Summary
Transplantat stenos utgör ett avgörande hinder vävnadstekniska luftvägarna ersättare. För att undersöka cellulära mekanismerna bakom stenos, använder vi en murin modell av vävnadstekniska luftrör ersättning med seedade benmärgen mononukleära celler (BM-MNC). Här, detalj vi våra protokoll, inklusive byggnadsställning tillverkning, BM-MNC isolering, graften sådd, och implantation.
Abstract
Behandlingsalternativ för medfödd eller sekundära långa segment luftrör defekter har historiskt sett varit begränsad på grund av en oförmåga att ersätta funktionell vävnad. Vävnadsteknik rymmer mycket lovande som en möjlig lösning med dess förmåga att integrera celler och signalmolekyler i en 3-dimensionell byggnadsställning. Senaste arbete med vävnadstekniska luftrör transplantat (TETGs) har sett viss framgång men deras översättning har begränsats av transplantat stenos, transplantat kollaps och försenad epithelialization. För att undersöka de mekanismer som driver dessa frågor, har vi utvecklat en musmodell för vävnadstekniska luftrör transplantat implantation. TETGs konstruerades med electrospun polymerer av polyetentereftalat (PET) och polyuretan (PU) i en blandning av PET och PU (20:80 procent vikt). Byggnadsställningar seedade sedan använda benmärg mononukleära celler isolerade från 6-8 vecka-gamla C57BL/6 möss genom lutning centrifugering. Tio miljoner celler per transplantat var seedade på lumen av ställningen och tillåtet att Inkubera över natten innan implantation mellan de tredje och sjunde trakeal ringarna. Dessa transplantat skulle kunna sammanfatta resultaten av stenos och försenad epithelialization framgår av histologisk analys och brist på Keratin 5 och Keratin 14 basala epitelceller på immunofluorescens. Denna modell kommer att fungera som ett verktyg för att undersöka cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i mottagande remodeling.
Introduction
Lång-segmentet luftrör defekter kan presentera sällsynta medfödda förutsättningar såsom fullständig trakeal ringar och luftrör agenesi, liksom trauma, malignitet och infektion. När mer än 6 cm hos vuxna eller 30% av luftrör längd hos barn, kan inte dessa brister behandlas med kirurgisk rekonstruktion. Försök att ersätta luftvägarna med autolog vävnad, avlidna transplantationer och artificiella konstruktioner har plågats av kronisk infektion, granulering, mekaniska fel och stenos.
Vävnadstekniska luftrör transplantat (TETGs) kan potentiellt adressera dessa problem samtidigt undvika behovet av livslångt immunsuppression. Under det senaste decenniet, har TETGs testats i djurmodeller och utnyttjas kliniskt i sällsynta fall av s.k. compassionate use1,2,3. I både kliniska och stora djurstudier, postoperativ återhämtning från vävnadstekniska luftvägarna ersättning krävs många interventioner för att bekämpa stenos (definierad som > 50% luminala förträngning) och underhålla luftvägarna patency. Ytterligare TETG arbete har försökt minska detta stenos genom utvärdera roll cell sådd val, vaskularisering och scaffold design. Cell sådd val och scaffold design syftar till att återställa infödda luftstrupen struktur och funktion har främst varit inriktad på andningsorganen epitelceller och kondrocyter dirigeras till olika resorberbara, icke-resorberbara och cell-lösa ställningar. Som vaskularisering sannolikt spelar en viktig roll i utvecklingen av stenos, har andra grupper fokuserat på optimera i vitro eller heterotopic modeller att påskynda revaskularisering eller neoangiogenesis4. Trots fortfarande att uppnå framgångsrika vaskularisering samtidigt som du också har en mekaniskt behöriga och funktionella TETG en utmaning. Trots senaste framsteg förblir minimera stenos ett avgörande hinder för kliniska översättning.
För att undersöka detta histopatologiska svar på TETG implantation i vivo, utvecklat vi en får modell av vävnadstekniska luftrör ersättare. Graften bestod av en blandad av polyetentereftalat (PET) och polyuretan (PU) electrospun byggnadsställning seedade med benmärg-derived mononukleära celler (BM-multinationella företag). I denna lilla kohort visat vi att seedade autolog BM-multinationella accelererade återepitelisation och fördröjd stenos5. Även om sådd med autolog BM-multinationella företag förbättrad överlevnad, oklar den cellulära mekanism som BM-multinationella modulera bildandet av funktionella neotissue.
Utredning på cellulär nivå krävs utveckling av en murin modell av vävnad konstruerad luftrör ersättare. Liknar får studien, utnyttjade vi en PET:PU electrospun byggnadsställning ympats med BM-multinationella företag. överensstämmelse med får modellen, TETG stenos utvecklats under loppet av de första två veckorna efter implantation1,2,3 ,5. Detta föreslog att murina modellen återgetts patologin observerats tidigare, gör det möjligt för oss att ytterligare förhöra de cellulära mekanismerna bakom luftvägarna stenos.
I detta betänkande detalj vi våra protokoll för vävnadstekniska luftrör ersättare i musmodell inklusive byggnadsställning tillverkning, BM-MNC isolering, graften sådd och implantation (figur 1, figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) på rikstäckande Barnsjukhus.
1. byggnadsställning tillverkning
- Bered en polymer nanofiber föregångare av: 1) upplösning 8 wt % PET i 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol och värme lösningen till 60 ° C och 2) upplösning 3 wt % PU i 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol vid rumstemperatur.
- När svalnat, kombinera lösningarna för att skapa en slutliga polymeren blandning av PET och PU (20:80).
- Electrospin PET+ PU lösningen på en rostfri stång (1 mm diameter) utnyttja en 20 G trubbig spets nål på en 60 mL Spruta fylld med PET:PU lösningen med en hög spänning DC power supply till + 14 kV på nålen, en annan hög spänning DC power supply set till -3 kV , en 5 mL/h flödeshastighet, och 20 cm spets-till-substrat avstånd. Rotera stången vid 350 rpm under fiber nedfall.
- Fortsätta electrospinning tills önskad byggnadsställning väggtjockleken 300 µm uppnås. Skjut på schavotten av staven, håller sedan det under vakuum över natten för att ta bort eventuella resterande lösningsmedel.
- Sterilisera ställningen med hjälp av en ultraviolett ljus dosering av 350 mJ/cm2 före implantation.
2. benmärg-Derived mononukleära celler (BM-MNC) skörd
- Avliva en 6-8 veckor gammal, kvinnliga, C57BL/6 mus med en cocktail av Ketamin (200 mg/kg), xylazin (20 mg/kg) och ketoprofen (10 mg/kg). Kontrollera om komplett dödshjälp genom svans-nypa metod. Var noga med att följa lokala riktlinjer för dödshjälp.
- Under sterila förhållanden och att ta bort huden över lårbenet och skenbenet att exponera ben med fina sax och mikro-Adson pincett. Använda Dumont #5 pincett och Dumont #5/45 pincett för att ta bort fascian och senor. Separera benen och skär dem på båda ändarna. Med hjälp av en 5 mL spruta och en 25G nål, spola benmärgen i en petriskål innehållande 30 mL Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) media. Filtrera här RPMI med benmärgen genom en 70 µm nylon cell sil till en 50 mL tub.
- En biosäkerhet skåp, placera 5 mL av polysurcrose och natrium diatrizoate i en 15 mL tub. Försiktigt lägga i RPMI innehållande benmärgen mononukleära celler längs sidan av röret för att undvika blandning av de två skikten. Centrifugera vid 461 x g i 30 min med ”broms 1” vid 24 ° C.
Obs: Våra centrifug, bromsen 1 står för den längsta kör på tid under retardation. - Av de tre skikten bildas, kassera det översta (rosa) lagret av plasma och samla mellanlagret (clear) bestående av benmärgen mononukleära celler. Kassera fällningen av röda blodkroppar.
- Späd ut benmärgen mononukleära celler (BM-MNC) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en 1:1 ratio och centrifugera vid 461 x g under 10 minuter med ”broms 9” vid 24 ° C.
- Avlägsna supernatanten och späd pelleten med 5 mL PBS. Centrifugera vid 461 x g i 10 min med ”broms 9” vid 24 ° C.
- Avlägsna supernatanten och späd pelleten med ~ 10 mL RPMI.
- Späd 10 µL av BM-MNC lösningen med en lika stor volym 0,4% trypan blå i en 1 mL tub. Plats 10 µL av lösningen i en cell som räknar kammare bild. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cell räknare. Upprepa steg och beräkna det genomsnittliga antalet celler.
Obs: Ett genomsnittligt celltal 1 X 108 celler erhölls från användningen av två givare möss. Detta skulle motsvara två lårbenet och två förbenade som ben märg är isolerad från. - Centrifugera BM-MNC lösningen vid 461 x g i 10 min med ”broms 9” vid 24 ° C. Avlägsna supernatanten och späd cellkoncentrationen till 107 celler/graft.
Obs: Vi har studerat sådd effektivitet mellan 1, 10 och 100 miljoner celler och funnit att 10 miljoner celler per transplantat ger högsta sådd effektivitet.
3. cell sådd på grafterna
- Mäta längder av ställningar och om det behövs, skär dem till en längd av 5 mm.
- Pre våt schavotten med 5 µL RPMI för 5 min. ta bort RPMI.
- Tillsätt 5 µL av BM-MNC lösningen till lumen av ställningen i 10 min.
- Passera en 21G nål genom lumen av transplantatet och inkubera transplantat i 1000 µL RPMI över natten vid 37 ° C i en inkubator.
4. graft Implantation
Obs: Bör vara försiktig att upprätthålla aseptisk teknik under förfarandet för transplantat-implantation.
- Använd 6-8-vecka-gammal kvinnlig C57BL/6 möss som mottagare för cell seedade grafterna. Injicera enrofloxacin (10mg/kg) subkutant 24 h före operation och strax innan snittet.
- Väga musen och administrera en 0,1 mL/10 g dos bedövningsmedel cocktail av Ketamin (100 mg/kg), xylazin (10 mg/kg) och ketoprofen (5 mg/kg) som analgesi intraperitonealt.
- Kontrollera om planet av anestesi har uppnåtts genom svans-nypa metod. Som bekräftar grad av sedering, tillämpa en steril oftalmologiska salva till ögonen och klippa håret på den kirurgiska platsen från hakan till nyckelbenen. Placera djuret på en dyna i en dorsal recumbent position. Desinfektera operationsområdet med först en povidonjod prep pad, följt av en alkohol prep pad (70% alkohol), och återigen en povidonjod prep pad.
- Placera djuret under mikroskopet dissekera med huvudet bort från kirurgen. Gör en mittlinjen snitt alltifrån nyckelbenen till tungbenet med hjälp av fina sax och mikro-Adson pincett. Ren fascian med Dumont #5 och Dumont #7 fina pincett, tillsammans med en steril bomullspinne om det behövs, och infoga själv behålla Colibri upprullare.
- Öppna de remmen musklerna (figur 3A) med Dumont #5 och Dumont #7 fina pincett att exponera sköldkörteln brosk, cricoid brosk och luftstrupen. Rakt på sak separat luftstrupen från återkommande larynx nerverna löper parallellt på vardera sidan, följt av omkretsriktningen separation av luftstrupen från matstrupen (figur 3B).
- Med en 20G nål och kirurgisk märkpenna, färga den främre delen av luftstrupen.
- Identifiera luftstrupen och gör ett snitt under tredje trakeal brosk ringen och transekt luftstrupen med hjälp av ett par Vännäs-Tubingen våren sax och ett par Dumont #7 fina pincett. Håller den med fina böjda pincetten, säkra distala luftstrupen till bröstbenet med steril 9-0 nylon sutur för att skapa en tillfällig trakeostomi (figur 3C). Obs: Ett alternativt sutur material som kan användas är 9-0 PDS för trakeal implantation och muskel reapproximation.
- Med en 20G nål och en kirurgisk märkpenna, fläcken transplantat för att representera den främre delen.
- Implantatet graften infoga den proximala-bakre, proximala-sido och proximala-främre suturer, i den ordningen med 9-0 sterila nylon sutur (figur 3D), Dumont #7 fina pincett och en nålförare.
- Vrid djur 180° för att placera sin svans från kirurgen. Släpp den tillfälliga trakeostomi. Distala luftstrupen är ofullständigt transected för att tillåta användning av opererande segmentet som en stubbe för returgående fas. När inte längre behövs, tas 5 MM luftstrupen segmentet bort helt.
- Komplett distal anastomos genom att placera suturerna på liknande sätt som proximal anastomos.
- Re ungefärliga positionen transplantat och remmen muskler. Nära snittet med 9-0 sterila nylon suturer i ett löpande mönster.
- Injicera 0,1 mL av Buprenorfin (0,1 mg/kg) subkutant och placera djuret i en återhämtning bur placerad på en värmedyna utan andra djur i bur.
- Iaktta musen tills det är medveten och kunna ambulate, sedan överföra musen till en ny bur med mjuka sängkläder, fuktig chow och medicinerade vattnet (ibuprofen, 30 mg/kg) för 48 h. Efter denna tidsperiod, återgå musen till en normal bur med andra möss.
Obs: Möss som bibehåller andnöd eller minskad aktivitet efter implantation observeras av laboratorium och/eller djur personal i en 32 ° C inkubator. Om detta fortsätter för mer än 48 h bör sedan möss bli euthanized.
5. histologi och immunohistokemi
Obs: Hematoxylin och eosin fläckar utfördes med standardiserad teknik av rikstäckande Barnens sjukhus morfologi Core. Immunohistokemi utfördes enligt de nedanstående steg.
- Deparaffinize bilderna med 1) xylen för 5 min, 2) xylen i 5 min, 3) 100% etanol för 5 min, 4) 90% etanol för 5 min, 5) 70% etanol för 5 min, 6) destillerat H2O (dH2O) under 5 minuter.
- Doppa glasen i citratbuffert och placera i vattenfyllda tryckkokare. Värme för 10 min sedan låta svalna till rumstemperatur. Tvätta med 0,1% bovint serumalbumin i PBS (BSA-PBS) för 5 min. Skölj med dH2O.
Obs: Uppvärmning kan också göras med vattenbad eller mikrovågsugn för 15 min. - Inkubera i bilderna med 3% normala get serum i PBS för 1 h i rumstemperatur. Tvätta med 0,1% BSA-PBS för 5 min. Inkubera i primär antikropp med koncentrationer för keratin 5 (1: 1000)6, keratin 14 (1: 250)6 och F4/80 (1: 100)7 för 18 h över natten vid 4 ° C.
- Tvätta med 0,1% BSA-PBS två gånger i 10 min varje tvätta. Inkubera med lämpliga sekundära antikroppar vid koncentration av 1: 500 för K5/K14 och 1:300 F4/80 för 1 h i rumstemperatur. Tvätta med 0,1% BSA-PBS två gånger i 10 min varje tvätta.
- Monteringstyp 4', 6-diamidin-2-phenolindole (DAPI) som innehåller montering media och glas täckglas. Låt sitta i 30 min innan imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en Schematisk bild av TETG sådd och implantation. Benmärgen skördades från C57BL/6 möss och odlade i vitro. BM-multinationella företag var isolerade med densitet centrifugering och seedade på TETG. Seedade TETGs var implanteras i en syngena C57BL/6 mottagare mus.
Figur 2 finns en översikt över PET:PU TETG ställningen tillverkningsprocessen. PET:PU lösning var electrospun på en 20 G trubbig nål för att uppnå en slutlig TETG väggtjocklek av 300 µm och lumen diameter av 1 mm att approximera infödda mus luftstrupen. Ytan av TETG kan ses i svepelektronmikroskop bilden med animerade mononukleära celler.
Förfarandet för kirurgisk implantation beskrivs i figur 3 med de viktigaste stegen som visas. Figur 3 visar separation och indragning av remmen muskler (figur 3A) och efterföljande omkretsriktningen isolering av luftstrupen från omgivande vävnader (figur 3B). Figur 3 C visar den distala tillfälliga trakeostomi med anknytning till sternala skåran att säkerställa patent luftväg under förfarandet. Slutligen visar figur 3D transplantat på plats efter final anastomoser.
I en liten kohortstudie, var fyra möss implanteras med TETGs och följde under en två veckors period. Några basala epitelceller kan uppskattas i basalcellscancer keratin 5 och 14 färgning visas i figur 4A-C. Kombinerade bilden (figur 4C) visar förekomsten av basala celler på luminala ytan av graften 7 dagar efter implantation.
Tre av de fyra djuren visade tecken på andnöd och stridor, varav två krävs förtida uppsägning på postoperativ dag 1 och 7. Efter explantation och histologisk analys identifierades transplantat stenos som den viktigaste bidragande faktorn till komplikationer. Figur 5 A-E ger en bild av postoperativ dag 7 djurets stenotiska regionen av TETG. Notera är teleskopfunktion transplantat och infödda luftstrupen ett vanligt konstaterande på grund av kirurgisk teknik. Den låg (figur 5A) och hög (figur 5B) drivs photomicrograph av stenos visar en av de huvudsakliga komplikationerna av TETG implantation. Figur 5 C är en representativ F4/80 fläck avslöja förekomsten av värd makrofager i regionen stenotiska. Figur 5 D och figur 5E igen visar basala epitelial cell markörer keratin 5 och 14 på stenotiska regionen av graften.
Figur 1 : TETG sådd och implantation Schematisk. Benmärg-derived mononukleära celler från en givare mus var isolerade med densitet centrifugering, seedade på en byggnadsställning och implanteras i en mottagare mus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Electrospinning av tissue engineered luftrör transplantat. (A) översikt över electrospinning. (B), 20 G trubbig nål används som roterande Dorn för att tillverka musen ställningar. (C) animerad SEM Schematisk av byggnadsställning yta efter mononukleära celler har lagts. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Översikt över kirurgisk implantation av byggnadsställning. (A) Separation och indragning av remmen muskler. (B) omkretsriktningen separation av luftstrupen från omgivande vävnader/organ. (C) skapande av tillfälliga trakeostomi och fastsättning sternala skåran. (D) inopererad transplantat efter proximala och distala anastomoser. Skalstapeln = 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Histologiska tecken på basal epitelceller. Sammanslagna immunofluorescens bild av basalcellscancer markörer keratin 5 (A) och keratin 14 (B) och sammanslagna keratin 5 och keratin 14 (C). Pilen anger epitelial vävnadstillväxt vid korsningen byggnadsställning-native vävnad. De lumen och byggnadsställning betecknas med (*) och (
), respektive. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Histologiska visualisering av stenotiska regionen av transplantat. (A) längdriktningen sektioneras H & E av luftstrupen inklusive transplantat med distala stenos nära anastomos längd. Skalstapeln = 500 µm. hög effekt bilder av valda stenotiska regionen med H & E (B), F4/80 (C), Keratin 5 (D) och Keratin 14 (E). Skala barer = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utveckling av en musmodell för vävnadstekniska tracheas är grundläggande för att förstå de faktorer som har begränsad klinisk översättning av TETGs; nämligen transplantat kollaps, stenos och fördröjd epithelialization4. Några faktorer som bidrar till dessa begränsningar inkluderar urval av transplantat material, tillverkningsprocessen, scaffold design och cell sådd protokoll. Denna modell tillåter snabbare utvärdering av dessa faktorer för att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som påverkar dem.
Vi har visat här förekomsten av epitelceller (figur 4) samt modellen förmåga att sammanfatta transplantat stenos (figur 5). framgångsrik användning av modellen beror dock på några viktiga steg under implantationsprocessen. Först, under inledande snitt och isolering av mus luftstrupen är det viktigt att undvika skada eller stretching av intilliggande återkommande larynx nerver ligger i trakeoesofageala spåret. En annan viktig faktor under resektion av infödda luftstrupen är att undvika skada på matstrupen sitter posteriort luftstrupen.
Endotrakeal intubation kan undvikas genom att skapa en tillfällig trakeostomi så att luftflöde under förfarandet. Det är dock viktigt att hålla något (dvs vävnad) från blockerar den tillfälliga distala trakeostomi liksom behålla luftstrupen utanför kroppen hålighet att underlätta andningen. Transplantat teleskopering är en vanlig företeelse i transplantat implantationer och kan ses på histologiska sektioner.
Andra djurmodeller som har använts för att studera TETGs inkluderar nya Zeeland vita kaniner, hundar, råttor, svin och får8,9,10,11. varav många kan vara kosta oöverkomliga och saknar heltäckande kvantifiering metoder (dvs ELISAs, immunohistokemi antikroppar, PCR primers, etc.) och/eller transgena alternativ. Således stor djurmodeller används är ofta underpowered eller inte besvara mekanistiska frågor. Användningen av transgena möss i denna modell samt okomplicerad transplantat design och tillverkning processen gör den idealisk för snabbare mekanistiska studier tittar på transplantat stenos och återepitelisation. Ortotop transplantation används i denna TETG modell ger fördelen att transplantatet exponeras för den yttre miljön och förmågan att kunna mäta epitelial celldifferentiering. Dock är det viktigt att komma ihåg att översättning av transgena studier till stora djurmodeller och kliniska prövningar kan vara svårt. Vidare, medan denna musmodell kan potentiellt vara mer kostnadseffektivt öka befolkningens storlek, den för närvarande har inte samma kliniska diagnostiska och terapeutiska möjligheter som större djurmodeller (dvs. bronkoskopi med endoskopisk insatser) vilket gör det svårt för att jämföra mellan utfall.
Framtida arbete med denna modell kommer att fokuseras på att undersöka optimal cell sådd villkor (celltyp, densitet, etc.) och dess roll i begränsande transplantat stenos och förbättra epithelialization. SCAFFOLD design är också en viktig variabel som har betydande effekter på transplantat prestanda i vivo och kommer att kräva mer undersökning beträffande de optimala byggnadsställning material och mikrostruktur. Dessa studier kommer att hjälpa i översättningen av TETGs till stora djurmodeller och så småningom kliniska prövningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi skulle vilja erkänna Robert Strouse och forskning informationslösningar & innovationer division på rikstäckande barnsjukhus för deras stöd i grafisk design. Detta arbete stöds av ett bidrag från NIH (NHLBI K08HL138460).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
