controle (neg). Gemiddelde scheiding werd gedaan door de Dunnett post-test na ANOVA. Niveaus van significante vermindering wordt aangeduid met sterretjes (**P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001). Foutbalken geven de standaardfout van middelen voor de vier gerandomiseerde biologische wordt gerepliceerd. Zie aanvullende cijfers de gegevens wilt weergeven in deelvenster B verstoken van vooringenomenheid als gevolg van schimmel remming. Sluiten van de correlatie tussen GFP = RFU en aflatoxine waarden zijn ook beschikbaar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Sup Figure 1
Aanvullende figuur 1: Gegevens uit figuur 7B opnieuw getekend om aan te tonen van aflatoxine productie door A. flavus 70-GFP in maïs kernels na 7 dagen in de bepaling van de Screening van een Kernel te elimineren vooringenomenheid als gevolg van de remming van de groei van zwammen. Aflatoxine waarden werden verdeeld door de remming van de groei van zwammen vertegenwoordigd als GFP-RFU waarden in figuur 7B. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Sup Figure 2
Aanvullende figuur 2: sluiten van de correlatie tussen GFP-RFU waarden (= de groei van zwammen) en aflatoxine niveaus (r2 = 0.86) gemeld in de KSA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Opbrengst verliezen in landbouwgewassen als gevolg van ziekteverwekkers en plagen is een mondiaal probleem20. Momenteel, toepassing van synthetische fungiciden en pesticiden is de overheersende middelen voor controle plant ziekteverwekkers en plagen, maar resterende toxiciteit van deze biochemische stoffen in levensmiddelen en diervoeders kan vormen ernstige bedreiging voor de gezondheid van mens en dier21. Gezien het economisch belang van maïs als voedsel en diervoeders gewas, verlaging of afschaffing van de aflatoxineverontreiniging is van het allergrootste belang2,3,22. Fokken van de conventionele via resistente gen introgressie in gevoelige rassen is een tijdrovend proces en dergelijke weerstand is niet altijd stabiel aangezien aflatoxine weerstand een polygeen eigenschap is en expressie van genen die deelnemende aanzienlijk verschillen met veranderingen in de omgevings parameters4. Alternatieve benaderingen worden geëvalueerd om te verhogen en host plant verdediging tegen A. flavus in een ecovriendelijke manier stabiliseren.

In de huidige studie kozen we om te evalueren van de doeltreffendheid van het AILP gen van de hyacint bonen in maïs tegen A. flavus. Als AILP een concurrerende inhibitor van α-amylase is en ook antischimmel eigenschappen bezit, hebben wij dit gen onder een sterke constitutieve promotor CaMV 35S. Het doel was om de verhoging van de productie van deze heterologe eiwit in maïs ongeacht hun ontwikkelingsstadium of weefseltype. Belangrijke uiting van het α-amylase gen in de transgene maïs lijnen (figuur 4AB) ondersteunt stabiele uitdrukking van dit gen in een heteroloog systeem. Dit beïnvloed negatief de groei van zwammen als blijkt uit de afname van de ruimtelijke spreiding van GFP fluorescentie binnen de besmette AILP kernels en afname van de algehele GFP fluorescentie in de kernels (Figuur 6 en figuur 7A).

De ontwikkeling van de Kernel Screening Assay (KSA) maakt gebruik van een genetisch gemanipuleerde A. flavus verslaggever stam die een gen uitdrukt codering van de groen fluorescente proteïne (GFP) uit de kwal Aequorea victoria18, 23. om te ontwikkelen bestrijdingsstrategieën voor elke ziekteverwekker, is het noodzakelijk om te begrijpen van de wijze van besmetting, verspreid en kolonisatie in de waardplant of weefsel. De kolonisatie en de verspreiding van de aflatoxigenic-saprophyte, A. flavus is niet goed begrepen omdat genetische regulering van de weerstand tegen het pathogene agens oplevert, indien aanwezig, niet goed wordt begrepen. Gebruik van het GFP-uiten A. flavus stam maakt het mogelijk om bij te houden in realtime, het proces van de infectie en de kolonisatie. Het GFP-stam en de wild-type niet aanzienlijk afwijken pathogen agressiviteit en aflatoxine productie23. Echter, wordt het GFP-gen in deze bepaalde spanning geplaatst onder de controle van de constitutively uitgesproken glyceraldehyde fosfaat dehydrogenase (gpdA) gene promotor 24 die geschikter is voor het bijhouden van de groei van zwammen. Echter, met behulp van deze vlek op katoenzaad en maïs kernels, hebben wij aangetoond een nauwe relatie tussen GFP fluorescentie die afkomstig zijn van de schimmel aan de groei van zwammen en aflatoxine niveaus18,23.

Om vast te stellen een nauwe correlatie met aflatoxine vermogen produceren, zullen gfp gedreven door de initiatiefnemers van de gen van aflatoxine zoals omtA of ver-125,26 geschikter dan gpdA. De fluorescentie GFP is gevoelig genoeg voor detectie en meting in real time van zelfs kleine veranderingen in de groei van zwammen, zowel in vitro als in planta, en evaluatie van remmende werkzaamheden van onbekende antischimmel eiwitten en peptiden zoals AILP en anderen11,17,18,23. Resultaten van de KSA correleert bovendien goed met veld prestaties van resistente of gevoelig maïs regels met betrekking tot de evaluatie voor aflatoxine besmetting27.

De KSA is zeer nuttig in ons laboratorium scherm klassiek-gefokte nieuwe rassen4 en transgene lijnen11,18. Het is gemakkelijk te installeren en uitvoeren van KSA in elk laboratorium. Men moet onbeschadigd schone kernels gebruiken voor het uitvoeren van deze test, zodat een duidelijk begrip van host plant-schimmel interactie kan worden geëvalueerd. Wij scannen routinematig alle de kernels die we in ons laboratorium onder een stereomicroscoop gebruiken vóór het uitvoeren van de test. Opgemerkt moet worden dat de voorwaarden die wij voor de KSA inzetten hoge luchtvochtigheid (95% RH) en constante temperatuur (31 ° C omvatten). Met het begin van gesimuleerde kiemkracht proces onder deze omstandigheden biedt de bepaling ideale omstandigheden voor het testen van de integriteit van de vacht van het zaad, de genetische samenstelling van de kernels met inbegrip van antischimmel genen/eiwitten ingeschakeld tijdens kieming, en/of schimmel infectie. Schimmel infectie en aflatoxine productie zal altijd hoger in KSA ten opzichte van het voorkomen ervan in het veld; Nochtans, is een nauwe correlatie gevestigde4,27geweest.

We hebben aangetoond in deze KSA dat AILP de groei van zwammen in maïs-kernels vermindert. AILP bezit antischimmel eigenschappen van plant lectinen, en is aangetoond dat α-amylase, remmen, afnemende zetmeel afbraak en de beperking van de groei van zwammen. In vitro studies aangetoond dat AILP staat remming van A. flavus was was de groei in suikerrijke aardappel dextrose Bouillon (VOB) kunstmatige groeimedium, die haar antimycoticum/groei remming activiteiten duiden onafhankelijk van haar amylase remming activiteit13. Andere plant lectines geïsoleerd van Urtica dioica (brandnetel gemeenschappelijk), Hevea brasiliensis (rubberboom), en knollen van Solanum tuberosum (aardappel) blijkt ook vergelijkbare antischimmel eigenschappen en groei van Botrytis cinerea geremd , Pyrenophora triticien Fusarium oxysporum28,29,30,31. Alfa-amylase-remmers zijn niet alleen effectief tegen schimmels en bacteriën maar ook effectief tegen insectenplagen32werden getoond. Alfa amylasen worden gemeld te worden cruciaal voor normale groei en ontwikkeling van planten-voeding insecten, en verscheidene insecten α-amylase-remmers zijn geïsoleerd uit planten zoals tarwe, gemeenschappelijke bonen en maïs12,,33, 34,35. Een significante vermindering van schimmel hyphal lengte van sporen blootgesteld aan ruwe blad extracten (Figuur 5), afname van de groei van zwammen in de AILP-uiten maïs kernels zoals blijkt uit de vermindering van GFP fluorescentie, zowel kwalitatief ( Figuur 6) en kwantitatief (figuur 7A) is mogelijk te wijten aan een combinatie van de α-amylase inhibitie en schimmeldodende eigenschappen. Experimenten met behulp van deze uiting van AILP maïs planten tegen andere ziekteverwekkers en plagen in de toekomst zullen van groot belang voor het testen van de werkzaamheid tegen uiteenlopende biotische stressfactoren van zaad en vegetatief weefsels. Het Antimycoticum en groei eigenschappen van de remming van lectine is voornamelijk toegeschreven aan haar dwarsbinding met chitine en remming van hyphal tip uitbreiding28. In feite toonde in vitro AILP-gemedieerde remming van α-amylasen van uiteenlopende schimmel en bacteriële oorsprong meer dan 65% inhibitie in schimmel ziekteverwekkers, met inbegrip van A. flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium victoriaeen 41 % remming in de bacteriële ziekteverwekker Bacillus subtilis13. De resultaten op vermindering van A. flavus groei gepresenteerd hier komen overeen met de rol van α-amylase-remmers als antischimmel agenten. De huidige studie verder toont aan praktische toepassing van dergelijke nuttige informatie verkregen uit eerder in vitro studies.

Verlaging van het aflatoxinegehalte (figuur 7B) in de AILP-uiting van maïs lijnen is misschien te wijten aan de remming van A. flavus α-amylase activiteit, leidt tot verminderde afbraak van opgeslagen zetmeel, en verminderd verwerving van suikers als een de bron van de energie van de maïs kernels tijdens pathogene interactie. Als schimmel α-amylase een belangrijke rol speelt in het afbreken van zetmeel van de kernel, verandert elke wijziging in de schimmel α-amylase activiteit door AILP waarschijnlijk oplosbare suikergehalte tijdens kernel infectie. Gehalte aan oplosbare suikers, met name sucrose en glucose, heeft sterk is gecorreleerd met verhoogde productie van AFB1 en totaal aflatoxinen in maïs en andere gewassen A. flavus gevoelig zoals pinda36,37. Sacharosegehalte in kunstmatige groei media verhoogt, A. flavus aflatoxine productie38. Andere oplosbare suikers zoals glucose en maltose bijdragen ook positief aan aflatoxine productie zowel in kunstmatige media en zaad substraten38. Remming van α-amylase activiteit en afname van de productie van de mycotoxine in andere schimmels wordt een belangrijke rol van schimmel α-amylasen in toxine productie tijdens kernel infectie versterkt. Alpha-amylase knockout mutanten van zowel F. verticillioides en A. flavus mislukt fumonisine B1 en aflatoxinen respectievelijk na infectie van maïs kernels9,10te produceren. Evenzo, down-regulatie van A. flavus α-amylase aanzienlijk verminderd schimmel groei en aflatoxine productie tijdens maïs kernel infectie11. Een 62-88% daling aflatoxine in de transgene regels zijn in overeenstemming met eerdere rapporten over de rol van α-amylase in aflatoxine productie. Het moet worden opgemerkt dat de in vitro Kernel Screening Assay (KSA) strenger zijn dan normaal gevonden onder natuurlijke omstandigheden. Omstandigheden tijdens de in-vitro-assay ook zeer bevorderlijk zijn voor aflatoxine productie, zodat de procentuele verandering in het aflatoxinegehalte in de transgene lijnen zinvoller in plaats van de absolute aantallen aflatoxinegehalte in de besmette kernels wellicht. De hier gepresenteerde resultaten zijn veelbelovend en toekomstige experimenten onder veldomstandigheden zijn belangrijk voor het onderzoeken van het potentieel van deze AILP-uiting van maïs lijnen voor aflatoxine weerstand onder een natuurlijke scenario.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflict van belang.

Acknowledgments

Wij danken David Meints, Universiteit van Arkansas voor zijn hulp bij de ontwikkeling en het analyseren van de transgene maïs tijdens de vroege generaties. Dit werk kreeg financiële steun van de USDA-ARS CRIS project 6054-42000-025-00D. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in dit artikel is uitsluitend met het oog op het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of bekrachtiging door het Amerikaanse ministerie van landbouw. USDA-ARS gelijke kansen van de werkgelegenheid (eet) beleid mandaten van gelijke kansen voor alle personen en verbiedt discriminatie op alle aspecten van het personeelsbeleid van het Agentschap, praktijken en bewerkingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

Milieuwetenschappen kwestie 144 α-amylase-remmer aflatoxine Aspergillus flavus maïs kernel assay Lablab purpureus maïs transgene screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajasekaran, K., Sayler, R. J.,… More

Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter