Summary
Pode stenose utgjør en viktig hindring i vev utvikling airway erstatning. For å undersøke mobilnettet mekanismene bak stenose, benytter vi en murine modell av vev utvikling tracheal erstatning med seeded benmarg mononukleære celler (BM-MNC). Her, detalj vi våre protokollen, inkludert stillaset produksjon, BM-MNC isolasjon, pode såing og implantasjon.
Abstract
Behandlingsalternativer for medfødt eller sekundær lang segmentet tracheal mangler har historisk vært begrenset på grunn av en manglende evne til å erstatte funksjonelle vev. Tissue engineering har store løftet som en potensiell løsning med sin evne til å integrere celler og signalnettverk molekyler i en 3-dimensjonal stillaset. Nye studier av vev utvikling tracheal grafts (TETGs) har sett noen suksess, men deres oversettelse har vært begrenset av pode stenose, pode sammenbruddet og forsinket epithelialization. For å undersøke mekanismer kjører disse spørsmålene, har vi utviklet en musemodell for vev utvikling tracheal pode implantasjon. TETGs ble bygget med electrospun polymerer polyetylentereftalat (PET) og polyuretan (PU) i en blanding av PET og PU (20:80 prosent vekt). Stillaser var så frø bruke benmarg mononukleære celler isolert fra 6-8-uke-gamle C57BL/6 mus med gradient sentrifugering. Ti millioner celler per pode var sådd på lumen av stillaset og lov til å ruge over natten før implantasjon mellom tredje og sjuende tracheal ringene. Disse grafts kunne recapitulate resultatene av stenose og forsinket epithelialization som demonstrert av histologiske analyse og mangel på Keratin 5 og Keratin 14 basale epitelceller på immunofluorescence. Denne modellen vil fungere som et verktøy for å undersøke mobilnettet og molekylære mekanismer involvert i vert remodeling.
Introduction
Lang-segmentet tracheal defekter kan presentere som sjelden medfødt forhold som fullstendig tracheal ringer og tracheal agenesis, samt traumer, kreft og infeksjoner. Når overstiger 6 cm voksne eller 30% av den tracheal lengden i barn, kan ikke disse feilene behandles med kirurgisk gjenoppbygging. Forsøk på å erstatte luftveiene med autologous vev, cadaveric transplantasjoner og kunstig konstruksjoner har vært plaget av kronisk infeksjon, korning, mekanisk svikt og stenose.
Vev utvikling tracheal grafts (TETGs) kan potensielt løse problemene samtidig unngå behovet for livslang immunsuppresjon. I det siste tiåret, har TETGs blitt testet i dyremodeller og utnyttet klinisk i sjeldne tilfeller medfølende Bruk1,2,3. I både kliniske og store dyrestudier, postoperativ utvinning fra vev utvikling airway erstatning kreves mange tiltak for å bekjempe stenose (definert som > 50% luminal innsnevring) og vedlikeholde airway patency. Ekstra TETG arbeid har søkt å redusere denne stenose gjennom vurdere rollen celle seeding valg, endometrial blodkar og stillaset design. Cellen seeding valg og stillaset design sikte på å gjenopprette opprinnelige luftrøret struktur/funksjon har hovedsakelig vært fokusert på luftveiene epitelceller og chondrocytes seeded på ulike resorbable, ikke-resorbable og decellularized stillaser. Som endometrial blodkar sannsynligvis spiller en viktig rolle i utviklingen av stenose, har andre grupper fokusert på optimalisering i vitro eller heterotopic modeller å fremskynde revaskularisering eller neoangiogenesis4. Likevel, å oppnå vellykket endometrial blodkar samtidig opprettholde en mekanisk kompetente og funksjonelle TETG er fortsatt en utfordring. Til tross for nylige fremskritt forblir minimere stenose en kritisk utfordring for klinisk oversettelse.
For å undersøke dette histopathological svaret til TETG implantasjon i vivo, utviklet vi en ovine modell av vev utvikling tracheal erstatning. Graftet ble komponert av en blandet polyetylentereftalat (PET) og polyuretan (PU) electrospun stillaset plantet med Ben margtransplantasjon-avledet mononukleære celler (BM-MNCs). I denne liten kohort viste vi at seeded autologous BM-MNCs akselerert re epithelialization og forsinket stenose5. Selv om seeding autologous BM-MNCs bedre overlevelse, fortsatt mobilnettet mekanismen som BM-MNCs modulerer dannelsen av funksjonelle neotissue uklart.
Undersøkelse på mobilnettet nivå kreves utviklingen av murine modell av vev konstruert tracheal erstatning. Lik ovine studien, benyttet vi en PET:PU electrospun stillaset plantet med BM-MNCs. konsekvent med ovine modellen, som TETG stenose utviklet i løpet av de første to ukene etter implantasjon1,2,3 ,5. Dette foreslo at murine modellen recapitulated patologi observert tidligere, slik at vi kan ytterligere forhøre mobilnettet mekanismene bak airway stenose.
I denne rapporten detalj vi våre protokollen for vev utvikling tracheal erstatning i musemodell inkludert stillaset produksjon, BM-MNC isolasjon, pode såing og implantasjon (figur 1, figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) på landsomfattende Children's Hospital.
1. stillaset produksjon
- Forberede en polymer nanofiber forløper løsning av: 1) oppløsning 8 wt % PET i 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol og varme løsningen til 60 ° C og ved 2) oppløsning 3 wt % PU i 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol ved romtemperatur.
- Når avkjølt, kombinere løsningene for å lage en siste polymer blanding av PET og PU (20:80).
- Electrospin PET+ PU løsningen på en rustfritt stål stang (1 mm diameter) bruker en 20 G butt tupp nål på 60 mL sprøyte fylt med PET:PU løsningen med en høy spenning DC makt levere å +14 kV på pinne, en annen høyspent DC strøm forsyne sett til-3 kV , en 5 mL/t flow rate og 20 cm tips til underlaget avstand. Dreie stangen på 350 rpm under fiber deponering.
- Fortsett electrospinning til ønsket stillaset veggtykkelse på 300 µm er oppnådd. Skyv stillaset av stangen, og holde den under vakuum over natten å fjerne eventuelle gjenværende løsemiddel.
- Sterilisere stillaset ved hjelp av en ultrafiolett lys dosering av 350 mJ/cm2 før implantasjon.
2. Ben margtransplantasjon-avledet mononukleære cellen (BM-MNC) høsting
- Euthanize en 6-8 uker gammel, kvinne, C57BL/6 musen med en cocktail av ketamin (200 mg/kg), xylazine (20 mg/kg) og ketoprofen (10 mg/kg). Se etter fullført euthanasia ved halen-klype metoden. Husk å følge lokale retningslinjer for euthanasia.
- Under sterile forhold, fjerne huden over femurs og tibias å avsløre bein med fine saks og mikro-Adson tang. Bruk Dumont #5 tang og Dumont #5/45 pinsett fjerne fascia og sener. Separate beina og kutt hver av dem på begge ender. Bruker 5 mL sprøyter og en 25G nål, tømme benmargen i en Petriskål inneholder 30 mL av Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) media. Filtrere dette RPMI med benmarg gjennom en 70 µm nylon celle sil i en 50 mL tube.
- I en Biosafety skap, plasserer du 5 mL av polysurcrose og natrium diatrizoate i en 15 mL tube. Forsiktig legge RPMI som inneholder benmarg mononukleære celler på siden av røret for å unngå blanding av de to lagene. Sentrifuger, 461 x g i 30 min med "brems 1» på 24 ° C.
Merk: På våre sentrifuge, brems 1 står for den lengste kjører tid under retardasjon. - Av de tre lagene dannet, forkaste det øverste (rosa) laget av plasma og samle midten (klar) laget bestående av benmarg mononukleære celler. Kast utløse av røde blodlegemer.
- Fortynne de benmarg mononukleære cellene (BM-MNC) i fosfat bufret saltvann (PBS) i en 1:1 ratio og sentrifuge, 461 x g for 10 min med "brems 9" på 24 ° C.
- Fjern nedbryting og fortynne pellets med 5 mL PBS. Sentrifuger, 461 x g i 10 min med "brems 9" på 24 ° C.
- Fjern nedbryting og fortynne pellets med ~ 10 mL RPMI.
- Fortynne 10 µL av BM-MNC løsningen med en lik mengde 0,4% trypan blå i en 1 mL tube. Sted 10 µL av løsningen i en celle teller kammer lysbildet. Telle celler ved hjelp av en automatisert celle teller. Gjenta trinnet og beregne gjennomsnittlig antall celler.
Merk: En gjennomsnittlig celletall 1 X 108 celler ble oppnådd ved bruk av to donor mus. Dette vil være tilsvarende to femurs og to tibias som bein margtransplantasjon er isolert fra. - Sentrifuge BM-MNC løsningen 461 x g i 10 min med "Håndbrekket 9" på 24 ° C. Fjern nedbryting og fortynne celle konsentrasjonen til 107 celler fjerner.
Merk: Vi har studert seeding effektivitet mellom 1, 10 og 100 millioner celler og fant at 10 millioner celler per pode gir høyeste seeding effektiviteten.
3. celle Seeding på graftene
- Måle lengden på stillasene og eventuelt klippe dem til en lengde på 5 mm.
- Pre våt stillaset med 5 µL av RPMI for 5 min. fjerne RPMI.
- Legge til 5 µL av BM-MNC løsningen lumen av stillaset i 10 min.
- Passerer en 21G nål gjennom lumen av graftet og ruge graftet i 1000 µL av RPMI overnatting på 37 ° C i en inkubator.
4. graft implantasjon
Merk: Forsiktighet bør utvises å opprettholde steril teknikk under pode implantasjon prosedyren.
- Bruk 6-8-uke-gamle kvinnelige C57BL/6 mus som mottakere for cellen seeded graftene. Sette inn enrofloxacin (10mg/kg) subcutaneously 24 timer før operasjonen og like før snitt.
- Veie musen og administrere en 0,1 mL/10 g dose bedøvende cocktail av ketamin (100 mg/kg), xylazine (10 mg/kg) og ketoprofen (5 mg/kg) som analgesi intraperitoneally.
- Sjekk Hvis flyet av anestesi er oppnådd ved halen-klype metoden. Bekrefter nivået av sedasjon, en steril ophthalmica salve gjelder øynene og klippet håret på kirurgiske området fra haken til clavicles. Plassere dyret på en pute i dorsal tilbakelent posisjon. Desinfiser kirurgiske området bruker først en povidon-jod prep pad, etterfulgt av en prep spritpute (70% alkohol), og igjen en povidon-jod prep pute.
- Plassere dyret under dissecting mikroskop med hodet fra kirurgen. Gjøre en midtlinjen snitt mellom clavicles hyoid bein med hjelp av fine saks og mikro-Adson tang. Rengjør fascia Dumont #5 og Dumont #7 fine tang, sammen med en steril bomull swab hvis nødvendig, og sett inn en selv beholde Colibri festepunkt.
- Åpne stroppen musklene (Figur 3A) med Dumont #5 og Dumont #7 fine tang å avsløre thyroid brusk, cartilago cricoidea og luftrøret. Rett ut separate luftrøret fra tilbakevendende recurrens nervene kjører parallelt på hver side, etterfulgt av omkrets separasjon av trachea fra spiserøret (Figur 3B).
- Bruker 20G nål og kirurgisk markør, beis den fremre delen av trachea.
- Identifisere luftrøret og gjøre et snitt under tredje tracheal brusk ringen og mudderbunn luftrøret bruker et par Vannas-Tubingen våren saks og et par Dumont #7 fine tang. Holder det med fin buet tang, sikre distale luftrøret til sternum bruker sterilt 9-0 nylon Sutur for å opprette en midlertidig tracheostomi (Figur 3C). Merk: Et alternativ Sutur materiale som kan brukes er 9-0 PDS for tracheal implantasjon og muskel reapproximation.
- Med en 20G nål og en kirurgisk markør, beis graftet representerer den fremre delen.
- Implantatet graftet setter den proksimale-bakre, proksimale-lateral og proksimale-fremre bildet, i den rekkefølgen bruker 9-0 sterilt nylon Sutur (Figur 3D), Dumont #7 fine tang og en nål holder.
- Slå av dyr 180° for å plassere halen fra kirurgen. Slipp den midlertidige tracheostomi. Distale luftrøret er ufullstendig transected for å tillate bruk av resected segmentet som en stubbe for tilbakekalling. Når ikke lenger nødvendig, fjernet 5 MM luftrøret segmentet helt.
- Fullfør distalanastomoser ved å plassere bildet på samme måte som den proksimale anastomose.
- Nytt tilnærmet pode plasseringen og stroppen musklene. Stenge incision bruke 9-0 sterilt nylon sømmer i en kjører mønster.
- Injisere 0,1 mL av buprenorfin (0,1 mg/kg) subcutaneously og plassere dyret i utvinning bur plassert på en varmeputen uten andre dyr i buret.
- Observere musen til den er bevisst og kunne ambulate, deretter overføre musen til et nytt bur med mykt sengetøy, fuktig chow og medisinert vann (ibuprofen, 30 mg/kg) for 48 timer. Etter denne perioden, tilbake musen til et vanlig bur med andre mus.
Merk: Mus som opprettholde luftveissykdom eller redusert aktivitet etter implantasjon er observert av laboratorium og/eller dyr ansatte i en 32 ° C inkubator. Hvis dette fortsetter for mer enn 48 timer, burde deretter mus være euthanized.
5. histologi og Immunohistochemistry
Merk: Hematoxylin og eosin flekker ble utført ved hjelp av standard teknikk av landsomfattende barns sykehus morfologi kjernen. Immunohistochemistry ble utført i henhold til det neden skritt.
- Deparaffinize lysbilder med 1) xylen for 5 min, 2) xylen i 5 minutter, 3) 100% etanol for 5 min, 4) 90% etanol i 5 min, 5) 70% etanol i 5 min, 6) destillert H2O (dH2O) for 5 min.
- Senk lysbildene i citrate buffer og plasser i vannfylte trykkoker. Varme i 10 min la avkjøles til romtemperatur. Vask med 0,1% bovin serum albumin i PBS (BSA-PBS) for 5 min. skyll med dH2O.
Merk: Oppvarming kan også gjøres med varmt vannbad eller mikrobølgeovn i 15 min. - Inkuber lysbildene med 3% normal geit serum i PBS 1t ved romtemperatur. Vask med 0,1% BSA-PBS for 5 min. ruge i primære antistoff med konsentrasjoner for keratin 5 (1:1000)6, keratin 14 (1:250)6 og F4/80 (1: 100)7 18 h overnatting på 4 ° C.
- Vask med 0,1% BSA-PBS to ganger for 10 min hver vask. Inkuber med passende sekundære antistoff på konsentrasjonen av 1:500 for K5/K14 og 1:300 F4/80 1t ved romtemperatur. Vask med 0,1% BSA-PBS to ganger for 10 min hver vask.
- Montere med 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) som inneholder montering media og glass cover slips. La sitte i 30 min før bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer en skjematisk av TETG frø og implantasjon. Benmarg ble høstet fra C57BL/6 mus og kultivert i vitro. BM-MNCs var isolert av tetthet sentrifugering og sådd på TETG. Seeded TETGs ble implantert i en syngeneic C57BL/6 mottaker mus.
Figur 2 er en oversikt over PET:PU TETG stillaset produksjonsprosess. Pet:PU løsningen var electrospun på en 20 G sløv nål for å få siste TETG veggtykkelse på 300 µm og lumen diameter på 1 mm omtrent innfødt musen luftrøret. Overflaten av TETG kan sees i scanning elektron mikroskop bildet med animerte mononukleære celler.
Kirurgisk implantasjon prosedyren er skissert i Figur 3 med de viktigste trinnene vises. Figur 3 viser separasjon og retraksjon av stroppen muskler (Figur 3A) og påfølgende omkrets isolasjon av trachea fra omkringliggende vev (Figur 3B). Figur 3 C viser den distale midlertidige tracheostomi med tilknytning til sternal hakket å sikre patent luftveier under prosedyren. Til slutt, viser Figur 3D graftet på plass etter siste forekomst.
I en liten kohort studie, var fire mus implantert med TETGs og fulgte over en to-ukers periode. Noen basale epitelceller kan bli verdsatt i basal celle keratin 5 og 14 flekker vist i Figur 4Vekselstrøm. Kombinerte bildet (Figur 4C) viser tilstedeværelse av basal celler på luminal overflaten av graftet på 7 dager etter implantasjon.
Tre av fire dyrene viste tegn til luftveissykdom og stridor, hvorav to kreves tidlig avslutning på postoperativ dager 1 og 7. Explantation og histologiske analyse, ble pode stenose identifisert som den viktigste medvirkende faktoren til komplikasjoner. Figur 5 AE gir utsikt over postoperativ dag 7 dyrets stenotic regionen i TETG. Av notatet er telescoping pode og innfødt luftrøret en vanlig funn på grunn av kirurgisk teknikk. Lav (figur 5et) og høy (figur 5B) drevet photomicrograph av stenose demonstrerer en av de viktigste komplikasjonene av TETG implantasjon. Figur 5 C er en representant F4/80 flekk avsløre tilstedeværelsen av verten makrofager i stenotic regionen. Figur 5 D og figur 5E igjen viser basale tarmepitelet markører keratin 5 og 14 i stenotic regionen av graftet.
Figur 1 : TETG frø og implantering skjematisk. Ben margtransplantasjon-avledet mononukleære celler fra en donor mus ble isolert av tetthet sentrifugering, seeded på et stillas og implantert i mottakerens mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Electrospinning av vev utvikling tracheal pode. (A) oversikt over electrospinning prosessen. (B) 20 G sløv nål brukes som roterer mandrel for å produsere musen stillaser. (C) animert SEM skjematisk av stillaset overflate etter mononukleære celler har blitt lagt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Oversikt over kirurgisk implantering av stillaset. (A) separasjon og retraksjon av stroppen muskler. (B) omkrets separasjon av trachea fra omkringliggende vev/organer. (C) etableringen av midlertidige tracheostomi og vedlegg til sternal hakket. (D) implantert pode etter proksimale og distale forekomst. Skala bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Histologiske bevis på basale epitelceller. Sammenslått immunofluorescence bilde av basal celle markører keratin 5 (A) og keratin 14 (B) og flettede keratin 5 og keratin 14 (C). Pilen angir epitel vevvekst på stillaset-innfødt vev krysset. Den lumen og stillaset er merket med (*) og (
), henholdsvis. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Histologiske visualisering av stenotic regionen pode. (A) langs delt H & E på lengden av trachea inkludert pode med distale stenose nær anastomose. Skala bar = 500 µm. høy effekt bilder for valgte stenotic ved hjelp H & E (B), F4/80 (C), Keratin 5 (D) og Keratin 14 (E). Skalere barer = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvikling av en musemodell for vev utviklet tracheas er viktig i å forstå faktorene som har begrenset klinisk oversettelse av TETGs; nemlig pode kollapse, stenose og forsinket epithelialization4. Noen faktorer som bidrar til disse begrensningene inkluderer utvalg av pode materiale, produksjonsprosess, stillaset design og celle seeding protokoller. Denne modellen muliggjør raskere evaluering av disse faktorene for å forstå cellulære og molekylære mekanismer berører dem.
Vi har vist her tilstedeværelsen av epitelceller (Figur 4), samt muligheten for modellen å recapitulate pode stenose (figur 5); men avhenger vellykket bruk av modellen noen viktige trinn under implantasjon prosessen. Først under første snitt og isolering av musen luftrøret er det viktig å unngå skader eller strekke av tilstøtende tilbakevendende recurrens nerver i tracheoesophageal sporet. En annen viktig faktor under fjerning av innfødte luftrøret er å unngå skade på esophagus sitter bakenfor luftrøret.
Endotracheal intubasjon kan unngås ved å opprette en midlertidig tracheostomi slik at luftstrømmen under prosedyren. Det er imidlertid viktig å holde noe (dvs. vev) fra blokkerer den midlertidige distale tracheostomi samt opprettholde luftrøret utenfor kroppens hulrom å lette åndedrett. Pode telescoping er en vanlig foreteelse i pode implantations og kan sees på histologiske deler.
Andre dyr modeller som har vært benyttet i å studere TETGs inkluderer New Zealand white kaniner, hunder, rotter, griser, og sau8,9,10,11; mange av dem kan være koste uoverkommelige og mangler omfattende kvantifisering metoder (dvs. ELISAs, Immunohistochemistry antistoffer, PCR primere, etc.) og/eller transgene alternativer. Dermed store dyr modeller brukes ofte underpowered eller ikke kan svare mekanistisk spørsmål. Bruk av transgene mus i denne modellen, i tillegg til enkel pode design og produksjon prosessen gjør det ideelt for raskere mekanistisk studier pode stenose og re epithelialization. Orthotopic transplantasjon brukt i denne TETG modellen gir fordelen av graftet blir utsatt for eksterne miljø og muligheten til å potensielt måle epithelial celledifferensiering. Imidlertid er det viktig å huske at oversettelse av transgene studier til store dyr modeller og kliniske studier kan være vanskelig. Videre mens denne musemodell kan være mer kostnadseffektivt øke populasjonsstørrelse, har det ikke de samme kliniske diagnostiske og terapeutiske evnene som større dyremodeller (dvs. bronkoskopi med endoskopisk intervensjoner) gjør det utfordrende for å sammenligne mellom resultater.
Fremtidige arbeidet med denne modellen vil bli fokusert på gransker optimal celle seeding forhold (celle type, tetthet, etc.) og dens rolle i begrensende pode stenose og forbedre epithelialization. Stillaset design er også en viktig variabel som har betydelige effekter på pode ytelse i vivo og krever mer etterforskning optimal stillaset materiale og mikrostruktur. Disse studiene vil hjelpe oversettelsen av TETGs store dyr modeller og til slutt kliniske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi ønsker å erkjenne Robert Strouse og forskning løsninger og innovasjoner divisjon landsomfattende barnesykehus for deres støtte i grafisk design. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (NHLBI K08HL138460).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
