Summary
Graft एक प्रकार का रोग ऊतक में एक महत्वपूर्ण बाधा बन गया है एयरवे रिप्लेसमेंट इंजीनियर । एक प्रकार का रोग अंतर्निहित सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए, हम बोये अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर सेल (बीएम-MNC) के साथ ऊतक इंजीनियर ट्रेकल रिप्लेसमेंट के एक म्यूरिन मॉडल का उपयोग । यहां, हम विस्तार पाड़ विनिर्माण, बीएम-mnc अलगाव, भ्रष्टाचार बोने, और आरोपण सहित हमारे प्रोटोकॉल, ।
Abstract
जन्मजात या माध्यमिक लंबे खंड वातक दोषों के लिए उपचार के विकल्प ऐतिहासिक रूप से कार्यात्मक ऊतक की जगह असमर्थता के कारण सीमित किया गया है । ऊतक इंजीनियरिंग एक 3 आयामी पाड़ में कोशिकाओं और संकेत अणुओं को एकीकृत करने की क्षमता के साथ एक संभावित समाधान के रूप में महान वादा रखती है । ऊतक के साथ हाल ही में काम कर रहे है वातक grafts इंजीनियर (tetgs) कुछ सफलता देखा है, लेकिन उनके अनुवाद grafts stenosis, भ्रष्टाचार पतन, और देरी उपकला द्वारा सीमित किया गया है । आदेश में इन मुद्दों ड्राइविंग तंत्र की जांच करने के लिए, हम ऊतक के लिए एक माउस मॉडल विकसित किया है वातक भ्रष्टाचार आरोपण इंजीनियर । TETGs का निर्माण किया गया था electrospun पॉलिमर पॉलीथीन terephthalate (पीईटी) और polyurethane (पु) के एक मिश्रण में पीईटी और पु (20:80 प्रतिशत वजन) । मचानों तो अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का उपयोग 6-8 सप्ताह पुराने C57BL से अलग किया गया-ढाल केंद्रापसारक द्वारा चूहों भ्रष्टाचार प्रति १०,०००,००० कोशिकाओं पाड़ के लुमेन पर बोये गए और तीसरे और सातवें वातक छल्ले के बीच आरोपण से पहले रातोंरात सेने की अनुमति दी । इन grafts एक प्रकार का रोग और विलंबित उपकला के निष्कर्षों के रूप में ऊतकीय विश्लेषण और केरातिन 5 और केरातिन 14 बेसल उपकला कोशिकाओं immunofluorescence पर की कमी के द्वारा प्रदर्शित करने में सक्षम थे । यह मॉडल सेलुलर और आणविक मेजबान remodeling में शामिल तंत्र की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में काम करेंगे ।
Introduction
दीर्घ-खंड श्वाशलता दोष के रूप में दुर्लभ जन्मजात स्थितियों जैसे कि पूरी तरह से श्वाशलता के छल्ले और श्वासंतक आगेनेसिस, साथ ही आघात, द्रोह, और संक्रमण के रूप में पेश कर सकते हैं । जब वयस्कों में 6 सेमी या बच्चों में श्वासक लंबाई के 30% से अधिक है, इन दोषों सर्जिकल पुनर्निर्माण द्वारा इलाज नहीं किया जा सकता है । ऑटोलॉजिकल ऊतक, कैडेवेरिक प्रत्यारोपण, और कृत्रिम निर्माणों के साथ एयरवे को बदलने के प्रयास पुराने संक्रमण, कणिकायन, यांत्रिक विफलता, और स्टेनोसिस से ग्रस्त हो गए हैं ।
ऊतक इंजीनियर श्वासोत्तक grafts (TETGs) संभावित जीवन लंबे immunosuppression के लिए की जरूरत से परहेज करते हुए इन समस्याओं का पता कर सकते हैं. पिछले दशक में, tetgs पशु मॉडल में परीक्षण किया गया है और अनुकंपा के प्रयोग के दुर्लभ उदाहरणों में चिकित्सकीय उपयोग1,2,3। दोनों नैदानिक और बड़े पशुओं के अध्ययन में, ऊतक इंजीनियर airway प्रतिस्थापन से बाद ऑपरेटिव वसूली स्टेनोसिस से निपटने के लिए कई हस्तक्षेपों की आवश्यकता (> 50% luminal संकुचन के रूप में परिभाषित) और एयरवे पैटेंसी बनाए रखने के । अतिरिक्त tetg काम सेल बोने की पसंद, vascularization और पाड़ डिजाइन की भूमिका का मूल्यांकन के माध्यम से इस स्टेनोसिस को कम करने की मांग की है । सेल बोने के विकल्प और पाड़ डिजाइन देशी श्वासनली संरचना बहाल करने के उद्देश्य से/समारोह मुख्य रूप से श्वसन उपकला कोशिकाओं और विभिंन रिसोलुबल, गैर रिसोल्ड और decellularized मचानों पर बोये chondrocytes पर ध्यान केंद्रित किया गया है । के रूप में vascularization संभावना stenosis के विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, अंय समूहों विट्रो या विषमस्थानिक मॉडल में अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया है revascularization या neoangiogenesis4में तेजी लाने के लिए । बहरहाल, सफल vascularization हासिल करते हुए भी एक यंत्रवत् सक्षम और कार्यात्मक TETG बनाए रखने के एक चुनौती बनी हुई है । हाल ही में अग्रिम के बावजूद, कम करने का रोग नैदानिक अनुवाद करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है ।
Vivo मेंtetg आरोपण करने के लिए इस histopathological प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए, हम ऊतक के एक ovine मॉडल इंजीनियर वातक प्रतिस्थापन विकसित की है । भ्रष्टाचार मिश्रित पॉलीथीन टेरेफ्थैलेट (पीईटी) और पॉलीयूरिथेन (पु) इलेक्ट्रोस्पन पाड़ से अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मोनोन्यूक्लियर सेल (बीएम-एमएनसी) से बना था । इस छोटे से सहगण में हमने यह दर्शाया है कि वरीयता प्राप्त ऑटोलॉजिस्ट बी एम एम-बहुराष्ट्रीय कंपनियों ने पुनः उपकला और विलंबित स्टेनोसिसमें तेजी लाई । हालांकि ऑटोलॉजिस्ट BM-MNCs के साथ सीडिंग अस्तित्व में सुधार, सेलुलर तंत्र जिसके द्वारा BM-MNCs कार्यात्मक neotissue के गठन को मिलाना अस्पष्ट बनी हुई है ।
सेलुलर स्तर पर जांच ऊतक इंजीनियर वातक प्रतिस्थापन के एक म्यूरिन मॉडल के विकास की आवश्यकता है । Ovine अध्ययन के लिए इसी प्रकार, हम एक पालतू पशु का उपयोग: पु electrospun पाड़ BM-mncs के साथ वरीयता प्राप्त ovine मॉडल के साथ संगत, tetg स्टेनोसिस पहले दो सप्ताह के दौरान आरोपण के बाद विकसित1,2,3 ,5. यह सुझाव दिया है कि म्यूरिन मॉडल पहले देखा विकृति को पुनः पूंजीकरण, हमें सक्षम करने के लिए आगे सेलुलर airway स्टेनोसिस अंतर्निहित तंत्र पूछताछ ।
इस रिपोर्ट में, हम विस्तार पाड़ विनिर्माण, बीएम-mnc अलगाव, भ्रष्टाचार बोने, और आरोपण (चित्रा 1, चित्रा 2) सहित माउस मॉडल में ऊतक इंजीनियर वातक प्रतिस्थापन के लिए हमारे प्रोटोकॉल ।
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Protocol
यहां वर्णित सभी विधियों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में अनुमोदित किया गया है ।
1. पाड़ विनिर्माण
- द्वारा एक बहुलक नैनोफाइबर अग्रदूत समाधान तैयार: 1) 1, 1, 1, 3, 3, 3 में 8 wt% पीईटी भंग और ६० डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान हीटिंग और 2 द्वारा) 1, 1, 1, 3, 3, 3 में 3 wt% पु भंग-कमरे के तापमान पर हेक्साफ्ल्यूरोआइसोप्रोपनोल ।
- एक बार ठंडा, के लिए पालतू और पु (20:80) के एक अंतिम बहुलक मिश्रण बनाने के समाधान गठबंधन ।
- एक स्टेनलेस स्टील रॉड (1 मिमी व्यास) पर एक 20G कुंद टिप सुई का उपयोग एक ६० मिलीलीटर पालतू जानवर से भरा सिरिंज पर एक इलेक्ट्रोस्पिन पीईटी + पु समाधान: पु एक उच्च वोल्टेज डीसी बिजली की आपूर्ति का उपयोग कर + 14 केवी सुई पर सेट, एक और उच्च वोल्टेज डीसी बिजली की आपूर्ति करने के लिए सेट-3 केवी , एक 5 मिलीलीटर/ज प्रवाह की दर, और एक 20 सेमी टिप-करने के लिए सब्सट्रेट दूरी । फाइबर जमाव के दौरान ३५० rpm पर रॉड घुमाएं ।
- ३०० μm की वांछित पाड़ दीवार मोटाई प्राप्त है जब तक electrospinning जारी रखें । रॉड से पाड़ स्लाइड, तो यह वैक्यूम के तहत पकड़ रातोंरात किसी भी अवशिष्ट विलायक को दूर करने के लिए ।
- ३५० mJ के एक पराबैंगनी प्रकाश खुराक का उपयोग कर पाड़ /
2. अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मोनोन्यूक्लियर सेल (बीएम-एमएनसी) संचयन
- एक 6-8 सप्ताह पुरानी, महिला, C57BL/6 चूहा ketamine का कॉकटेल के साथ (२०० मिलीग्राम/किग्रा), xylazine (20 मिलीग्राम/किग्रा) और ketoprofen (10 मिलीग्राम/किग्रा) । पूंछ चुटकी विधि द्वारा पूरी इच्छामृत्यु के लिए जांच करें । इच्छामृत्यु के लिए स्थानीय दिशा निर्देशों का पालन सुनिश्चित करें ।
- बाँझ शर्तों के तहत, महीन कैंची और माइक्रो-Adson forceps का उपयोग कर हड्डी को बेनकाब करने के लिए femurs और tibias पर त्वचा को हटा दें । उपयोग dumont #5 संदंश और dumont #5/४५ संदंश को दूर करने के लिए प्रावरणी और tendons । हड्डियों को अलग करें और दोनों सिरों पर उनमें से प्रत्येक को काट लें । एक 5 मिलीलीटर सिरिंज और एक 25G सुई का उपयोग कर, एक पेट्री डिश में अस्थि मज्जा फ्लश Rosewell पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) मीडिया के 30 मिलीलीटर युक्त । एक ७० μm नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में अस्थि मज्जा के साथ इस RPMI फिल्टर ।
- एक Biosafety कैबिनेट में, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में polysurcrose और सोडियम के 5 मिलीलीटर diatrizoate जगह । धीरे से दो परतों के मिश्रण से बचने के लिए ट्यूब की ओर नीचे अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं युक्त RPMI जोड़ें । 24 डिग्री सेल्सियस पर "1 ब्रेक" के साथ 30 मिनट के लिए ४६१ x g पर सेंट्रीफ्यूज ।
नोट: हमारे सेंट्रीफ्यूज पर, ब्रेक 1 मंदी के दौरान सबसे लंबे समय तक रन आउट के लिए खड़ा है । - तीन परतों का गठन से बाहर, प्लाज्मा के शीर्ष (गुलाबी) परत त्यागें और मध्य (स्पष्ट) अस्थि मज्जा mononuclear कोशिकाओं से मिलकर परत इकट्ठा । लाल रक्त कोशिकाओं की हाला छोड़ें.
- अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर सेल (बीएम-एमएनसी) को फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में 1:1 के अनुपात में और 10 मिनट के लिए ४६१ एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज 24 डिग्री सेल्सियस पर "ब्रेक 9" के साथ पतला करें ।
- Supernatant निकालें और PBS के 5 मिलीलीटर के साथ गोली पतला । 24 डिग्री सेल्सियस पर "ब्रेक 9" के साथ 10 मिनट के लिए ४६१ x g पर सेंट्रीफ्यूज ।
- Supernatant निकालें और ~ 10 मिलीलीटर RPMI के साथ गोली पतला ।
- एक 1 मिलीलीटर ट्यूब में ०.४% trypan नीले रंग की एक समान मात्रा के साथ बीएम-MNC समाधान के 10 μL पतला । एक सेल गिनती चैंबर स्लाइड में समाधान के 10 μL प्लेस । किसी स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करना. चरण दोहराएं और कक्षों की औसत संख्या परिकलित करें ।
नोट: 1 X 108 कोशिकाओं की एक औसत कोशिका गिनती दो दाता चूहों के उपयोग से प्राप्त किया गया था । यह दो femurs के बराबर होगा, और दो टिबिया कि अस्थि मज्जा से अलग है । - सेंट्रीफ्यूज 24 ° c पर "ब्रेक 9" के साथ 10 मिनट के लिए ४६१ x g पर BM-mnc समाधान । Supernatant निकालें और सेल एकाग्रता को पतला करने के लिए 107 कोशिकाओं/
नोट: हमने 1, 10 और १००,०००,००० कोशिकाओं के बीच सीडिंग दक्षता का अध्ययन किया है और पाया है कि १०,०००,००० कोशिकाओं के प्रति भ्रष्टाचार उच्चतम बोने की क्षमता की पैदावार करता है ।
3. Grafts पर सेल सीडिंग
- पाड़ो की लंबाई को मापने और अगर जरूरत है, उंहें 5 मिमी की लंबाई में कटौती ।
- 5 मिनट के लिए RPMI के 5 μL के साथ पाड़ पूर्व गीला. RPMI निकालें ।
- 10 मिनट के लिए पाड़ के लुमेन करने के लिए बीएम-mnc समाधान के 5 μl जोड़ें ।
- भ्रष्टाचार के लुमेन के माध्यम से एक 21g सुई पास और एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात rpmi के १००० μl में कलम सेते ।
4. भ्रष्टाचार आरोपण
नोट: भ्रष्टाचार आरोपण प्रक्रिया के दौरान असेप्टिक तकनीक बनाए रखने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए ।
- उपयोग 6-8-सप्ताह पुराने महिला C57BL/6 चूहों के रूप में सेल बीज grafts के लिए प्राप्तकर्ताओं । इंजेक्शन enrofloxacin (10 मिलीग्राम/किग्रा) सर्जरी से पहले और चीरा से पहले ठीक 24 एच ।
- माउस को तौलना और केटामाइन (१०० मिलीग्राम/किग्रा), xylazine (10 मिलीग्राम/किग्रा) और ketoprofen (5 मिलीग्राम/किग्रा) के संवेदनाहारी कॉकटेल के एक ०.१ मिलीलीटर/10 ग्राम खुराक के रूप में एनालगेसिया intraperitoneally प्रशासन ।
- जाँच करें कि क्या anस्थेसिया के विमान पूंछ चुटकी विधि द्वारा प्राप्त किया गया है । अवनति के स्तर की पुष्टि पर, आंखों के लिए एक बाँझ ऑप्थैल्मिक मरहम लागू करते हैं और ठुड्डी से clavicles के सर्जिकल साइट पर बाल क्लिप । एक पृष्ठीय लेटा हुआ स्थिति में एक पैड पर पशु प्लेस । सर्जिकल साइट का उपयोग पहले एक povidone-आयोडीन प्रस्तुत करने का पैड, एक शराब तैयारी पैड (७०% शराब) के बाद कीटाणुरहित, और एक बार और एक पोविलोन-आयोडीन तैयारी पैड ।
- जानवर को विदारक सूक्ष्मदर्शी के नीचे अपने सिर के साथ सर्जन से दूर रखें । ठीक कैंची और माइक्रो-adson forceps की मदद से कंठिका हड्डी के लिए clavicles से लेकर एक मिडलाइन चीरा बनाओ । एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ यदि आवश्यक हो तो ड्यूमोंट #5 और ड्यूमोंट #7 ठीक संदंश के साथ प्रावरणी साफ, और एक आत्म बनाए रखने कोलिबरी पुनः ट्रैक्टर डालने ।
- पट्टा मांसपेशियों को खोलें (चित्रा 3ए) ड्यूमोंट #5 और ड्यूमोंट #7 ठीक संदंश के साथ थायराइड उपास्थि, झीना उपास्थि और श्वासनली बेनकाब । किसी भी ओर समानांतर चलने वाले आवर्तक स्वरयंत्र तंत्रिकाओं से श्वासनली अलग, इसके बाद घेघा से श्वासनली का परिधीय पृथक्करण (चित्र 3ब) ।
- एक 20G सुई और शल्य मार्कर का उपयोग कर, श्वासनली के पूर्वकाल भाग दाग ।
- श्वासनली की पहचान और तीसरे श्वासनली उपास्थि अंगूठी के नीचे एक चीरा बनाने के लिए और vannas की एक जोड़ी का उपयोग कर ट्रेकिआ ट्रान्सेक्ट-ट्यूबिंगन स्प्रिंग कैंची और ड्यूमोंट की एक जोड़ी #7 ठीक forceps. यह ठीक घुमावदार forceps के साथ पकड़े हुए, एक अस्थाई tracheostomy (चित्रा 3सी) बनाने के लिए बाँझ 9-0 नायलॉन सीवन का उपयोग कर उरोस्थि के लिए बाहर की श्वासनली सुरक्षित । नोट: एक वैकल्पिक सीवन सामग्री है कि इस्तेमाल किया जा सकता है 9-0 पीडीएस के लिए वातक आरोपण और मांसपेशी reapproximation है ।
- एक 20g सुई और एक शल्य मार्कर के साथ, भ्रष्टाचार दाग को पूर्वकाल भाग का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
- प्रत्यारोपण आसंन-पीछे डालने, समीपवर्ती पार्श्व और समीपवर्ती टांके, उस क्रम में 9-0 बाँझ नायलॉन सीवन (चित्रा 3डी), dumont #7 ठीक संदंश और एक सुई धारक का उपयोग कर ।
- पशु १८० ° बारी करने के लिए अपनी पूंछ सर्जन से दूर जगह है । अस्थायी tracheostomy जारी. अपकर्षण के लिए एक स्टंप के रूप में रिसेक्टेड सेगमेंट के इस्तेमाल की अनुमति देने के लिए डिस्टल ट्रेकिआ को पूरी तरह से ट्रांससेक्टेड किया जाता है । जब अब जरूरत नहीं है, 5 मिमी श्वासनली खंड पूरी तरह से हटा दिया जाता है ।
- समीपस्तल एनास्टोमोसिस के रूप में समान फैशन में टांके रखकर बाहर का एनास्टोमोसिस पूरा करें ।
- फिर से लगभग भ्रष्टाचार स्थिति और पट्टा मांसपेशियों । एक चल रहे पैटर्न में 9-0 बाँझ नायलॉन टांके का उपयोग कर चीरा बंद करो ।
- (०.१ मिलीग्राम/किग्रा) buprenorphine के ०.१ मिलीलीटर इंजेक्शन और एक वसूली पिंजरे में अंय जानवरों के बिना एक हीटिंग पैड पर रखा पिंजरे में पशु प्लेस ।
- माउस का पालन करें जब तक यह सचेत और एंबुलेट करने में सक्षम है, तो नरम बिस्तर, नम चाउ और औषधीय पानी (ibuprofen, 30 मिलीग्राम के साथ एक नए पिंजरे के लिए माउस स्थानांतरण/४८ एच के लिए/ इस समय अवधि के बाद, माउस अंय चूहों के साथ एक सामांय पिंजरे में लौटें ।
नोट: आरोपण के बाद श्वसन संकट या घटी हुई गतिविधि को बनाए रखने वाले चूहों को प्रयोगशाला और/या पशु कर्मचारियों द्वारा ३२ डिग्री सेल्सियस इनयूबेटर में देखा जाता है । यदि यह ४८ से अधिक एच के लिए जारी है, तो चूहों euthanized किया जाना चाहिए ।
5. ऊतक विज्ञान और Immunohistochemistry
नोट: Hematoxylin और eosin दाग राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल Morphology कोर द्वारा मानक तकनीक का उपयोग किया गया । Immunohistochemistry नीचे दिए गए चरणों के अनुसार किया गया था ।
- 5 मिनट के लिए 1) xylene का उपयोग कर स्लाइडें, 2) xylene के लिए 5 मिनट, 3) १००% इथेनॉल 5 मिनट, 4 के लिए) ९०% इथेनॉल 5 मिनट के लिए, 5) ७०% 5 मिनट के लिए इथेनॉल, 6) डिस्टिल्ड एच2ओ (डीएच2ओ) 5 मिनट के लिए ।
- सिट्रेट बफर में स्लाइड् स को जलमग्न करें और पानी से भरे प्रेशर कुकर में रखें । 10 मिनट के लिए गर्मी तो कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं । पीबीएस (BSA-PBS) में ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ 5 मिनट के लिए धो लें । dH2O के साथ कुल्ला ।
नोट: हीटिंग भी एक गर्म पानी स्नान या 15 मिनट के लिए माइक्रोवेव के साथ किया जा सकता है । - कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए पीबीएस में 3% सामान्य बकरी सीरम के साथ स्लाइड इनसेट करे । 5 मिनट के लिए ०.१% BSA-PBS के साथ धो लें । प्राथमिक एंटीबॉडी में क्रस्टिन 5 (1:1000)6, केरातिन 14 (1:250)6 और F4/80 (1:100)7 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए सांद्रता के साथ इनसेबेट ।
- ०.१% BSA-PBS के साथ दो बार 10 मिनट प्रत्येक धोने के लिए धो लें । K5/K14 और 1:300 F4/80 के लिए कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 1:500 की सांद्रता पर उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ सेटे । ०.१% BSA-PBS के साथ दो बार 10 मिनट प्रत्येक धोने के लिए धो लें ।
- माउंट 4 ', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) बढ़ते मीडिया और ग्लास कवर स्लिप युक्त का उपयोग कर । इमेजिंग से पहले 30 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें ।
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Representative Results
चित्रा 1 tetg बोने और आरोपण के एक योजनाबद्ध दिखाता है । अस्थि मज्जा C57BL/6 चूहों और विट्रो मेंसुसंस्कृत से काटा गया था । BM-बहुराष्ट्रीय कंपनियां घनत्व अपकेंद्रण द्वारा अलग-थलग थीं और TETG पर वरीयता प्राप्त थीं । वरीयता प्राप्त TETGs एक syngeneic C57BL/6 प्राप्तकर्ता माउस में प्रत्यारोपित किए गए ।
चित्रा 2 पालतू पशु का अवलोकन: पु tetg पाड़ विनिर्माण प्रक्रिया है । पीईटी: पु समाधान एक 20g मुंहफट सुई पर electrospun था क्रम में ३०० μm और लुमेन व्यास के एक अंतिम tetg दीवार मोटाई को प्राप्त करने के लिए लगभग देशी माउस श्वासनली । TETG की सतह एनिमेटेड mononuclear कोशिकाओं के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवि में देखा जा सकता है ।
शल्य प्रत्यारोपण प्रक्रिया सबसे महत्वपूर्ण दिखाया कदम के साथ चित्रा 3 में उल्लिखित है । चित्रा 3 पट्टा मांसपेशियों के जुदाई और वापसी (चित्रा 3ए) और आसपास के ऊतकों से श्वासनली के बाद परिधीय अलगाव से पता चलता है (चित्रा 3बी). चित्रा 3 सी प्रक्रिया के दौरान पेटेंट एयरवे सुनिश्चित करने के लिए स्टर्नल पायदान करने के लिए लगाव के साथ बाहर अस्थाई tracheostomy दर्शाता है । अंत में, चित्रा 3डी अंतिम anastomoses के बाद जगह में भ्रष्टाचार से पता चलता है ।
एक छोटे से पलटन अध्ययन में, चार चूहों tetgs के साथ प्रत्यारोपित किए गए और एक दो सप्ताह की अवधि से अधिक पीछा किया । कुछ बेसल उपकला कोशिकाओं बेसल सेल केरातिन 5 और 14 चित्र 4ए-सीमें दिखाया धुंधला में सराहना की जा सकती है । संयुक्त छवि (चित्रा 4सी) प्रत्यारोपण के बाद 7 दिनों में भ्रष्टाचार के luminal सतह पर बेसल कोशिकाओं की उपस्थिति से पता चलता है ।
चार में से तीन जानवरों में श्वसन संकट और स्ट्राइडर के लक्षण दिखाई दिए, जिनमें से दो को ऑपरेटिव दिन 1 और 7 पर शुरुआती समाप्ति की आवश्यकता थी । एक्सप्लांटेशन और ऊतकीय विश्लेषण पर, भ्रष्टाचार स्टेनोसिस जटिलताओं के लिए मुख्य योगदान कारक के रूप में पहचान की थी । चित्रा 5 ए -ई के बाद ऑपरेटिव दिन 7 पशु tetg के स्टेनोटिक क्षेत्र का एक दृश्य देता है । नोट की, भ्रष्टाचार और देशी श्वासनली के telescoping एक आम खोज शल्य चिकित्सा तकनीक के कारण है । कम (चित्रा5 ए) और उच्च (चित्रा 5ख) स्टेनोसिस के photomicrograph संचालित tetg आरोपण के मुख्य जटिलताओं में से एक दर्शाता है । चित्रा 5 सी एक प्रतिनिधि F4/80 सस्टेटिक क्षेत्र में मेजबान मैक्रोफेज की उपस्थिति का खुलासा दाग है । चित्रा 5 डी और चित्रा 5ई फिर से graft के स्टेनोटिक क्षेत्र में बेसल उपकला सेल मार्करों केरातिन 5 और 14 दिखाओ ।
चित्रा 1 : Tetg सीडिंग और आरोपण योजनाबद्ध । अस्थि मज्जा-प्राप्त mononuclear एक दाता माउस से प्राप्त कोशिकाओं घनत्व केंद्रापसारक द्वारा अलग थे, एक पाड़ पर बीज, और एक प्राप्तकर्ता माउस में प्रत्यारोपित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : ऊतक का इलेक्ट्रोस्पिनिंग इंजीनियर वातक भ्रष्टाचार। (क) इलेक्ट्रोस्पिनिंग प्रक्रिया का अवलोकन । (ख) चूहे के मचानों का निर्माण करने के लिए घूर्णन करने वाले मैनड्रेल के रूप में प्रयुक्त 20g कुंद सुई । (ग) मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के बाद पाड़ सतह के एनिमेटेड SEM योजनाबद्ध जोड़े गए हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : पाड़ के सर्जिकल आरोपण का सिंहावलोकन। (क) पट्टा पेशियों का पृथक्करण और प्रतिकर्षण । (ख) आसपास के ऊतकों/अंगों से श्वासनली का परिधीय पृथक्करण । (ग) अधरीय पायदान के लिए अस्थायी tracheostomy और लगाव का निर्माण । (घ) समीपस् थ और डिस् टल एनास्टोमोसेस के बाद प्रत्यारोपित करना । स्केल बार = 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 : बेसल उपकला कोशिकाओं के Histological सबूत। विलयित प्रतिदीप् तिदीप्ति छवि बेसल सेल मार्करों की केरातिन 5 (A) और केरातिन 14 (B) और मर्ज किए गए केरातिन 5 और केरातिन 14 (C). तीर पाड़-देशी ऊतक जंक्शन पर उपकला ऊतक विकास को दर्शाता है । लुमेन और पाड़ क्रमशः (*) और (
) के साथ चिह्नित कर रहे हैं । स्केल बार = ५० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 : भ्रष्टाचार के स्टेनोटिक क्षेत्र के Histological दृश्य। (क) अनुदैर्घ्य, एनास्टोमोसिस के निकट स्थित डिस्टेन्सिस के साथ ग्राफ्ट सहित श्वासनली की लंबाई के साथ-साथ सेकेन्ड एच & ई । स्केल बार = ५०० μm. H & E (B), F4/80 (C), केरातिन 5 (D), और केरातिन 14 (E) का उपयोग करके चयनित स्टेनोटिक क्षेत्र की उच्च शक्ति छवियां । स्केल पट्टियां = ५० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
ऊतक इंजीनियर tracheas के लिए एक माउस मॉडल का विकास TETGs के नैदानिक अनुवाद सीमित है कारकों को समझने में आवश्यक है; अर्थात भ्रष्टाचार पतन, स्टेनोसिस और विलंबित उपकला4. कुछ कारकों है कि इन सीमाओं के लिए योगदान भ्रष्टाचार सामग्री का चयन शामिल हैं, विनिर्माण प्रक्रिया, पाड़ डिजाइन और सेल बोने प्रोटोकॉल । यह मॉडल इन कारकों के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है ताकि उंहें प्रभावित सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने के लिए ।
हम यहां उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति (चित्रा 4) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भ्रष्टाचार स्टेनोसिस पुनर्पूंजीकरण के लिए मॉडल की क्षमता दिखाया गया है (चित्रा 5); हालांकि, मॉडल का सफल उपयोग आरोपण प्रक्रिया के दौरान कुछ महत्वपूर्ण कदम पर निर्भर करता है । सबसे पहले, प्रारंभिक चीरा और माउस श्वासनली के अलगाव के दौरान, यह चोट से बचने या आसन्न आवर्तक स्वरयंत्रीय नसों tracheoesophageal नाली में स्थित की खींच करने के लिए आवश्यक है । देशी श्वासनली की लकीर के दौरान एक अंय महत्वपूर्ण कारक के लिए श्वासनली के पीछे बैठे घेघा को किसी भी क्षति से बचने के लिए है ।
अंतःश्वासोतक अंत: स्रावी प्रक्रिया के दौरान वायुप्रवाह की अनुमति देने के लिए एक अस्थायी tracheostomy बनाने से बचा जा सकता है । यह महत्वपूर्ण है, तथापि, कुछ भी रखने के लिए (यानी, ऊतक) अस्थायी डिस्टल tracheostomy अवरुद्ध करने के साथ ही शरीर गुहा के बाहर श्वासनली बनाए रखने के लिए श्वसन की सुविधा । भ्रष्टाचार telescoping भ्रष्टाचार के प्रत्यारोपण में एक आम घटना है और ऊतकीय वर्गों पर देखा जा सकता है ।
अंय पशु मॉडल है कि tetgs का अध्ययन में उपयोग किया गया है ंयूजीलैंड सफेद खरगोश, कुत्तों, चूहों, सूअर, और भेड़8,9,10,11शामिल हैं; जिनमें से कई लागत निषेधात्मक हो सकता है और व्यापक मात्रा के तरीकों की कमी (यानी, एलिसा, Immunohistochemistry एंटीबॉडी, पीसीआर primers, आदि) और/ इस प्रकार, बड़े जानवर इस्तेमाल किया मॉडल अक्सर underpowered है या यंत्रवादी सवालों के जवाब देने में असमर्थ हैं । इस मॉडल में ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने के साथ-साथ सीधी कलम की डिजाइन और विनिर्माण प्रक्रिया को तेजी से यंत्रवत अध्ययनों के लिए आदर्श बनाती है, जो कि भ्रष्टाचार के स्टेनोसिस और पुनः उपकला को देखती है । इस TETG मॉडल में इस्तेमाल किया orthotopic ट्रांसप्लांटेशन बाहरी वातावरण और संभावित उपकला कोशिका भेदभाव को मापने की क्षमता को उजागर किया जा रहा भ्रष्टाचार के लाभ प्रदान करता है । हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि ट्रांसजेनिक अध्ययन के बड़े पशु मॉडल और नैदानिक परीक्षणों के लिए अनुवाद मुश्किल हो सकता है । इसके अलावा, जबकि इस माउस मॉडल संभवतः अधिक जनसंख्या का आकार बढ़ाने में प्रभावी लागत हो सकता है, यह वर्तमान में एक ही नैदानिक नैदानिक और चिकित्सकीय क्षमताओं के रूप में बड़ा पशु मॉडल में नहीं है (यानी, इंडोस्कोपिक के साथ ब्रोंकोस्कोपी हस्तक्षेप) यह चुनौतीपूर्ण परिणामों के बीच तुलना करने के लिए बना ।
इस मॉडल के साथ भविष्य के काम इष्टतम सेल बोने की स्थिति की जांच पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा (सेल प्रकार, घनत्व, आदि) और भ्रष्टाचार के रोग को सीमित करने और उपकला में सुधार करने में अपनी भूमिका । पाड़ डिजाइन भी एक महत्वपूर्ण चर है कि vivo में भ्रष्टाचार प्रदर्शन पर महत्वपूर्ण प्रभाव है और इष्टतम पाड़ सामग्री और microstructure के रूप में और अधिक जांच की आवश्यकता होगी । इन अध्ययनों TETGs के बड़े पशु मॉडल और अंततः मानव नैदानिक परीक्षणों के अनुवाद में सहायता करेगा ।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।
Acknowledgments
हम रॉबर्ट Strouse और अनुसंधान सूचना समाधान & राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में नवाचार प्रभाग ग्राफिक डिजाइन में उनके समर्थन के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । यह काम एनआईएच (NHLBI K08HL138460) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
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