Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lipidomics og transcriptomics i neurologiske sygdomme

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/59423
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Summary

Denne artikel præsenterer en modulær protokol for vævlipidomik og transkriptomik og plasmalipidomik i neurologiske sygdomsmusmodeller rettet mod lipider, der ligger til grund for inflammation og neuronal aktivitet, membranlipider, nedstrøms budbringere og mRNA-kodende enzymer / receptorer, der ligger til grund for lipidfunktionen. Prøveudtagnings-, prøvebehandlings-, ekstraktions- og kvantificeringsprocedurer er skitseret.

Abstract

Lipider tjener som den primære grænseflade til hjernefornærmelser eller stimuli, der fremmer neurologiske sygdomme og er et reservoir til syntese af lipider med forskellige signal- eller ligandfunktion, der kan understrege sygdommens begyndelse og progression. Lipider, der ofte ændrer sig på det præsymptomatiske niveau, er en ny kilde til lægemiddelmål og biomarkører. Mange neurologiske sygdomme udviser neuroinflammation, neurodegeneration og neuronal excitabilitet som fælles kendetegn, delvis moduleret af specifikke lipidsignalsystemer. Den indbyrdes afhængighed og indbyrdes sammenhæng mellem syntese af forskellige lipider tilskynder til en multilipid-, multienzym- og multireceptoranalyse for at udlede fællestræk og specificiteter i neurologiske sammenhænge og for at fremskynde optrævlingen af mekanistiske aspekter af sygdomsdebut og progression. At tilskrive lipidroller til forskellige hjerneområder fremmer bestemmelsen af lipidmolekylær fænotype og morfologi forbundet med en neurologisk sygdom.

Præsenteret her er en modulær protokol, der er egnet til analyse af membranlipider og nedstrøms lipidsignaler sammen med mRNA af enzymer og mediatorer, der ligger til grund for deres funktionalitet, ekstraheret fra diskrete hjerneområder, der er relevante for en bestemt neurologisk sygdom og / eller tilstand. For at sikre nøjagtig komparativ lipidomisk profilering blev arbejdsgangene og driftskriterierne optimeret og standardiseret til: i) hjerneprøveudtagning og dissektion af regioner af interesse, ii) co-ekstraktion af flere lipidsignaler og membranlipider, iii) dobbelt lipid / mRNA-ekstraktion, iv) kvantificering ved væskekromatografi multiple reaction monitoring (LC / MRM) og v) standard mRNA-profilering. Denne arbejdsgang er egnet til de lave vævsmængder, der opnås ved prøveudtagning af de funktionelt diskrete hjerneunderregioner (dvs. ved hjernestansning), hvilket forhindrer bias i multimolekylær analyse på grund af vævsheterogenitet og / eller dyrevariabilitet. For at afsløre perifere konsekvenser af neurologiske sygdomme og etablere translationelle molekylære udlæsninger af neurologiske sygdomstilstande forfølges og beskrives også prøveudtagning af perifere organer, behandling og deres efterfølgende lipidomiske analyse samt plasmalipidomik. Protokollen er demonstreret på en akut epilepsimusemodel.

Introduction

Nylige fremskridt inden for lipidernes funktion og deres rolle i begyndelsen og udviklingen af neurologiske sygdomme åbner nye forsknings- og udviklingssteder for nye terapeutiske mål og sygdomsmekanismeudredning1. Dokumenterede forskelle i lipidsammensætning i forskellige hjerneområder, understreget af moderne molekylære billeddannelsesteknikker såsom massespektrometribilleddannelse og avanceret massespektrometriprofilering, skifter paradigmet for lipidundersøgelse fra hele hjernen mod funktionelt adskilte og diskrete hjerneområder. Det faktum, at lipidsammensætningen varierer i forskellige hjerneområder, medfører ny konceptualisering af både membranlipidfølsomhed og nedstrøms lipidsignalering som reaktion på en hjernefornærmelse eller stimuli på tværs af de funktionelt forskellige hjerneområder. Derfor kræver lipidprotokoller nye udviklinger for at imødegå udfordringen med lave vævsmængder til detektion og kvantificering af højere rumlig opløsning og samtidig analyse af flere lipidkomponenter i cellemembraner og signalveje. Bestemmelse af enzymer, lipidligander og receptorer, der er involveret i reguleringen af deres niveauer og funktion, er også afgørende for at belyse de signalveje, der er berørt af en neurologisk sygdom, og guide nye mekanistiske undersøgelser i en patofysiologisk sammenhæng.

Ud over den øgede hjerne rumlige opløsning er der to store vanskeligheder, der udfordrer udviklingen af nye neurolipidomiske tilgange. For det første er lipidsignalmolekylerne typisk af meget lav overflod sammenlignet med membrankonstitutive lipider. For det andet udviser lipidomet en høj strukturel heterogenitet, vanskelig at dissekere ved hjælp af en enkelt analytisk tilgang. Derfor er ekstraktions- og analysemetoder skræddersyet til forskellige lipidkategorier og udføres almindeligvis i forskellige vævsprøver2. Shotgun lipidomiske metoder3 er fremragende værktøjer til hurtigt at afsløre en bred profil af membranlipider, mens øget følsomhed og selektivitet, der ydes af de målrettede opdagelses- og kvantificeringsmassespektrometriske metoder, udnyttes til undersøgelse af lavt rigelige signallipider, herunder: i) inflammatoriske lipider og ii) lipider involveret i modulering af neuronal aktivitet, såsom endocannabinoider (eCB'er), aminosyrebundne lipider, osv.4,5. For at omfatte lipidændringer på både cellemembranen og signalniveau, der forekommer i hjerneområder af neurologiske sygdomsmodeller, udføres typisk lipidekstraktion og analyse i forskellige vævsprøver, opnået fra forskellige dyrepartier eller fra forskellige halvkugler eller ved at dissekere en større vævsregion i flere stykker. Når mRNA-niveauer af enzymreceptorer også er af interesse, kræver deres undersøgelse typisk indkøb af en særskilt vævsprøve. For eksempel ville undersøgelsen af membranlipider, endogene cannabinoider og mRNA kræve tre forskellige vævsprøver (f.eks. To prøver til de to lipidekstraktionsmetoder - membranlipider og signallipider - og efterfølgende to lipidanalysemetoder - og en prøve til mRNA-analyse). Undersøgelse af inflammatoriske lipider og endogene cannabinoider kræver henholdsvis to forskellige vævsprøver, ekstraktionsmetoder og analysemetoder. Et andet eksempel er undersøgelsen af mRNA og af enhver lipidkategori i en hjernestans eller lasermikrodissektionsprøve, som derfor kræver, at to forskellige dyr indkøber to prøver pr. Hjerne (sub)region. Der forekommer ofte en betydelig grad af variabilitet og/eller ringe reproducerbarhed af resultaterne i sådanne tilfælde som følge af biologisk variabilitet og/eller vævsheterogenitet. Styret af disse praktiske begrænsninger ved multimolekylær analyse, der især forekommer ved høj rumlig opløsning i hjernen, blev der designet en tre-modul neurolipidomics-protokol, der omfattede: 1) coextraktion og co-analyse af LC / MRM af inflammatoriske lipider (f.eks. Eicosanoider (eIC'er)) og lipider involveret i modulering af neuronal aktivitet, såsom eCC'er2; 2) co-ekstraktion af phospholipider (PL'er) og eCC'er med efterfølgende multiscan LC/MRM og precursor/neutral loss scan analyse2; og 3) dobbelt ekstraktion af membran (phospho)lipider og eCB'er samt mRNA med efterfølgende LC/MRM- og qPCR- eller RNA-sekventeringsanalyse6. Afhængigt af det biologiske spørgsmål, der skal behandles i en neurologisk sygdom, og hjerneområdet af interesse kan en kombination af den første og den anden protokol eller den første og den tredje protokol anvendes på den samme vævsprøve for væv, der vejer omkring 4 mg. Den første og tredje protokol kan anvendes uafhængigt for væv omkring 2 mg. Den anden protokol kan anvendes til væv, der vejer så lidt som 0,5 mg. Uanset hvilket neurolipidomisk protokolmodul der vælges, er vævsprøveudtagning og præanalytisk behandling, hjerneisolering og regionsdissektion samt proceduren for ofring af dyremodellen standardiseret og identisk for alle tre moduler i protokollen. I vores undersøgelse af neurologiske sygdomme indsamles og analyseres perifere organer, der er relevante for sygdommens patologiske konsekvenser, altid også ved hjælp af disse modulære protokoller. Derudover udtages der regelmæssigt prøver af blod til plasmalipidomik for at tjene som et udlæsningsværktøj for neurologiske sygdomme med henblik på potentielle translationelle anvendelser. Den her præsenterede modulære lipidomics-protokol er meget alsidig: skalerbar til større vævsmængder og let anvendelig til stort set enhver vævstype og sygdom. Til anvendelse af den modulære protokol (Figur 1) i neurologiske sygdomme er enhver standardiseret gnavermodel for debut og progression af neurologiske lidelser, såsom traumatisk hjerneskade, Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom eller epilepsi, modtagelige.

Disse protokoller er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere ændringer i vævlipidomet og/eller transkriptomet i den akutte fase af epilepsi i den kainsyre (KA)-inducerede musemodel af epilepsi2,7, en model, der i vid udstrækning anvendes i prækliniske undersøgelser på grund af ligheden med human temporal lobe epilepsi (TLE)8,9,10,11. Ved hjælp af disse protokoller blev det terapeutiske potentiale af lægemidler som Palmitoylethanolamid (PEA)12,13 vurderet i den samme musemodel af epilepsi. Undersøgelsen identificerede lipid- og mRNA-ændringer ved høj og lav rumlig opløsning i hjernen og periferien, på tidspunktet for maksimale akutte anfaldsintensiteter (ved 60 minutters postbeslaglæggelsesinduktion) og ved subkronisk og akut behandling med PEA på fire forskellige tidspunkter (20, 60, 120 og 180 minutter) efter KA-anfaldsinduktion, et tidsvindue, der dækker den akutte fase af epilepsi. Plasma, hjerner og perifere organer fra ubehandlede KA-injicerede mus, akutte og subkronisk ærtebehandlede mus samt køretøjs- og PEA-køretøjskontrolmus blev indsamlet på hvert tidspunkt12,13 og undersøgt med denne molekylære analyse. De molekylære data var korreleret med adfærdsmæssige fænotyper opnået ved anfaldsscoring såvel som med immunohistokemi-afledte data om neurodegenerative processer for at optrævle progressionen af den akutte epilepsifase og PEA's potentiale til at lindre den.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer, der er beskrevet her, er i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs rådsdirektiv af 22. september 2010 (2010/63EU) og blev godkendt af den lokale dyrekomité i delstaten Rheinland-Pfalz, Tyskland (filreference: 23 177-07/G16-1-075).

1. Dyremodel af akut og profylaktisk behandlet KA-induceret epilepsi

  1. Udfør anfaldsinduktion, behandling og adfærdsmæssig scoring.
    1. Adskil mus (minimum n = 6 mus pr. gruppe) i enkeltbure.
    2. Der fremstilles anfalds-induktionsindsprøjtningsopløsning og det tilsvarende køretøj (jf . tabel 1) samt behandlingsindsprøjtningsopløsning og det tilsvarende køretøj (jf . tabel 2).
    3. Injicer mus intraperitonealt (i.p.) (10 ml/kg musekropsmasse) uden bedøvelse i henhold til deres gruppeidentitet: sygdom, behandlet eller behandlet køretøj (dvs. KA, PEA-behandlet KA og de to køretøjsgrupper). Se figur 2, tabel 1 og tabel 2.
    4. Overvåg og score adfærden i henhold til følgende standardiserede anfaldsintensitetsskala: 0 = intet svar; 1 = immobilitet og stirring; 2 = forben og/eller haleforlængelse, stiv kropsholdning; 3 = gentagne bevægelser, hoved bobbing; 4 = opdræt og fald; 5 = kontinuerlig opdræt og fald 6 = alvorlige klonisk-toniske anfald; 7 = død14,15 (figur 3).
  2. Udfør offerprocedure for lipidomisk og transkriptomisk analyse.
    1. På fire tidspunkter (dvs. henholdsvis 20, 60, 120 og 180 minutter efter KA- eller køretøjsindsprøjtning) ofres seks mus fra hver af følgende grupper: PEA-behandlet, PEA-ubehandlet epileptisk køretøj 1 og køretøj 2 efter IACUC-godkendte protokoller.
    2. Ti sekunder efter hvert tidspunkt er nået, bedæses musene ved hjælp af et isofluran-gennemblødt væv i et glaskammer. Bekræft anæstesi ved tab af den rigtige refleks, indikeret af manglende evne til at bevæge sig, mens du langsomt vælter glaskammeret. Halshug mus ved hjælp af kirurgisk saks og opsaml plasma, hjerne og perifere organer (se trin 2.2.2-2.2.4).
      FORSIGTIG: Etiske regler for ofring af procedurer varierer mellem lokale dyrekomitéer. Sørg for at kontrollere og følge de regler, der er udstedt af den lokale dyrekomité.
  3. Følg offerproceduren for immunohistokemianalyse.
    1. For immunohistokemisk farvning13 scorer adfærdsmæssigt tre mus fra hver af følgende grupper: PEA-behandlet, PEA-ubehandlet epilepsi og køretøjsgrupper over hele tidsforløbet (180 min).
    2. Ofre og perfuse mus 5 dage senere. Bedøm mus dybt (se trin 1.3.1 for musegrupperne) ved i.p. injektion af pentobarbital (100 mg/kg) og buprenorphin (0,1 mg/kg) som narkotiske lægemidler. Bekræft dyb anæstesi ved tab af refleks mellem tæerne.
    3. Fastgør musen på en polystyrenplade, og åbn straks brystkassen ved hjælp af fin saks og standard tang. Sæt sommerfuglen i venstre hjerteventrikel og skær højre atrium ved hjælp af en fin saks.
    4. Juster pumpens hastighed og tryk til et konstant peristaltisk flow med en hastighed på 2-3 ml/min. Perfus med iskold fosfatbufret saltvand (PBS) i ~5 min. Udskift om nødvendigt sommerfuglen.
      BEMÆRK: Ved korrekt perfusion begynder de indre organer (undtagen milten) at blege ud inden for 1-2 minutter.
    5. Skift perfusion til iskold 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning i ~5 min. Isoler hele hjerner som beskrevet i trin 2.2.2 og fastgør for 24 timer i 4 % PFA-opløsning ved 4 °C.
    6. Inkubere hjerner i 30% saccharoseopløsning i 48 timer ved 4 °C. Fjern den resterende saccharose med et tørt silkepapir og frys hjernen på en metalplade (-80 °C). Opbevar hjernerne ved -80 °C til farvningsprocedurerne13.

2. Prøveudtagningsprocedurer for lipidomisk/transkriptomisk analyse

  1. Forbered dig på prøveudtagning.
    1. Precool EDTA-rør til plasmaprøveudtagning til 4 °C. Forkøl centrifuge- og hvirvelapparatet til 4 °C. Forkøl metalpladen dækket med aluminiumsfolie (for at snappe frossen hjerne og / eller andet væv af interesse) på tøris (-80 ° C). Precool de mærkede 2 ml og 5 ml rør på tøris (-80 ° C) til henholdsvis plasmaalikvoter, frosset væv og hjerneopsamling. Brug gule rør til at beskytte lysfølsomme molekyler, såsom eiC'er.
    2. Rengør vævsprøveudtagnings- og isoleringsudstyret (kirurgisk saks, lige skarp fin saks, lige glat standardtang, fin tang med spejlfinish, buet tang og spatel, polystyrenskumplade og nåle til fiksering) med et desinfektionsmiddel (f.eks. 70% ethanol).
  2. Prøveudtagningsprotokoller
    1. Bestem rækkefølgen af prøveudtagning.
      1. Blod opsamles umiddelbart efter halshugning i forkølede 1 ml EDTA-rør (se trin 2.2.3).
      2. Fjern hele hjernen og snap freeze umiddelbart efter fjernelse. Dette trin tager 1-2 minutter. Opbevar frosne hjerner ved -80 °C til videre behandling (se trin 2.2.2).
      3. Fjern perifere organer af interesse (f.eks. lunge, hjerte, lever) inden for 5 minutter efter fjernelse af hjernen, og snap freeze og opbevar ved -80 °C til videre behandling (se trin 2.2.4).
    2. Fjern hjernen til dissektion eller stansningsprocedurer. Denne procedure tager 1-2 min/hjerne.
      1. Efter halshugning (se trin 1.2) skal du begynde at lave et midterlinjesnit i huden ved hjælp af en fin saks. Frigør kraniet ved at vende huden over øjnene. Nå til toppen af kraniet og lav et lille kaudalt snit, der starter på niveauet af den intraparietale knogle. Undgå at skære gennem hjernen.
      2. Skær fast gennem den mest forreste del af kraniet mellem øjnene for at lette hjernens fjernelse. Vip den ene side af parietalbenet ved hjælp af buede smalle mønsterpincet og bryd af. Gentag det sidste trin for den anden side.
      3. Fjern hjernehinderne. Skub en spatel under den forreste del af hjernen (dvs. den olfaktoriske pære) og vip hjernen forsigtigt opad. Skub spatlen længere ned for at bryde optikken og andre kraniale nerver.
      4. Løft hjernen ud af kraniet og snap frys hele hjernen straks på en forkølet (-80 ° C) metalplade med den ventrale side vendt mod metalpladen (dorsal op).
      5. Lad hjernerne fryse helt ned og overføre til forkølede 5 ml-rør og opbevare dem ved -80 °C, indtil hjerneområderne dissektion eller stansningsproceduren (se trin 3.1 og 3.2).
    3. Udfør plasmaprøveudtagning.
      1. Spike prækølede EDTA-rør med 10 μL frisklavet indomethacinfortynding til en målkoncentration på 10 μM.
      2. Saml bagagerummet blod umiddelbart efter halshugning ved blid klemning af kroppen i forkølede EDTA-rør til et maksimalt blodvolumen på 1 ml.
        BEMÆRK: I tilfælde af korrekt blodtryk er klemning ikke påkrævet. Hvis blodvolumenet er mindre end 1 ml, skal du reducere isofluraninkubationstiden for at muliggøre korrekt blodgennemstrømning.
      3. Umiddelbart centrifuge blodrør ved 2.000 x g i 10 min ved 4 °C.
      4. Den resulterende øvre plasmafase fjernes, og med henblik på multilipidanalyse alikvot defineres plasmavolumener i forkølede 2 ml-rør som følger: 50 μL til analyse af eCB'er/eiC'er, 30 μL til PL-analyse og det resterende plasmavolumen som backupprøve eller til andre typer analyser.
      5. Plasmaprøverne opbevares ved -80 °C med henblik på yderligere ekstraktion (se trin 4.1.2 og 4.1.4).
    4. Udfør perifer organprøveudtagning.
      BEMÆRK: Brug henvisninger til musens anatomi16 og dokumentation for de obligatoriske kurser (FELASA), som dyreforskere deltager i, til at identificere de enkelte organer, deres bindevæv og/eller blodkar.
      1. Immobiliser musetorsoen for at lette organfjernelsen ved hjælp af nåle. Lav et ventralt midterlinjesnit ved hjælp af en lige skarp saks i pubisens højde. Brug stump standard tang til at fiksere abdominalvæggen, mens du skærer for at åbne bukhulen.
      2. Immobiliser huden for at tillade abdominal organfjernelse ved hjælp af stump tang. For hjerte- eller lungefjernelse skal du fortsætte medialt snit i retning af brysthulen. Fjern lungen og/eller hjertet med fine tang.
      3. Åbn brysthulen omhyggeligt for at undgå blødning. Skær bindevæv og blodkar, der forankrer det respektive organ uden at skære gennem organet.
      4. Overfør straks vævsstykker på forkølede metalplader (-80 °C) og lad dem fryse helt. Vævsstykker overføres til forkølede rør og opbevares ved -80 °C til videre behandling (se trin 4.1).

3. Forarbejdning af biologisk materiale

BEMÆRK: Til co-ekstraktion af eCB'er / eiC'er anvendes 2 ml ravrør som ekstraktionsrør og tilsættes i hvert rør syv forkølede stålkugler. Til co-ekstraktion af PL'er / eCB'er og til dobbelt lipid- og RNA-co-ekstraktion skal der anvendes 2 ml RNAse-fri ekstraktionsrør spiket med keramiske perler (Table of Materials).

  1. Udfør hjernedissektion og perifer organbehandling.
    BEMÆRK: Brug forstørrelseslamper til at øge hjernens synlighed til dissektion.
    1. Rengør de kirurgiske værktøjer, herunder tangen med super fine spidser, 2x med 70% ethanol.
    2. Overfør de frosne hjerner fra -80 °C til en petriskål, der indeholder forkølet fysiologisk buffer (pH 5,5) Sørg for, at petriskålen er ved 4 °C. Tillad hjerner at fryse helt af for at tillade dissektion. Test omhyggeligt ved hjælp af tang.
      FORSIGTIG: Hold ikke hjernen på 4 °C længere end nødvendigt for optøning.
    3. Forkøl en metalplade på is (4 °C) og dæk den med vådt væv gennemblødt i iskold fysiologisk buffer (pH 5,5) og overfør hjernen med ventral side op forsigtigt på en forkølet (4 °C) metalplade på is. Dæk det med vådt væv gennemblødt i iskold fysiologisk buffer (pH 5,5).
    4. Dissekere hjerneområder inden for maksimalt 5 minutter ved hjælp af super fine spids tang. Start med hypothalamus (HYP) og drej den dorsale side op for at fortsætte med højre side. Isoler hippocampus (HCr), præfrontal cortex (PFCr), striatum (STRr) og hjernebark (cCTXr). Disseker derefter venstre side. Isoler hippocampus (HCI), præfrontal cortex (PFCl), striatum (STRl) og cerebral cortex (cCTXl). Dissekere cerebellum og thalamic regionen. Brug offentliggjorte anatomiske referencer16,17 til identifikation af hjerneområder.
    5. Overfør hvert dissekeret stykke direkte på en aluminiumsfoliedækket, forkølet metalplade (-80 °C). Tillad frysning og overfør de isolerede hjerneområder i de mærkede forkølede 2 ml rør.
    6. Pulveriser vævsstykkerne ved hjælp af en vævspulverisator (ved -80 °C), så vævet optøes. I kølerummet, alikvot vævspulver i mærkede, forkølede ekstraktionsrør indeholdende keramiske perler eller stålkugler. Til den dobbelte lipidomics / transkriptomikanalyse skal vævspulveret aliquots vejes i det kolde rum. Til lipidomics-only analyse, vælg mellem normalisering til vævsvægt eller proteinindhold. For sidstnævnte skal du gå videre uden vævsvejning.
    7. Skær det perifere organvæv i stykker med en maksimal vægt på 20 mg. Fortsæt med vævspulverisering som i trin 3.1.6.
    8. Fortsæt med ekstraktionen af vævsprøver (se trin 4.1.1, 4.1.3 eller 4.1.5) eller opbevar rør ved -80 °C til senere ekstraktion.
      BEMÆRK: Hjernematrixen kan også bruges, hvis undersøgelsesdesignet tillader det. Metoden er dog mere velegnet til et diskret og begrænset antal hjerneområder, og det er ikke praktisk at dissekere og isolere alle de ovennævnte hjerneområder inden for den fastsatte tidsramme.
  2. Udfør hjernestansning.
    1. Monter de hele, frosne hjerner på monteringssystemet (Table of Materials) i kryostaten. Indstil tykkelsen til 50 μm, og skær den i trim-tilstand tæt på det område, der er af interesse.
    2. Plet hjerneskive (18-20 μm) ved hjælp af toluidinblå (0,1% -1%) som en reference til at lokalisere underregionen af interesse. Undersøg de farvede skiver ved hjælp af et mikroskop for at identificere de områder af interesse, der skal stanses. Brug et museatlas som reference til at finde de relevante anatomiske områder i hjernen16. Tag stans med en diameter på 0,8-1,0 mm ved hjælp af prøvekorere i forkølede rør.
    3. Afvej frosne slag i kølerummet i mærkede, forkølede 2 ml ekstraktionsrør indeholdende keramiske perler eller stålkugler. Brug gule rør til eCB'er og eiCs co-ekstraktion.
    4. Start udsugningen (se trin 4.1.1, 4.1.3 eller 4.1.5), eller opbevar rørene ved -80 °C for yderligere ekstraktion.
  3. Udfør plasmabehandling.
    1. Læg de frosne plasmaprøver på is (4 °C), og lad dem tø op (~20 min.).
    2. Sørg for, at plasmaet er helt frosset, inden ekstraktionen påbegyndes.
    3. Fortsæt med plasmaekstraktionsproceduren (se trin 4.1.2 eller 4.1.4).
      BEMÆRK: Plasmaprøver skal forblive ved -80 °C indtil ekstraktion. Undgå cyklusser med optøning og genfrysning.

4. Procedurer for udvinding

  1. Udfør Liquid-Liquid (LLE) lipid co-ekstraktionsprotokoller.
    1. Udfør co-ekstraktion af eCB'er og eiC'er fra hjernestykker, slag eller vævspulverprøver.
      BEMÆRK: Nøjagtig pipettering er påkrævet under hele proceduren.
      1. Ekstraktionsrørene, der indeholder vævsprøverne og syv stålkugler, anbringes på is (4 °C). Der tilsættes 600 μL iskold MTBE og 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v), der indeholder de interne standarder. Målkoncentrationen af de interne standarder i det endelige analysevolumen (50 μL) er som følger: 1 ng/ml AEA-d4, 125 ng/ml 2-AG-d5, 3 000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/ml 1-AG-d5, 2,5 ng/ml PGF2α-d4 og 5 ng/ml for PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; Henholdsvis 20-HETE-d6 og TXB2-d4.
      2. Tilsæt 400 μL 0,1 M myresyre og homogeniser med en vævslyse (30 s-1 min). Homogenatet centrifugeres i 15 minutter ved 5.000 x g ved 4 °C. Den vandige underfase tillades frysning i 10 minutter ved -80 °C for at lette overførslen af den øvre organiske fase.
      3. Overfør den organiske fase i nye rør. Fordampes under en blid strøm af N2 ved 37 °C og rekonstitueres i 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) til yderligere analyse.
      4. Den vandige fase opbevares ved -20 °C eller -80 °C med henblik på yderligere analyse af proteinindholdet.
    2. Udfør co-ekstraktion af eCB'er og eIC'er fra plasmaprøver.
      1. Optø plasmaalikvoter ved 4 °C. Der tilsættes 800 μL MTBE og 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v), der indeholder de interne standarder (svarende til dem, der anvendes til vævsanalyse, se trin 5.1.1). Optimer den interne standardkoncentration til spiking ved hjælp af referenceplasmaprøver.
      2. Der tilsættes 600 μL 0,1 M myresyre og hvirvelprøver ved 4 °C i 2 min. Centrifugeprøver ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
      3. Overfør den organiske fase til nye rør, fordamp under en blid strøm af N2 ved 37 °C og rekonstituere i 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) til LC/MRM-analyse.
        BEMÆRK: Undgå om muligt opbevaring af tørrede ekstrakter af eIC'er og fortsæt straks til LC/MRM-analyse. Hvis opbevaring ikke kan undgås, skal du ty til kortvarig opbevaring i kun 2-3 dage ved 4 ° C med prøver i LC-injektionsopløsningsmiddel.
    3. Udfør co-ekstraktion af PL'er og eCB'er fra hjerneområder, slag eller andre vævspulverprøver.
      1. Ekstraktionsrørene, der indeholder vævsprøverne og keramiske perler, anbringes på is (4 °C). Tilsæt 800 μL MTBE/MeOH (10:3; v/v) og 10 μL MeOH indeholdende de interne standarder. Målkoncentrationen af de interne standarder i det endelige analysevolumen (100 μL) er som følger: 150 ng/ml for PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/ml PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: henholdsvis 0,1 ng/ml AEA-d4, 60 ng/ml 2-AG-d5, 4.000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d2 og 3 ng/ml PEA- d4.
      2. Der tilsættes 200 μL 0,1 % myresyre indeholdende 25 μM tetrahydrolipstatin/URB597 og 50 μg/ml BHT. Homogeniseres med vævshomogenisatoren (Table of Materials) og centrifugen ved 5.000 x g og 4 °C i 15 min.
      3. Den øvre organiske fase genvindes i nye rør, og fordamp under en blid strøm af N2 ved 37 °C genvindes. Rekonstitueres i 90 μL MeOH og opbevares enten ved -20 °C eller -80 °C, eller fortsæt med næste trin.
      4. Tilsæt 10 % H2O til en alikvot lipidekstrakt (4.1.3.3) og injicer 10 μL i LC/MS til PL-analyse. For yderligere eCB-analyse fortsæt med trin 4.3.5.
      5. Der tages en alikvote af ekstraktet (4.1.3.3), fordampes til tørhed og rekonstitueres i ACN/H2O (1:1; v/v). Brug 20 μL til LC/MS-injektion til eCB-analyse.
    4. Udfør co-ekstraktion af PL'er og eCB'er fra plasmaprøver.
      1. Plasmaallikvoter optøes ved 4 °C, tilsættes 1.000 μL MTBE/methanol (10:3; v/v) og 10 μL MeOH indeholdende interne standarder (analogt med trin 4.1.3) og hvirvel ved 4 °C i 1 min.
      2. Der tilsættes 250 μL H2O og hvirvel i 45 minutter ved 4 °C. Centrifugeprøver i 15 minutter ved 5.000 x g og 4 °C. Den øvre organiske fase genvindes, fordampes under en blid strøm af N2 ved 37 °C og rekonstitueres i 90 μL methanol til yderligere LC/MS-analyse. Opbevares ved -20 °C eller -80 °C, eller fortsæt til næste trin.
      3. Til PL-analyse tilsættes 10% vand til en alikvot lipidekstrakt (4.1.2.2).
      4. Til eCB-analyse tilsættes 10 % vand til en alikvot af lipidekstraktet (se 4.1.4.3), fordampes til tørhed og rekonstitueres i 50 % ACN/H2O (1:1; v/v).
    5. Udfør dobbelt ekstraktion af RNA og lipider (co-ekstraktion af PL'er og eCB'er) fra vævsprøver.
      FORSIGTIG: Sørg for at arbejde under RNA-frie forhold for at undgå RNA-nedbrydning.
      1. Optø vævspulverallikvoter eller hjerneklaser (ved 4 °C), og der tilsættes 600 μL RLT-buffer indeholdende 5 μM THL/URB597, 10 μg/ml BHT og 1 % β-mercaptoethanol (for procentdele af det endelige volumen homogeniseringsbuffer, se trin 4.1) sammen med 200 μL chloroform til ekstraktionsrør indeholdende frosne hjernestanser og keramiske perler.
      2. Spikeprøver med 10 μL intern standardblanding til PL'er og eCB-co-ekstraktion (se trin 4.1.3) og homogeniseres via vævshomogenisator (høj hastighed, 20 s).
      3. Lysater overføres til nye centrifugerør og centrifuger i 5 minutter ved fuld hastighed og 4 °C for at muliggøre faseadskillelse.
      4. Gendan og brug den øvre fase til RNA-ekstraktion ved hjælp af standard RNA-ekstraktionsproceduresæt (Table of Materials). Elute RNA i et samlet volumen på 50 μL RNasefrit vand og opbevares ved -80 °C.
        BEMÆRK: Prøven i trin 4.1.5.4 er egnet til både RNA-sekventering og qPCR ved hjælp af de relevante metoder og instrumentering.
      5. Brug den nedre chloroformholdige fase til lipidekstraktion. Der tilsættes 800 μL MTBE/methanol (10:3; v/v) og 200 μL 0,1 % myresyre og hvirvel i 45 minutter ved 4 °C. Den øvre organiske fase genvindes, og der fordampes under en blid strøm af N2 ved 37 °C.
      6. Rekonstitueres i 90 μL methanol til yderligere LC/MS-analyse. Opbevares ved -20 °C eller -80 °C, eller fortsæt til trin 5.
      7. Tilsæt 10 % H2O til en alikvot lipidekstrakt (se ovenfor trin 4.1.5.6) og injicer 10 μL i LC/MS til PL-analyse. For yderligere eCB-analyse fortsæt med trin 5.7.
      8. En alikvote af ekstraktet (se ovenfor trin 4.1.5.6) fordamper til tørhed og rekonstitueres i ACN/H2O (1:1; v/v). Brug 20 μL til LC/MS-injektion til eCB-analyse (analogt med trin 4.3.5).

5. Kvalitativ og kvantitativ LC/MRM-profilering

  1. Forbered LC-opløsningsmiddelsystemer, kalibreringsopløsninger og kvalitetskontrolprøver.
    1. For PL'er fremstilles mobil fase A: methanol/vand (1:1; v/v) indeholdende 7,5 mM ammoniumformium og 0,1 % TEA. Mobil fase B: methanol/isopropanol (2:8; v/v) til forberedelse, der indeholder 7,5 mM ammoniumformium og 0,1 % TEA. Opbevar opløsningsmidler i LC-flasker.
    2. Til eCB- og eiC-separation fremstilles følgende LC-opløsningsmidler: 0,1 % myresyre som mobil fase A og 100 % ACN indeholdende 0,1 % myresyre som mobil fase B. Opbevar opløsningsmidler i LC-flasker.
    3. Udarbejde kvalitetskontroller ved hjælp af kalibreringsstandarderne og de interne standarder (tabel 3) i en ækvimolær eller brugerdefineret koncentration.
    4. Forbered kalibreringskurver med syv koncentrationspunkter. Brug den samme interne standardbatch til at spike i kalibreringskurveopløsningen og i prøver, der skal analyseres.
  2. Brug LC-MRM-metoden til kvalitativ og kvantitativ lipidprofilering.
    1. Åbn fanen Build Acquisition Method i den kommercielle software (f.eks. Analyst), og vælg LC/MRM-tilstand med polaritetsskift. I metoden fastsættes ionovergangene (som angivet i tabel 3) til kvantitativ profilering. Indstil afregningstiden til 50 ms.
    2. For PLs profilering skal du indstille følgende ionkildeparametre: gardingas = 40 psi; kildevarmertemperatur = 550 °C; ionsprayspænding = -4.500 V i negativ iontilstand og = +5.200 V i positiv iontilstand.
    3. For samanalyse af eCC'er og eiC'er skal du indstille følgende parametre: gardingas = 40 psi; kildevarmertemperatur = 550 °C; ionsprøjtespænding = -4.500 V i negativ iontilstand og = +4.500 V i positiv iontilstand.
    4. Ved PL-analyse indstilles kolonneopvarmningen til 45 °C og strømningshastigheden til 200 μL/min, og følgende gradient indstilles: min 0 = 40 % B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B og min 52 = 40% B. Indstil injektionsvolumen til 10 μL.
    5. For analyse af eCB'er og eiC'er skal kolonnetemperaturen indstilles til stuetemperatur og følgende gradient indstilles: min 0 = 20 % B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Indstil injektionsvolumen til 20 μL.
      BEMÆRK: MRM-betingelserne kan variere mellem instrumentplatforme, hvorfor fragmenterings- og MRM-betingelser skal udledes eksperimentelt, og ioniseringsparametre bør testes og justeres, hvis det er nødvendigt for at opnå maksimal følsomhed og selektivitet.
  3. Udfør batchanalyse.
    1. Åbn Build Acquisition-batchen , og udfyld de nødvendige parametre til eksempelbeskrivelse, placering i autosamplerens eksempelrack og anskaffelsesmetode (angivet som trin 5.2).
    2. Medtag altid kvalitetskontrol i begyndelsen og slutningen af analysen og i batchen. Efter hver 25-30 prøver skal der medtages mindst tre kalibreringskurver i batchen og inkluderes et vasketrin med et valgfrit opløsningsmiddel efter hver kvalitetskontrolprøve, kalibreringskurve og i slutningen af prøvebatchen.
    3. Overfør prøver opnået på trin 4 i LC/MS hætteglas. Anbring prøverne i LC-autosamplerens læssestativer i henhold til den position, der er defineret i batchen, og læg prøveholderen i LC-autosampleren.
    4. Indsend batch- og start køanalyse.
  4. Lipid kvantificering
    1. Brug den kommercielle software (f.eks. Analyst) og det indlejrede kvantificeringsmodul til kvantificering af eCC'er og eiC'er og kommerciel software (f.eks. Multiquant) til Kvantificering af PL'er.
      BEMÆRK: Den anden software kan også bruges til eCC'er og eiC'er, især når der anvendes en intern standard til kvantificering af flere analytter.
    2. Open Build Quantification Method og udfyld parametrene for analytter, interne standarder, MRM-overgange, og tilskriv de interne standarder til de analytter, der skal kvantificeres (tabel 3). Indstil den mindste tophøjde til 500 cps.
    3. Anvende følgende kriterier eller kombinationer heraf til tildeling af lipididentitet og efterfølgende kvantificering6: matchning af lipidendogene analytter med kalibreringsstandarder og/eller deutererede interne standarder, hvis sådanne foreligger; fragmention, der matcher ved positiv og negativ iontilstandsfragmentering for en given m/z lipidanalytter, for hvilke der ikke er fastsat standarder litteraturudledt elueringsadfærd af lipider under tilsvarende anvendte LC-betingelser til at dissekere isomere og / eller isobariske strukturer; og, hvor det er muligt, LC/MS- og MS/MS-analyse med massespektrometri med høj opløsning ved hjælp af lignende LC-betingelser som for målrettet analyse (ved hjælp af LC/MRM) for nøjagtigt at identificere identiteten og elueringsadfærden af endogene lipider af interesse18,19.
    4. Til validering af batchanalyse skal du anvende følgende kriterier: nøjagtighed af kvantificering ≤ ±20%; regressionskoefficient ≥0,97 (ideelt ≥0,99).
      BEMÆRK: Følg retningslinjerne for udvikling og validering af bioanalytiske metoder for at sikre en pålidelig, reproducerbar analyse af målmolekylerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sættet af beskrevne protokoller kan kombineres på forskellige niveauer på en målspecifik måde, f.eks. valg af dyremodel, prøveudtagningsvej, ekstraktionsmetode og profilering (figur 1).

For at bestemme lipidniveauændringer i hjernen og periferien over et tidsforløb af en akut epileptisk anfaldstilstand og for at opklare den potentielle antiepileptiske virkning13 af PEA og dens indvirkning på lipidomændringer i hjerne og periferi blev tre eksperimentelle dyregrupper behandlet med køretøj, KA for at inducere akut epilepsi og PEA som en antiepileptisk lægemiddelkandidat. PEA blev administreret via i.p. før KA-injektionen (f.eks. med en enkelt PEA-injektion til akut behandling og to PEA-injektioner til subkronisk behandling). Med henblik på multipel molekylær analyse og/eller immunohistokemisk farvning 5 dage efter behandlingen blev dyreforsøgene gentaget efter behov (figur 2).

KA-induktion af akutte epileptiske anfald fører til en maksimal anfaldsintensitet 1 time efter injektion15 (figur 3). For at optrævle ændringer i hjernens og perifere lipidniveauer ved tilstanden af maksimale anfaldsintensiteter blev mus ofret 1 time efter KA-injektion efterfulgt af plasma-, hjerne- og perifer organprøveudtagning. Frosne hjerner blev dissekeret i seks hjerneområder (se trin 3.1). Hjerneområder og perifere organer (hjerte og lunge) væv blev pulveriseret for at opnå homogene vævsprøver og efterfølgende aliciteret til de to lipidomiske profilering af eCB'er og eiC'er (figur 4A og trin 4.1.1) og PL'er og eCB'er (figur 4B og trin 4.1.3).

Den dobbelte ekstraktionsprotokol (se trin 4.1.5) blev anvendt til at udføre PL'er / eCB'er og RNA i en højere rumlig opløsning via profilering fra hjernestanser i forskellige regioner: hypothalamus (HYP), basolateral amygdala (BLA) og den ventrale (vHC) og dorsale (dHC) hippocampus (figur 5). Der blev udtaget prøver af punches (se trin 3.2) fra KA-inducerede epileptiske mus og kontrolmus ved den maksimale anfaldstilstand ved 1 time efter KA-injektion (figur 2).

For at vurdere neurodegenerationens omfang og tilskrive lipidændringer til neurodegenerationsomfang med epilepsi og ved ny epilepsibehandling med PEA blev der udført immunohistokemisk dobbeltfarvning på hjernesektioner (se trin 1.3) udtaget 5 dage efter KA-inducerede epileptiske anfald (figur 2) hos mus uden subkronisk ærtebehandling (midten), med subkronisk ærtebehandling (højre) og hos saltvandsinjicerede mus (venstre) (figur 6 ). KA-induceret status epilepticus (SE) forårsagede massivt tab af NeuN-signal, overvejende i CA1-, CA3- og hilus-regionen i hippocampus, ledsaget af apoptotiske hændelser angivet med caspase-3 (CASP3) signal (figur 6, midterste billede) sammenlignet med kontrollen (figur 6, venstre billede). Subkronisk PEA-behandling (højre billede) bevarede især neuronale kerner protein (NeuN) signal, mens (CASP3) signal næppe kan detekteres.

KA- og SAL injektionsopløsning.
KA-injektionsopløsning (8 ml slutvolumen):
1. Afvej 24 mg KA i 15 ml rør (forsigtig: brug glothes og maske)
2. Tilsæt 8 ml saltvand og hvirvel i 10 minutter
3. Opbevares ved 4 ° C for intermdediate opbevaring
4. Istandsættelse til stuetemperatur og hvirvel inden injektion
Køretøj 1 indsprøjtningsopløsning (8 ml slutvolumen):
Spring trin 1 over, og fortsæt med trin 2-4

Tabel 1: Fremstilling af anfaldsfremkaldende lægemiddel og køretøj 1-applikation. Trin til fremstilling af Kainsyre(KA)-injektionsopløsningen til 24 intraperitoneale injektioner (10 ml/kg) i en endelig koncentration på 30 mg/kg og den tilsvarende indsprøjtningsopløsning fra køretøjet (køretøj 1)1.

INJEKTIONSOPLØSNING AF PEA- og SAL/DMSO/Cremophor (18:2:1, (v/v/v)).
ÆRT-injektionsopløsning (8 ml slutvolumen):
1. Afvej 32 mg PEA i 15 ml rør
2. Tilsæt 0,4 ml DMSO og hvirvel i 10 minutter
3. Tilsæt 3,4 ml SAL og hvirvel i 5 minutter
4. Sonikatblanding i 5 minutter ved 36 ° C
5. Tilsæt 0,4 ml cremophor og hvirvel i 5 minutter
6. Sonikat i 1 minut ved 36 ° C og tilsæt 3,4 ml SAL
7. Hvirvel i 30 sek. og sonikat i 3 minutter ved 36 °C
8. Opbevar opløsningen ved 36 °C ved lav hastighed i ryster og hvirvel inden injektion
Køretøj 2-indsprøjtningsopløsning (8 ml slutvolumen):
Spring trin 1 over, og fortsæt med trin 2-8

Tabel 2: Fremstilling af antiepileptisk lægemiddel og køretøj 2-applikation. Eksemplificerede trin til fremstilling af Palmitoylethanolamid (PEA) injektionsopløsning til 24 intraperitoneale injektioner (10 ml/kg) i en endelig koncentration på 40 mg/kg og den tilsvarende køretøjsindsprøjtningsopløsning (køretøj 2)1.

Positiv iontilstand
Udvalgte pl'er for kalibreringsstandarder Tilsvarende interne standarder
Analyt Forløber ion Produkt ion m/z Analyt Forløber ion Produkt ion m/z
Navn m/z Navn m/z
AEA 348.3 62.1 AEA-d4 352.3 66.1
2-AG 379.1 287.2 2-AG-d5 384.2 287.2
OEA 326.2 62.1 OEA-d2 328.2 62.1
ÆRT 300.2 62.1 PEA-d4 304.2 62.1
PC 16:0/18:1 760.59 184.07 PC 17:0/14:1 718.54 184.07
PC 18:2_20:4 806.57 184.07
Pc 18:0_20:4 810.6 184.07
LPC 18:0 524.37 184.07 LPC 17:0 510.36 184.07
LPC 20:4 544.34 184.07
SM d18:1/18:0 731.61 184.07 SM d18:1/12:0 647.51 184.07
Negativ iontilstand
Udvalgte pl'er for kalibreringsstandarder Tilsvarende interne standarder
Analyt Forløber ion m/z Produkt ion m/z Analyt Forløber ion Produkt ion m/z
Navn Navn m/z
AA 303.05 259.1 AA-d8 311.04 267
5(S)-HETE 319.48 115 5(S)-HETE-d8 327.48 116
8(S)-HETE 319.48 155 12(S)-HETE-d8 327.48 184
12(S)-HETE 319.48 179
15(S)-HETE 319.48 219
19(S)-HETE 319.48 231
20-HETE 319.48 289 20-HETE-d6 325.48 295
LxA4 351.5 115.2 LxA4-d5 356.5 115
PGF2 α 353.48 309.2 PGF2 α-d4 357.5 313.3
TxB2 369 169 TxB2-d4 373 173
PGE2 351.47 315.3 PGE2-d9 360.25 324.3
PGD2 351.47 315.3 PGD2-d4 355.25 319.3
11β-PGF2 α 353.24 193
RvD1 375.22 215.1 RvD1-d5 380.22 180.2
PE 16:0/18:1 716.52 281.25 PE 17:0/14:1 674.48 225.19
PE 38:4 766.54 303.23
PE 40:6 790.54 303.23
PE 40:4 794.57 303.23
PA 16:0/18:1 673.48 255.23 PA 17:0/14:1 631.43 269.25
LPA 16:0 409.24 153 LPA 17:0 423.25 153
LPA 20:4 457.24 153
LPI 20:4 619.29 303.23
PG 16:0/18:1 747.52 281.25 PG 17:0/14:1 705.47 225.19
PG 16:1_20:4 767.49 303.23
PG 18:1_20:4 795.52 303.23
PI 16:0/18:1 835.53 281.25 PI 17:0/14:1 793.49 269.25
PS 16:0/18:1 760.51 255.23 PS 17:0/14:1 718.47 269.25
PS 36:4 782.49 303.23
PS 38:4 810.53 303.23
PI 16:0/18:1 835.53 281.25 PI 17:0/14:1 793.49 269.25
PI 36:4 857.52 303.23
PI 38:4 885.55 303.23
C1P d18:1/16:0 616.47 78.9 C1P d18:1/12:0 560.41 78.9
S1P d18:1 378.24 78.9 S1P d17:1 364.23 78.9

Tabel 3: Lipidstandarder og MRM-overgange til målrettet lipidomics-analyse. Tabelindhold blev oprindeligt offentliggjort i Lerner et al.2

Figure 1
Figur 1: Oversigt over arbejdsgangsmodulerne. Afhængigt af undersøgelsens formål og forskellige prøveudtagningsveje kan ekstraktion og profilering kombineres for at muliggøre et signifikant resultat for undersøgelsen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentelt design af akut kainsyre (KA)-induceret epileptisk anfaldsmodel hos mus. Mus behandles enten med 1) saltvand (10 ml/kg i.p.); 2) KA (30 mg/kg i.p.); og/eller 3) (sub) kronisk forbehandlet (1-2x 40 mg/kg i.p.) med den potentielle antiepileptiske forbindelse Palmitoylethanolamid (PEA). Fireogtyve mus pr. Gruppe blev behandlet som ovenfor, og adfærd blev scoret for at evaluere anfaldsintensiteter. Seks mus pr. gruppe blev ofret på hvert af de fire forskellige tidspunkter (T1-T4) for at bestemme lipidniveauændringer over et tidsforløb med akut epileptisk anfaldstilstand i hjernen, perifere organer og plasma. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Adfærdsmæssig scoring over et tidsforløb af akut kainsyre (KA)-induceret epilepsi vs. kontroller. Vurdering af anfaldsintensiteter over et tidsforløb på 180 minutter efter KA-anfaldsinduktion (n = 24) eller saltvandsinjektion (n = 24) givet som gennemsnitlig adfærdsmæssig score. Der blev ikke fundet forskelle mellem køretøj 1 og køretøj 2 injicerede grupper. ANOVA gentagen måling gav signifikante interaktioner mellem målingernes og testgruppernes tidspunkter, hvilket indikerer signifikante virkninger af KA-behandling på adfærdsmæssige scorer. Anfaldsintensiteter hos KA-behandlede mus blev oprindeligt offentliggjort i Post et al.13Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Hjerne- og perifert vævslipidniveauer ved akut epileptisk anfaldstilstand. Lipidniveauændringer præsenteret som middelværdi ± SEM ved maksimal anfaldsintensitet (f.eks. 1 time efter KA-injektion) på tværs af seks hjerneområder (n = 9): hjernebark (cCTX), striatum (STR), thalaminregion (THL), hippocampus (HC), hypothalamus (HYP), cerebellum (CER) samt hjerte- og lungevæv i KA-inducerede epileptiske mus (øvre værdi) og kontroller (lavere værdi). De basale lipidniveauer i væv er afbildet i gråt. Værdierne for PL'er, 2-AG og AA er angivet i nmol/g. og værdierne for henholdsvis NAE'er, eiC'er og AEA i pmol/g. Alle lipidniveauer normaliseres til vævsvægten. For at fremhæve de specifikke molekylære ændringer er lipidniveauerne hos de KA-behandlede mus repræsenteret som procentdel af det saltvandsinjicerede (KA/sal) i et varmekort, der viser nedsatte værdier ved akut anfaldsintensitet sammenlignet med kontrollen, er afbildet i henholdsvis lyseblå, og de øgede niveauer sammenlignet med kontrol i rødt. De betragtes som signifikante ved en p-værdi <0,05. Disse data blev oprindeligt offentliggjort i Lerner et al.2Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Dobbelt ekstraktion af eCB'er/PL'er og RNA til kvantitativ profilering fra musehjerneslag. A) Kvantitativ fordeling af udvalgte PL'er og eCB'er på tværs af: 1) en subregion af hypothalamus (HYP) 2) den basolaterale amygdala (BLA); og 3) de ventrale (vHC) og dorsale (dHC) subregioner i hippocampus, fra de KA-inducerede epileptiske anfaldsmus (øvre værdi) versus kontrollerne (lavere værdi) (n = 10). Niveauerne normaliseres til vævsvægten (slag svarer til ca. 0,5-1,5 mg) og udtrykkes i nmol/g. Kun AEA udtrykkes i pmol/g. Lipidniveauerne præsenteres som middelværdi ± SEM. Gennemsnitlig variation pr. Stanset hjerneregion (SEM i procent af middelværdien, i gennemsnit over alle lipider) er: HYP = 7,83%; BLA = 7,80%; vHC = 6,28%; og dHC = henholdsvis 7,90%. (B) Relative ekspressionsniveauer af endogene enzymer og receptorer involveret i lipidsignalering samt markører for hjerneaktivitet undersøgt på mRNA-niveau i forskellige hjerneområder/subregioner fra mus, der udsættes for KA-induceret epileptisk anfald (rødt) og kontroller (lysegrå). Statistiske analyser af forskellen mellem gruppemidler blev udført ved hjælp af den to-halede uparrede student's t-test og betragtet som signifikant ved en p-værdi <0,05 (n = 10). Disse data blev oprindeligt offentliggjort i Lerner et al.7Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Immunohistokemisk NeuN og CASP3 dobbelt plet. Fem dage efter KA-injektion blev immunhistokemi udført på hjernesektioner fra ubehandlede saltvandsinjicerede mus (venstre), subkronisk PEA-forbehandlede mus (midten) og epileptiske mus uden forbehandling (højre). PEA forbehandling viser neuroprotektive virkninger i forhold til ubehandlede epileptiske mus (n = 3). Disse data blev oprindeligt offentliggjort i Post et. al.13Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den neurolipidomiske og transkriptomiske metode, der er beskrevet her, er et levedygtigt middel til at undersøge enhver sygdom eller sund udvikling ved høj og lav rumlig opløsning i hjernen og perifere organer. På grund af de optimerede plasmaprøveudtagnings- og håndteringsprocedurer kan plasmalipidomisk analyse også udføres fra de samme dyr, der ofres for vævlipidomik og transkriptomik, hvilket forbedrer pålideligheden af vævsblodmolekylære korrelater og biomarkøropdagelse. Tilvejebringelsen af et bredt datasæt ved anvendelse af en af de tre protokoller eller kombinationer heraf er af værdi for at undersøge ikke kun en neurologisk sygdom inden for en sammenhæng (dyremodelforsøg), men også på tværs af og mellem eksperimentelle modelsammenhænge. Desuden letter et højt niveau af standardisering af prøveudtagning, behandling og molekylær analyse høj reproducerbarhed af molekylære data og henviser dermed pålideligt til molekylære ændringer mellem og inden for undersøgelser og laboratorier.

For at opnå dette er opsætningen af et eksperimentelt design, der giver det maksimale udlæsningspotentiale for det definerede undersøgelsesmål, imidlertid kritisk. For at opnå en pålidelig sammenligning af de molekylære ændringer mellem forsøgsgrupper anbefales det at anvende mindst ti dyr til at kompensere for dyrs variabilitet og det biologiske interval af lipidniveauer. Når indkøb af dyr og/eller logistik i forbindelse med håndtering af dyr er restriktiv, er det bydende nødvendigt at anvende mindst seks dyr pr. gruppe for at sikre en sikker statistisk analyse. Gruppestørrelsesberegninger skal kompensere for modelrelaterede dødelighedsrater (dvs. der kræves mindst seks, ideelt set ti, dyr pr. Gruppe til undersøgelsen på trods af modellens mulige dødelighed). En kritisk forudsætning er at sikre alders-, køns- og stammematchede dyr pr. forsøgsgruppe. I opdagelsesfasen er det vigtigt at anvende den samme leverandør til forsøgsdyr til alle undersøgelser og den samme dyrebatch, hvis det er muligt, for at undgå bias af resultaterne på grund af mulige adfærdsmæssige og molekylære fænotypeforskelle mellem dyrepartier. For at sikre pålidelighed og reproducerbarhed af den molekylære og adfærdsmæssige fænotype, der er bestemt i undersøgelserne, er det afgørende at udføre en biologisk replikatanalyse, når det er muligt.

Et andet afgørende skridt er at etablere et standardiseret, planlagt forsøgsarbejde med dyregrupper. Det er bydende nødvendigt at behandle dyrene inden for samme tidsvindue på dagen for at omgå døgnrytmens molekylære variabilitet. Tidspunktet på dagen bør fastsættes i overensstemmelse med døgnrytmens kendte indvirkning på syntesen og nedbrydningen af målmolekylerne eller holdes konsistent for alle forsøgsgrupper, når der ikke foreligger oplysninger om døgnrytmeeffekter. Tilsvarende skal opstaldnings- og fodringsforholdene forud for ofring af dyr opretholdes konsistente og strengt kontrollerede på tværs af forsøgsmodeller. Dette er især relevant for lipidomisk profilering på grund af ernæringens indflydelse på lipidplasma og vævsmetabolisme. Administration af terapeutiske eller sygdomsfremkaldende lægemidler bør altid ske parallelt med køretøjets administration i kontrolgrupper, hvorved køretøjet skal være det samme som det, der anvendes til lægemiddeladministration. For at vælge den bedst egnede gnaverstamme og/eller underspændinger med henblik på undersøgelsen bør de lægemiddelbaserede behandlingsstrategier udføres i overensstemmelse med lægemidlets specificitet med hensyn til administrationstid og -hyppighed, doser og administrationsvej samt den specifikke modtagelighed for lægemidler af forskellige stammer udledt af litteratur og/eller tidligere erfaringer. En tidsforløbsundersøgelse af en sygdom og respons på terapi, der involverer store kohortegrupper eller flere dyregrupper, er umulig at udføre på en dag med hensyn til behandling, ofring og prøveudtagning. I sådanne tilfælde skal forarbejdning af dyregrupper planlægges og udføres i på hinanden følgende dage, men opretholdes de samme betingelser med hensyn til tidspunkt på dagen, eksperimentelt design, behandlingstid, forskere osv. Forberedelsen af kemiske injektioner er et andet kritisk trin. Lægemiddel- eller sygdomsfremkaldende forbindelser skal være frisklavet inden administration og i henhold til lægemiddelspecifikationer. Anvendelsen af det samme produktionsparti af lægemidlet anbefales til alle kohorter, der skal sammenlignes. Dette er især vigtigt i tilfælde af naturlige sammensatte formuleringer såsom kainsyre (KA), der anvendes i denne undersøgelse til epilepsiinduktion.

For at muliggøre pålidelig lipidomisk og eller transkriptomisk profilering skal dyreofferproceduren udføres konsekvent på tværs af dyregrupperne inden for en tidsramme på 5 minutter. Hvis blod opsamles efter halshugning, er det vigtigt at opretholde en konstant mængde isofluran i glaskammeret. Til dette formål suges ofte (efter fem anvendelser) med isofluran og må ikke overstige 10 s i anæstesiens varighed ved hjælp af isofluran for at undgå udbrud af arytmi og hjertebanken og sikre korrekt blodtryk til plasmaprøveudtagning.

Betingelserne for prøveudtagning og håndtering af biologisk materiale (f.eks. tidsvinduet og rækkefølgen af prøveudtagning og håndtering af biologisk materiale) skal følges nøje og opretholdes ens for alle grupper. For at undgå variable grader af vævsoptøning og dermed inkonsekvente ex vivo-vævsændringer af lipid- og/eller mRNA-niveauer er det vigtigt at opretholde strengt kontrollerede tids- og temperaturforhold for efterprøveudtagning
oplagring. vævsdissektion eller stansning og efterfølgende prøvebehandling og analyse (se punkt 3 og 4). Friskprøvede hele hjerner kan straks dissekeres på en forkølet metalplade (4 °C) uden forudgående snapfreezing, hvis størrelsen af forsøgsdyregrupperne gør det muligt at ofre dyr, fjerne og dissektionere uden at ændre den tidsramme, der er angivet her for hver af disse procedurer. Hvis størrelsen af eksperimentelle grupper ikke er praktisk til disse procedurer, anbefales snapfrysning af hjernen og efterfølgende dissektion for at give sammenlignelig og kontrolleret behandlingstid. Når man nøje fulgte de protokoller og tidslinjeretningslinjer, der er angivet her, blev der ikke observeret uoverensstemmelser mellem molekylære niveauer opnået ved ekstraktion af nyligt dissekerede hjerneområder og hjerneområder dissekeret fra frosne hjerner.

Et kritisk aspekt for at opnå reproducerbar og minimal variabilitet af lipidniveauerne inden for og mellem grupper, bortset fra prøvebehandlingen under strengt kontrollerede temperaturforhold, er tilvejebringelsen af antioxidanter (se afsnit 2 og 3). Det er af afgørende betydning at undgå stressfaktorer (f.eks. lugten af blod) hos dyrene, inden de ofrer, da mange lipider, der er involveret i neuronal aktivitet, såsom eCB'er, hurtigt kan ændre sig som reaktion på stress.

Til lipidekstraktion og analyse er det vigtigt at forberede de interne standarder, kalibreringsopløsninger og ekstraktionsmidler frisk på ekstraktionsdagen. Den samme kilde til interne standarder skal anvendes til både forberedelse af kalibreringskurver og til prøveekstraktioner. At følge strengt kontrollerede temperaturforhold for prøveekstraktion, opbevaring og analyse er også afgørende for at minimere og kontrollere ex vivo enzymatiske eller kemiske ændringer af molekyler. Til LC / MRM-analyse kan sættet af målrettede lipider skræddersys til undersøgelsesmålet ved at tilføje eller fjerne mål og tilsvarende interne standarder og calibrants, forudsat at adskillelses-, detektions- og MRM-overgangene for et nyt sæt lipider optimeres. De fremlagte ekstraktionsprotokoller gør det muligt at tilvejebringe to LC/MRM-replikater til eCC'er og eiC'er, hvilket er medvirkende til tilfælde af teknisk svigt, eller når replikatanalyse er af betydning for undersøgelsen. PL-ekstraktionsprotokoller gør prøve-/ekstraktionsmængder egnede til mindst 10 analyser pr. ekstrakt (f.eks. flere scanningseksperimenter baseret på henholdsvis prækursorion og neutral tabsscanning2, yderligere LC/MRM-analyser eller LC/MRM-replikater for at kompensere for teknisk fejl under en kørsel). Lipidanalysen er ikke begrænset til LC / MRM; faktisk er lipidekstrakterne opnået med en hvilken som helst af disse protokoller modtagelige for ikke-targtet, avanceret massespektrometrianalyse. Bortset fra hjernestans eller lille mængde væv opnået fra diskrete områder (mindre end 3 mg) kan frosset pulveriseret væv i områder større end 2-3 mg aliciteres og anvendes til flere ekstraktionsmoduler som beskrevet her til replikatanalyse og/eller til andre undersøgelser, der kan anvendes i vævspulver.

En generel fordel ved de protokoller, der er beskrevet her sammenlignet med almindeligt anvendte, er den øgede samlede tidseffektivitet og følsomhed for multikomponentekstraktion og analyse ved reducerede udgifter til animalske ressourcer, forbrugsstoffer og analyseomkostninger. Det er vigtigt, at den dobbelte lipid / mRNA-ekstraktionsprotokol også giver en højere effektivitet af mRNA-ekstraktion20,21 og integritet af mRNA'et sammenlignet med tilsvarende tilgængelige standardprotokoller og samtidig øget effektivitet af lipidekstraktionen7. Dette skyldes sandsynligvis også den nedsatte matrixeffekt for hver af lipid- og mRNA-fraktionerne, når de ekstraheres dobbelt. På grund af dette er metoden let anvendelig til profilering med høj rumlig opløsning, såsom i hjernestanser.

En nuværende begrænsning af protokollen er imidlertid, at de inflammatoriske lipider ikke er modtagelige for analyse og kvantificering ved anvendelse af dual lipid / mRNA-ekstraktionen. Protokollen er således genstand for yderligere forfining. Til dette formål kan vævs- og plasmainflammatoriske lipider og endocannabinoider co-ekstraheres og co-analyseres, hvilket er et optimeret værktøj til samtidig at undersøge neuroinflammatoriske processer og endocannabinoidmoduleret neuronal aktivitet (se coextraktion af eiC'er og eCC'er). Inddragelse af fosfolipider i sidstnævnte assay forventes at være mulig.

I lyset af de potentielle multi-omiske tilgange til neurologiske sygdomme forventes den proteomiske analyse af proteinfraktioner opnået efter lipidekstraktionsprotokollen (dvs. co-ekstraktion af eCC'er og eiC'er samt samekstraktion af PL'er og eCC'er) at være mulig. Dette er dog endnu ikke muligt, når man bruger dual lipid / mRNA-protokollen. For sidstnævnte udelukker ekstraktionens kemiske miljø selv bestemmelse af proteinmængden ved hjælp af standardproteinassays såsom bicinchoninsyreassay (BCA). Der er planlagt yderligere udviklinger for at overvinde denne begrænsning og fremskynde medtagelsen af proteomisk profilering i disse protokoller.

Ved hjælp af den modulære protokol, der er beskrevet her, var det muligt at opnå et hjerneregionalt kort over eiC'er, eCC'er og PL'er i en dyremodel for akutte epileptiske anfald (figur 4). Protokollen viste hippocampal modulering af inflammatoriske processer ved eIC'er og neuronal aktivitetsmodulering af eCC'er hos behandlede og ubehandlede mus med KA-inducerede akutte anfald13. Subregional hjernelokalisering af phospholipid, endocannabinoid og mRNA-ændringer ved henholdsvis akutte epileptiske anfaldstilstande blev også observeret (figur 5). Disse resultater fremhæver værdien og anvendeligheden af de metoder, der er beskrevet her for at fremme viden om et bredt spektrum af lipider, der er involveret i modulering af komplekse neurologiske sygdomme som epilepsi i hjerneområder og subregioner. Disse protokoller er af generel anvendelighed i neurologisk sygdomsundersøgelse og videre, mens videreudvikling af protokoller og applikationer til cellepopulationer fortsætter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi dedikerer denne artikel til Dr. Ermelinda Lomazzo. Under færdiggørelsen af dette manuskript døde Dr. Ermelinda Lomazzo. Hun er legemliggørelsen af lidenskab for videnskab og uselvisk engagement i teamwork for at opfylde et meningsfuldt forskningsformål. Hun har altid drømt om at bidrage meningsfuldt til menneskers større trivsel. Hendes godhjertede natur blev aldrig kompromitteret af videnskabens og livets anstrengende veje. Hun vil forblive uvurderlig og for evigt i vores hjerter.

Julia M. Post blev finansieret af Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) ved University Medical Center ved Johannes Gutenberg University Mainz og er i øjeblikket finansieret af SPP-2225 EXIT-projektet til LB. Raissa Lerner blev delvist finansieret af DZHK-projekt 81X2600250 til LB og Lipidomics Core Facility. Delvis finansiering til disse undersøgelser blev ydet af Lipidomics Core Facility, Institut for Fysiologisk Kemi og Intramurale midler (til LB) fra University Medical Center ved Johannes Gutenberg University Mainz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12(S)-HETE Biomol Cay10007248-25 Lipid Std
12(S)-HETE-d8 Biomol Cay334570-25 Lipid Std
1200 series LC System Agilent Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer Agilent Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8 Biomol Cay 334230 Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler Applied Biosystems Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes Eppendorf Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software AB SCIEX, Darmstadt Software
Analytical balance Mettler Toledo Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard Biomol Cay-10007277 Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) Instrumentation/Sample prep.
Bino Zeiss Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody Cellsignaling 9661S Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S Leica Biosystems Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler CTC Analytics AG Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 FST 11271-30 Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) FST 11252-00 Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen Kabe Labortechnik 078001 Sample Prep.
EP-1 EconoPump BioRAD 700BR07757 Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish FST 11412-11 Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp FST 14094-11 Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight FST 14568-09 Surgical Tools
Iris Spatulae FST 10094-13 Surgical Tools
Kainic acid Abcam ab120100 Epileptic drug
Lipid View software AB SCIEX, Darmstadt Software
LPC 17:0 Avanis Polaris 855676P Lipid Std
LPC 18:0 Avanis Polaris 855775P Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column Phenomenex 00D-4446-B0 Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp Maul GmbH Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
Motic Camara Motic Microscopy
MTBE Honeywell 34875-1L Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package AB SCIEX, Darmstadt Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Scientific Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1 Avanis Polaris 840857P Lipid Std
PA 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1404 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide Biomol Cay90350-100 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5 Biomol Cay9000573-5 Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1004 Lipid Std
PE 16:0-18:1 Avanis Polaris 850757P Lipid Std
PE 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1104 Lipid Std
PG 16:0-18:1 Avanis Polaris 840457P Lipid Std
PG 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1204 Lipid Std
PI 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1504 Lipid Std
Precelleys 24 Peqlab Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen Peqlab 91-pcs-ck14p Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm Peqlab 91-PCS-MK28P Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm VWR 91-PCS-CK14 Sample Prep.
Prostaglandin D2 Biomol Cay 12010 Lipid Std
Prostaglandin D2-d4 Biomol Cay 312010 Lipid Std
Prostaglandin E2 Biomol Cay10007211-1 Lipid Std
Prostaglandin E2-d9 Biomol Cay10581-50 Lipid Std
PS 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1304 Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS AB SCIEX AU111609004 Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System Appliert Biosystem Instrumentation/qPCR
Resolvin D1 Biomol Cay10012554-11 Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254 Sample Prep.
Security Guard precolumn Phenomenex Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates Thermo Fisher 72110017 Microscopy
Shandon slide rack and lid Thermo Fisher 73310017 Microscopy
SM 18:0 Avanis Polaris 860586P Lipid Std
SM d18:1/12:0 Avanis Polaris LM-2312 Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth FST 11016-17 Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern FST 14130-17 Surgical Tools
T3000 Thermocycler Biometra Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2 Biomol Cay19030-5 Lipid Std
Thromboxane B2-d4 Biomol Cay319030-25 Lipid Std
Tissue Lyser II Qiagen/ Retsch 12120240804 Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek Sakura Finetek 4583 Microscopy
Toluidinblau Roth 0300.2 Microscopy
Vapotherm Barkey 4004734 Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv VWR 9814920 Solvent/LCMS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
  2. Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
  3. Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  4. Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
  5. Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
  6. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
  7. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
  8. Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
  9. Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. Microglia-Neuron Communication in Epilepsy. Glia. 65 (1), 5-18 (2017).
  10. Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
  11. Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
  12. Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
  13. Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
  14. Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
  15. Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
  16. Konsman, J. P. The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
  17. Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).
  18. Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
  19. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  20. Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
  21. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).

Tags

Neurovidenskab udgave 181 lipidomics transkriptomik hjerneområder dyremodeller af neurologiske sygdomme hjernens høje rumlige opløsning kvantitativ lipidomik
Lipidomics og transcriptomics i neurologiske sygdomme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Post, J. M., Lerner, R., Schwitter,… More

Post, J. M., Lerner, R., Schwitter, C., Lutz, B., Lomazzo, E., Bindila, L. Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (181), e59423, doi:10.3791/59423 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter