Summary
Dieser Artikel stellt ein modulares Protokoll für Gewebelipidomik und Transkriptomik sowie Plasmalipidomik in Mausmodellen für neurologische Erkrankungen vor, die auf Lipide abzielen, die Entzündungen und neuronaler Aktivität zugrunde liegen, Membranlipide, nachgeschaltete Botenstoffe und mRNA-kodierende Enzyme / Rezeptoren, die der Lipidfunktion zugrunde liegen. Probenahme-, Probenverarbeitungs-, Extraktions- und Quantifizierungsverfahren werden beschrieben.
Abstract
Lipide dienen als primäre Schnittstelle zu Hirnverletzungen oder Reizen, die neurologischen Erkrankungen förderlich sind, und sind ein Reservoir für die Synthese von Lipiden mit verschiedenen Signal- oder Ligandenfunktionen, die den Beginn und das Fortschreiten von Krankheiten unterstreichen können. Lipide, die sich oft auf präsymptomatischer Ebene verändern, sind eine aufstrebende Quelle für Wirkstoffziele und Biomarker. Viele neurologische Erkrankungen weisen Neuroinflammation, Neurodegeneration und neuronale Erregbarkeit als häufige Kennzeichen auf, die teilweise durch spezifische Lipidsignalsysteme moduliert werden. Die Interdependenz und Wechselbeziehung der Synthese verschiedener Lipide führt zu einer Multilipid-, Multienzym- und Multirezeptoranalyse, um die Gemeinsamkeiten und Besonderheiten neurologischer Kontexte abzuleiten und die Entschlüsselung mechanistischer Aspekte des Krankheitsbeginns und -verlaufs zu beschleunigen. Die Zuschreibung von Lipidrollen an verschiedene Hirnregionen fördert die Bestimmung des molekularen Lipidphänotyps und der Morphologie im Zusammenhang mit einer neurologischen Erkrankung.
Hier wird ein modulares Protokoll vorgestellt, das für die Analyse von Membranlipiden und nachgeschalteten Lipidsignalen zusammen mit mRNA von Enzymen und Mediatoren, die ihrer Funktionalität zugrunde liegen, aus diskreten Hirnregionen extrahiert wird, die für eine bestimmte neurologische Erkrankung und / oder Erkrankung relevant sind. Um ein genaues vergleichendes lipidomisches Profiling zu gewährleisten, wurden die Arbeitsabläufe und Betriebskriterien optimiert und standardisiert für: i) Gehirnprobenahme und Dissektion von Regionen von Interesse, ii) Co-Extraktion mehrerer Lipidsignale und Membranlipide, iii) duale Lipid/mRNA-Extraktion, iv) Quantifizierung durch Flüssigkeitschromatographie Multiple Reaction Monitoring (LC/MRM) und v) Standard-mRNA-Profiling. Dieser Workflow ist für die geringen Gewebemengen geeignet, die durch die Probenahme der funktionell diskreten Hirnunterregionen (d.h. durch Hirnstanzen) erhalten werden, wodurch Verzerrungen in der multimolekularen Analyse aufgrund von Gewebeheterogenität und/oder Tiervariabilität verhindert werden. Um periphere Konsequenzen neurologischer Erkrankungen aufzudecken und translationale molekulare Auslesungen neurologischer Krankheitszustände zu etablieren, werden auch periphere Organentnahmen, -verarbeitungen und deren anschließende lipidomische Analyse sowie Plasmalipidomik verfolgt und beschrieben. Das Protokoll wird an einem Mausmodell für akute Epilepsie demonstriert.
Introduction
Jüngste Fortschritte in der Funktion von Lipiden und ihrer Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten neurologischer Erkrankungen eröffnen neue Forschungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für neue therapeutische Ziele und die Aufklärung von Krankheitsmechanismen1. Dokumentierte Unterschiede in der Lipidzusammensetzung in verschiedenen Hirnregionen, die durch moderne molekulare Bildgebungsverfahren wie Massenspektrometrie-Bildgebung und fortschrittliche Massenspektrometrie-Profilierung betont werden, verschieben das Paradigma der Lipiduntersuchung vom gesamten Gehirn hin zu funktionell unterschiedlichen und diskreten Hirnregionen. Die Tatsache, dass die Lipidzusammensetzung in verschiedenen Gehirnregionen variiert, führt zu einer neuen Konzeptualisierung sowohl der Membranlipidempfindlichkeit als auch der nachgeschalteten Lipidsignalisierung als Reaktion auf eine Hirnverletzung oder -reize in den funktionell unterschiedlichen Hirnregionen. Daher erfordern Lipidprotokolle neue Entwicklungen, um die Herausforderung niedriger Gewebemengen für die Erkennung und Quantifizierung mit höherer räumlicher Auflösung und gleichzeitig die Analyse mehrerer Lipidkomponenten von Zellmembranen und Signalwegen zu bewältigen. Auch die Bestimmung von Enzymen, Lipidliganden und Rezeptoren, die an der Regulation ihrer Spiegel und Funktion beteiligt sind, ist von größter Bedeutung, um die bei einer neurologischen Erkrankung betroffenen Signalwege aufzuklären und neue mechanistische Untersuchungen in einem pathophysiologischen Kontext zu leiten.
Neben der erhöhten räumlichen Auflösung des Gehirns gibt es zwei große Schwierigkeiten, die die Entwicklung neuer neurolipidomischer Ansätze herausfordern. Erstens sind die Lipidsignalmoleküle im Vergleich zu membrankonstitutiven Lipiden typischerweise von sehr geringer Häufigkeit. Zweitens weist das Lipidom eine hohe strukturelle Heterogenität auf, die mit einem einzigen analytischen Ansatz schwer zu sezieren ist. Daher sind Extraktions- und Analysemethoden auf verschiedene Lipidkategorien zugeschnitten und werden üblicherweise in verschiedenen Gewebeproben durchgeführt.2. Shotgun lipidomische Methoden3 sind ausgezeichnete Werkzeuge, um schnell ein breites Profil von Membranlipiden aufzudecken, während eine erhöhte Empfindlichkeit und Selektivität, die durch die gezielte Entdeckung und Quantifizierung von massenspektrometrischen Methoden ermöglicht wird, für die Untersuchung von Signallipiden mit geringer Häufigkeit genutzt werden, darunter: i) Entzündungslipide und ii) Lipide, die an der Modulation der neuronalen Aktivität beteiligt sind, wie Endocannabinoide (eCBs), Aminosäure-verknüpfte Lipide, etc.4,5. Um Lipidveränderungen sowohl auf Zellmembran- als auch auf Signalebene zu erfassen, die in Gehirnregionen neurologischer Krankheitsmodelle auftreten, werden die Lipidextraktion und -analyse typischerweise in verschiedenen Gewebeproben durchgeführt, die aus verschiedenen Tierchargen oder aus verschiedenen Hemisphären gewonnen werden, oder indem eine größere Geweberegion in mehrere Stücke zerlegt wird. Wenn auch die mRNA-Spiegel von Enzymrezeptoren von Interesse sind, erfordert ihre Untersuchung typischerweise die Beschaffung einer eindeutigen Gewebeprobe. Zum Beispiel würde die Untersuchung von Membranlipiden, endogenen Cannabinoiden und mRNA drei verschiedene Gewebeproben erfordern (z. B. zwei Proben für die beiden Lipidextraktionsmethoden - Membranlipide und Signallipide - und anschließend zwei Lipidanalysemethoden - und eine Probe für die mRNA-Analyse). Die Untersuchung von Entzündungslipiden und endogenen Cannabinoiden erfordert zwei verschiedene Gewebeproben, Extraktionsmethoden bzw. Analysemethoden. Ein weiteres Beispiel ist die Untersuchung von mRNA und jeder Lipidkategorie in einer Gehirnstanz- oder Laser-Mikrodissektionsprobe, die folglich zwei verschiedene Tiere benötigt, um zwei Proben pro Gehirn(sub)region zu beschaffen. In solchen Fällen tritt häufig ein erhebliches Maß an Variabilität und/oder schlechter Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auf, das auf biologische Variabilität und/oder Gewebeheterogenität zurückzuführen ist. Geleitet von diesen praktischen Einschränkungen der multimolekularen Analyse, die insbesondere bei hoher räumlicher Auflösung im Gehirn auftritt, wurde ein dreimoduliges Neurolipidomik-Protokoll entwickelt, das Folgendes umfasst: 1) Koextraktion und Co-Analyse durch LC / MRM von entzündlichen Lipiden (z. B. Eicosanoide (EiCs)) und Lipiden, die an der Modulation der neuronalen Aktivität beteiligt sind, wie z. B. eCBs2; 2) Co-Extraktion von Phospholipiden (PLs) und eCBs mit anschließender Multiscan LC/MRM und Precursor/Neutral Loss Scan Analyse2; und 3) duale Extraktion von Membran(phospho)lipiden und eCBs sowie mRNA, mit anschließender LC/MRM- und qPCR- oder RNA-Sequenzierungsanalyse6. Abhängig von der biologischen Fragestellung, die bei einer neurologischen Erkrankung behandelt werden soll, und der interessierenden Hirnregion kann eine Kombination aus dem ersten und dem zweiten Protokoll oder dem ersten und dritten Protokoll auf dieselbe Gewebeprobe für Gewebe mit einem Gewicht von etwa 4 mg angewendet werden. Das erste und dritte Protokoll können unabhängig voneinander für Gewebe um 2 mg angewendet werden. Das zweite Protokoll kann für Gewebe mit einem Gewicht von nur 0,5 mg angewendet werden. Unabhängig vom gewählten neurolipidomischen Protokollmodul sind die Gewebeentnahme und präanalytische Verarbeitung, die Hirnisolation und Regionsektion sowie das Verfahren zur Opferung des Tiermodells für alle drei Module des Protokolls standardisiert und identisch. Bei unserer Untersuchung neurologischer Erkrankungen werden mit diesen modularen Protokollen immer auch periphere Organe, die für die pathologischen Folgen der Erkrankung relevant sind, gesammelt und analysiert. Darüber hinaus wird regelmäßig Blut für die Plasmalipidomik entnommen, um als Auslesewerkzeug für neurologische Erkrankungen mit Blick auf prospektive translationale Anwendungen zu dienen. Das hier vorgestellte modulare Lipidomik-Protokoll ist sehr vielseitig: skalierbar auf größere Gewebemengen und leicht anwendbar für praktisch jeden Gewebetyp und jede Krankheit. Für die Anwendung des modularen Protokolls (Abbildung 1) bei neurologischen Erkrankungen ist jedes standardisierte Nagetiermodell für den Beginn und das Fortschreiten neurologischer Störungen wie Schädel-Hirn-Trauma, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit oder Epilepsie zugänglich.
Diese Protokolle wurden umfassend angewendet, um Veränderungen des Gewebelipidoms und/oder Transkriptoms in der akuten Phase der Epilepsie im Kainsäure (KA)-induzierten Mausmodell der Epilepsie zu untersuchen2,7, einem Modell, das in präklinischen Studien aufgrund der Ähnlichkeit mit der menschlichen Temporallappenepilepsie (TLE) häufig verwendet wird 8,9,10,11. Unter Verwendung dieser Protokolle wurde das therapeutische Potenzial von Arzneimitteln wie Palmitoylethanolamid (PEA)12,13 im selben Mausmodell für Epilepsie untersucht. Die Studie identifizierte Lipid- und mRNA-Veränderungen mit hoher und niedriger räumlicher Auflösung im Gehirn und in der Peripherie, zum Zeitpunkt der maximalen akuten Anfallsintensitäten (bei 60 Minuten posteizürischer Induktion) und bei subchronischer und akuter Behandlung mit PEA zu vier verschiedenen Zeitpunkten (20, 60, 120 und 180 min) nach der KA-Anfallsinduktion, einem Zeitfenster, das die akute Phase der Epilepsie abdeckt. Plasma, Gehirne und periphere Organe von unbehandelten KA-injizierten Mäusen, akuten und subchron PEA-behandelten Mäusen sowie Vehikel- und PEA-Vehikel-Kontrollmäusen wurden zu jedem Zeitpunkt gesammelt12,13 und mit dieser molekularen Analyse untersucht. Die molekularen Daten korrelierten mit Verhaltensphänotypen, die durch Anfallsbewertung erhalten wurden, sowie mit immunhistochemisch abgeleiteten Daten zu neurodegenerativen Prozessen, um das Fortschreiten der akuten Epilepsiephase und das Potenzial von PEA, sie zu lindern, zu entschlüsseln.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Versuchsverfahren entsprechen der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft vom 22. September 2010 (2010/63EU) und wurden vom örtlichen Tierausschuss des Landes Rheinland-Pfalz genehmigt (Aktenzeichen: 23 177-07/G16-1-075).
1. Tiermodell der akuten und prophylaktisch behandelten KA-induzierten Epilepsie
- Führen Sie Anfallsinduktion, Behandlung und Verhaltensbewertung durch.
- Getrennte Mäuse (mindestens n = 6 Mäuse pro Gruppe) in Einzelkäfigen.
- Herstellung einer Anfallsinduktionsinjektionslösung und des entsprechenden Vehikels (siehe Tabelle 1) sowie der Behandlungsinjektionslösung und des entsprechenden Vehikels (siehe Tabelle 2).
- Injizieren Sie Mäuse intraperitoneal (i.p.) (10 ml/kg Mauskörpermasse) ohne Anästhesie entsprechend ihrer Gruppenidentität: Krankheit, behandelt oder vehikelbehandelt (d. h. KA, PEA-behandelte KA und die beiden Vehikelgruppen). Siehe Abbildung 2, Tabelle 1 und Tabelle 2.
- Überwachen und bewerten Sie das Verhalten gemäß der folgenden standardisierten Anfallsintensitätsskala: 0 = keine Reaktion; 1 = Unbeweglichkeit und Starren; 2 = Vorderglied und/oder Schwanzstreckung, starre Haltung; 3 = sich wiederholende Bewegungen, Kopfwippen; 4 = Aufzucht und Sturz; 5 = kontinuierliches Aufziehen und Fallen; 6 = schwere klonisch-tonische Anfälle; 7 = Tod14,15 (Abbildung 3).
- Führen Sie ein Opferverfahren für die lipidomische und transkriptomische Analyse durch.
- Zu vier Zeitpunkten (d. h. 20, 60, 120 bzw. 180 minuten nach der KA- bzw. Fahrzeugeinjektion) werden sechs Mäuse aus jeder der folgenden Gruppen geopfert: PEA-behandeltes, PEA-unbehandeltes epileptisches Vehikel 1 und Vehikel 2 gemäß den von der IACUC genehmigten Protokollen.
- Zehn Sekunden nach Erreichen jedes Zeitpunkts betäuben Sie die Mäuse mit einem isoflurangetränkten Gewebe in einer Glaskammer. Bestätigen Sie die Anästhesie durch den Verlust des aufrichtenden Reflexes, der durch die Unfähigkeit angezeigt wird, sich zu bewegen, während die Glaskammer langsam umgeworfen wird. Enthaupten Sie Mäuse mit einer chirurgischen Schere und sammeln Sie Plasma, Gehirn und periphere Organe (siehe Schritte 2.2.2-2.2.4).
VORSICHT: Die ethischen Vorschriften für Opferverfahren variieren zwischen den lokalen Tierkomitees. Stellen Sie sicher, dass Sie die vom örtlichen Tierkomitee erlassenen Vorschriften überprüfen und befolgen.
- Befolgen Sie das Opferverfahren für die immunhistochemische Analyse.
- Für die immunhistochemische Färbung13 werden drei Mäuse aus jeder der folgenden Gruppen verhaltensbezogen bewertet: PEA-behandelt, PEA-unbehandelte Epilepsie und Vehikelgruppen über den gesamten Zeitverlauf (180 min).
- Opfern und perfundieren Sie Mäuse 5 Tage später. Tiefe Betäubung von Mäusen (siehe Schritt 1.3.1 für die Mausgruppen) durch i.p. Injektion von Pentobarbital (100 mg/kg) und Buprenorphin (0,1 mg/kg) als Betäubungsmittel. Bestätigen Sie die tiefe Anästhesie durch den Verlust des Reflexes zwischen den Zehen.
- Befestigen Sie die Maus auf einer Styroporplatte und öffnen Sie den Thorax sofort mit einer feinen Schere und einer Standardzange. Setzen Sie den Schmetterling in die linke Herzkammer und schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer feinen Schere ab.
- Stellen Sie die Drehzahl und den Druck der Pumpe auf einen konstanten peristaltischen Durchfluss mit einer Rate von 2−3 ml/min ein. Mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für ~5 min perfundieren. Ersetzen Sie bei Bedarf den Schmetterling.
HINWEIS: Bei richtiger Durchblutung beginnen die inneren Organe (mit Ausnahme der Milz) innerhalb von 1−2 min auszubleichen. - Perfusion für ~5 min auf eiskalte 4% ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung umschalten. Isolieren Sie das ganze Gehirn wie in Schritt 2.2.2 beschrieben und fixieren Sie es für 24 h in 4% iger PFA-Lösung bei 4 °C.
- Inkubieren Sie Gehirne in 30% iger Saccharoselösung für 48 h bei 4 °C. Entfernen Sie die übrig gebliebene Saccharose mit einem trockenen Seidenpapier und frieren Sie die Gehirne auf einer Metallplatte (-80 °C) ein. Lagern Sie das Gehirn bei -80 °C für die Färbevorgänge13.
2. Probenahmeverfahren für die lipidomische/transkriptomische Analyse
- Bereiten Sie sich auf die Probenahme vor.
- Vorkühl-EDTA-Röhrchen für plasmaförmige Probenahme bis 4 °C. Zentrifugen- und Wirbelapparatur auf 4 °C vorkühlen. Die mit Aluminiumfolie bedeckte Metallplatte (um gefrorenes Gehirn und/oder andere Gewebe von Interesse zu zerbrechen) auf Trockeneis (-80 °C) vorkühlen. Die markierten 2 ml und 5 ml Röhrchen auf Trockeneis (-80 °C) für Plasma-Aliquots, gefrorenes Gewebe bzw. Gehirnentnahme vorkühlen. Verwenden Sie bernsteinfarbene Röhren, um lichtempfindliche Moleküle wie EiCs zu schützen.
- Reinigen Sie die Gewebeprobenahme- und Isolationsgeräte (chirurgische Schere, gerade scharfe feine Schere, gerade glatte Standardzange, feine Pinzette mit Spiegelfinish, gebogene Pinzette und Spatel, Polystyrolschaumplatte und Nadeln zur Fixierung) mit einem Desinfektionsmittel (z. B. 70% Ethanol).
- Sampling-Protokolle
- Bestimmen Sie die Reihenfolge der Stichproben.
- Blut unmittelbar nach der Enthauptung in vorgekühlten 1 ml EDTA-Röhrchen sammeln (siehe Schritt 2.2.3).
- Entfernen Sie das gesamte Gehirn und frieren Sie sofort nach dem Entfernen ein. Dieser Schritt dauert 1−2 Min. Gefrorene Gehirne zur Weiterverarbeitung bei -80 °C lagern (siehe Schritt 2.2.2).
- Entfernen Sie periphere Organe von Interesse (z. B. Lunge, Herz, Leber) innerhalb von 5 Minuten nach der Entfernung des Gehirns und frieren Sie sie ein und lagern Sie sie bei -80 °C zur weiteren Verarbeitung (siehe Schritt 2.2.4).
- Entfernen Sie das Gehirn für Dissektions- oder Stanzverfahren. Dieser Vorgang dauert 1−2 min/Gehirn.
- Beginnen Sie nach der Enthauptung (siehe Schritt 1.2) mit einer feinen Schere einen Mittellinienschnitt in die Haut. Befreien Sie den Schädel, indem Sie die Haut über die Augen drehen. Greifen Sie bis zur Oberseite des Schädels und machen Sie einen kleinen kaudalen Schnitt, der auf der Höhe des intraparietalen Knochens beginnt. Vermeiden Sie es, durch das Gehirn zu schneiden.
- Schneiden Sie fest durch den vordersten Teil des Schädels zwischen den Augen, um die Entfernung des Gehirns zu erleichtern. Kippen Sie eine Seite des Parietalknochens mit einer gekrümmten Schmalmusterzange und brechen Sie ab. Wiederholen Sie den letzten Schritt für die andere Seite.
- Entfernen Sie die Hirnhäute. Schieben Sie einen Spatel unter den vorderen Teil des Gehirns (dh den Riechkolben) und neigen Sie das Gehirn sanft nach oben. Schieben Sie den Spatel weiter nach unten, um die Sehkraft und andere Hirnnerven zu brechen.
- Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel und frieren Sie das gesamte Gehirn sofort auf einer vorgekühlten (-80 ° C) Metallplatte ein, wobei die ventrale Seite der Metallplatte (dorsal nach oben) zugewandt ist.
- Lassen Sie das Gehirn vollständig einfrieren und in vorgekühlte 5-ml-Röhrchen übergehen und lagern Sie es bei -80 °C bis zur Sezierung der Hirnregionen oder zum Stanzverfahren (siehe Schritte 3.1. und 3.2).
- Führen Sie eine Plasmaprobenahme durch.
- Vorgekühlte EDTA-Röhrchen mit 10 μL frisch zubereiteter Indomethacin-Verdünnung auf eine Zielkonzentration von 10 μM spitzeln.
- Sammeln Sie das Rumpfblut unmittelbar nach der Enthauptung durch sanftes Zusammendrücken des Körpers in vorgekühlte EDTA-Röhrchen auf ein maximales Blutvolumen von 1 ml.
HINWEIS: Bei richtigem Blutdruck ist kein Quetschen erforderlich. Wenn das Blutvolumen weniger als 1 ml beträgt, verringern Sie die Isofluran-Inkubationszeit, um einen ordnungsgemäßen Blutfluss zu ermöglichen. - Blutröhrchen sofort bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Entfernen Sie die resultierende obere Plasmaphase und für die Zwecke der Multilipidanalyse aliquot definierte Plasmavolumina in vorgekühlten 2 ml Röhrchen wie folgt: 50 μL für die eCBs/EICs-Analyse, 30 μL für die PLs-Analyse und das verbleibende Plasmavolumen als Backup-Probe oder für andere Arten der Analyse.
- Die Plasmaproben werden zur weiteren Extraktion bei -80 °C gelagert (siehe Schritte 4.1.2 und 4.1.4).
- Führen Sie eine periphere Organprobenahme durch.
HINWEIS: Verwenden Sie hinweise auf die Anatomie der Maus16 und die Unterlagen für die obligatorischen Kurse (FELASA), an denen Tierforscher teilnehmen, um die einzelnen Organe, ihr Bindegewebe und/oder ihre Blutgefäße zu identifizieren.- Immobilisieren Sie den Maustorso, um die Organentfernung mit Nadeln zu erleichtern. Machen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt mit einer geraden scharfen Schere auf der Höhe des Schambeins. Verwenden Sie eine stumpfe Standardzange, um die Bauchdecke zu fixieren, während Sie schneiden, um die Bauchhöhle zu öffnen.
- Immobilisieren Sie die Haut, um die Entfernung der Bauchorgane mit einer stumpfen Pinzette zu ermöglichen. Für die Herz- oder Lungenentfernung setzen Sie den medialen Schnitt in Richtung brusthöhle fort. Entfernen Sie die Lunge und/oder das Herz mit einer feinen Pinzette.
- Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig, um Blutungen zu vermeiden. Schneiden Sie das Bindegewebe und die Blutgefäße, verankern Sie das jeweilige Organ, ohne durch das Organ zu schneiden.
- Gewebestücke sofort auf vorgekühlte Metallplatten (-80 °C) geben und vollständig einfrieren lassen. Gewebestücke in vorgekühlte Röhrchen überführen und zur Weiterverarbeitung bei -80 °C lagern (siehe Schritt 4.1).
- Bestimmen Sie die Reihenfolge der Stichproben.
3. Biologische Materialaufbereitung
HINWEIS: Für die Co-Extraktion von eCBs/EICs verwenden Sie 2 ml Bernsteinrohre als Extraktionsrohre und fügen Sie in jedes Rohr sieben vorgekühlte Stahlkugeln hinzu. Für die Co-Extraktion von PLs/eCBs und für die Dual-Lipid- und RNA-Co-Extraktion verwenden Sie 2 ml RNAse-freie Extraktionsröhrchen, die mit Keramikperlen versetzt sind (Materialtabelle).
- Führen Sie eine Gehirndissektion und periphere Organverarbeitung durch.
HINWEIS: Verwenden Sie Vergrößerungslampen, um die Sichtbarkeit des Gehirns für die Dissektion zu erhöhen.- Reinigen Sie die chirurgischen Werkzeuge, einschließlich der Pinzette mit superfeinen Spitzen, 2x mit 70% Ethanol.
- Übertragen Sie die gefrorenen Gehirne von -80 °C auf eine Petrischale mit vorgekühltem physiologischem Puffer (pH 5,5) Stellen Sie sicher, dass die Petrischale bei 4 °C ist. Erlauben Sie dem Gehirn, sich vollständig zu entfrieren, um eine Dissektion zu ermöglichen. Testen Sie sorgfältig mit einer Pinzette.
VORSICHT: Halten Sie das Gehirn nicht länger bei 4 °C als zum Auftauen erforderlich. - Eine Metallplatte auf Eis (4 °C) vorkühlen und mit feuchtem Gewebe bedecken, das in eiskaltem physiologischem Puffer (pH 5,5) getränkt ist, und das Gehirn mit ventraler Seite nach oben vorsichtig auf eine vorgekühlte (4 °C) Metallplatte auf Eis übertragen. Bedecken Sie es mit feuchtem Gewebe, das in eiskaltem physiologischem Puffer (pH 5,5) getränkt ist.
- Zerlegen Sie Gehirnregionen innerhalb von maximal 5 Minuten mit einer superfeinen Spitzenzange. Beginnen Sie mit dem Hypothalamus (HYP) und drehen Sie die dorsale Seite nach oben, um mit der rechten Seite fortzufahren. Isolieren Sie den Hippocampus (HCr), den präfrontalen Kortex (PFCr), das Striatum (STRr) und die Großhirnrinde (cCTXr). Dann sezieren Sie die linke Seite. Isolieren Sie den Hippocampus (HCl), den präfrontalen Kortex (PFCl), das Striatum (STRl) und die Großhirnrinde (cCTXl). Sezieren Sie das Kleinhirn und die thalamische Region. Verwenden Sie veröffentlichte anatomische Referenzen16,17 für die Identifizierung von Hirnregionen.
- Übertragen Sie jedes zerlegte Stück direkt auf eine mit Aluminiumfolie überzogene, vorgekühlte Metallplatte (-80 °C). Erlauben Sie das Einfrieren und übertragen Sie die isolierten Hirnregionen in die markierten vorgekühlten 2 ml Röhrchen.
- Pulverisieren Sie die Gewebestücke mit einem Gewebepulverisierer (bei -80 °C), um das Auftauen des Gewebes zu vermeiden. Im Kühlraum aliquotes Gewebepulver in markierten, vorgekühlten Extraktionsröhrchen, die Keramikperlen oder Stahlkugeln enthalten. Für die Dual-Lipidomics/Transkriptomics-Analyse ist das Gewebepulver Aliquots im Kühlraum zu wiegen. Für die reine Lipidomik-Analyse wählen Sie zwischen Normalisierung auf das Gewebegewicht oder den Proteingehalt. Für letzteres gehen Sie ohne Gewebegewicht weiter vor.
- Schneiden Sie die peripheren Organgewebe in Stücke mit einem maximalen Gewicht von 20 mg. Fahren Sie mit der Gewebepulverisierung wie in Schritt 3.1.6 fort.
- Fahren Sie mit der Extraktion von Gewebeproben fort (siehe Schritte 4.1.1, 4.1.3 oder 4.1.5) oder lagern Sie die Röhrchen bei -80 °C für eine spätere Extraktion.
HINWEIS: Die Gehirnmatrix kann auch verwendet werden, wenn das Studiendesign dies zulässt. Die Methode eignet sich jedoch besser für eine diskrete und begrenzte Anzahl von Hirnregionen, und es ist nicht praktikabel, alle oben genannten Hirnregionen innerhalb des festgelegten Zeitrahmens zu sezieren und zu isolieren.
- Führen Sie Gehirnstanzen durch.
- Montieren Sie das ganze, gefrorene Gehirn auf das Montagesystem (Table of Materials) im Kryostaten. Stellen Sie die Dicke auf 50 μm ein und schneiden Sie im Trimmmodus nahe am gewünschten Bereich.
- Färben Sie den Gehirnschnitt (18-20 μm) mit Toluidinblau (0,1% -1%) als Referenz, um die interessierende Subregion zu lokalisieren. Untersuchen Sie die gefärbten Scheiben mit einem Mikroskop, um die zu stanzenden Regionen von Interesse zu identifizieren. Verwenden Sie einen Mausatlas als Referenz, um die geeigneten anatomischen Hirnregionen zu finden16. Nehmen Sie Stempel mit einem Durchmesser von 0,8−1,0 mm mit Probenkorren in vorgekühlten Röhrchen.
- Wiegen Sie gefrorene Stempel im Kühlraum in gekennzeichneten, vorgekühlten 2 ml Extraktionsrohren mit Keramikperlen oder Stahlkugeln. Verwenden Sie bernsteinfarbene Röhrchen für die Co-Extraktion von eCBs und EICs.
- Beginnen Sie die Extraktion (siehe Schritte 4.1.1, 4.1.3 oder 4.1.5) oder lagern Sie die Röhrchen zur weiteren Extraktion bei -80 °C.
- Führen Sie eine Plasmaverarbeitung durch.
- Die gefrorenen Plasmaproben auf Eis (4 °C) legen und auftauen lassen (~20 min).
- Stellen Sie sicher, dass das Plasma vollständig ungefroren ist, bevor Sie mit der Extraktion beginnen.
- Fahren Sie mit der Plasmaextraktion fort (siehe Schritte 4.1.2 oder 4.1.4).
HINWEIS: Plasmaproben sollten bis zur Extraktion bei -80 °C bleiben. Vermeiden Sie Zyklen von Auftauen und erneutem Einfrieren.
4. Extraktionsverfahren
- Führen Sie Flüssig-Flüssig (LLE) Lipid-Co-Extraktionsprotokolle durch.
- Führen Sie eine Co-Extraktion von eCBs und EICs aus Gehirnstücken, Stanzen oder Gewebepulverproben durch.
HINWEIS: Während des gesamten Verfahrens ist ein genaues Pipettieren erforderlich.- Legen Sie die Extraktionsröhrchen mit den Gewebeproben und sieben Stahlkugeln auf Eis (4 °C). Fügen Sie 600 μL eiskaltes MTBE und 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) hinzu, die die internen Standards enthalten. Die Zielkonzentration der internen Standards im endgültigen Analysevolumen (50 μL) ist wie folgt: 1 ng/ml AEA-d4, 125 ng/ml 2-AG-d5, 3.000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/ml 1-AG-d5, 2,5 ng/ml PGF2α-d4 und 5 ng/ml für PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 bzw. TXB2-d4.
- 400 μL 0,1 M Ameisensäure zugeben und mit einem Gewebelysator homogenisieren (30 s-1 min). Zentrifugieren Sie das Homogenat für 15 min bei 5.000 x g bei 4 °C. Einfrieren der wässrigen unteren Phase für 10 min bei -80 °C einwirken lassen, um die Übertragung der oberen organischen Phase zu erleichtern.
- Übertragen Sie die organische Phase in neue Röhrchen. Unter einem sanften N2-Strom bei 37 °C verdampfen und zur weiteren Analyse in 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) rekonstituieren.
- Lagern Sie die wässrige Phase bei -20 °C oder -80 °C zur weiteren Analyse des Proteingehalts.
- Durchführung der Co-Extraktion von eCBs und EICs aus Plasmaproben.
- Plasma-Aliquots bei 4 °C auftauen. Fügen Sie 800 μL MTBE und 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) hinzu, die die internen Standards enthalten (analog zu denen, die für die Gewebeanalyse verwendet werden, siehe Schritt 5.1.1). Optimieren Sie die interne Standardkonzentration für das Spiking mit Referenzplasmaproben.
- 600 μL 0,1 M Ameisensäure und Wirbelproben bei 4 °C für 2 min zugeben. Zentrifugenproben bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C.
- Die organische Phase in neue Röhrchen überführen, unter einem sanften N2-Strom bei 37 °C verdampfen und in 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) für die LC/MRM-Analyse rekonstituieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie nach Möglichkeit die Lagerung von getrockneten Extrakten aus EICs und fahren Sie sofort mit der LC/MRM-Analyse fort. Wenn die Lagerung nicht vermieden werden kann, greifen Sie auf eine Kurzzeitlagerung für nur 2−3 Tage bei 4° C mit Proben in LC-Injektionslösungsmittel zurück.
- Führen Sie eine Co-Extraktion von PLs und eCBs aus Gehirnregionen, Stanzen oder anderen Gewebepulverproben durch.
- Legen Sie die Extraktionsröhrchen mit den Gewebeproben und Keramikkügelchen auf Eis (4 °C). Fügen Sie 800 μL MTBE/MeOH (10:3; v/v) und 10 μL MeOH mit den internen Standards hinzu. Die Zielkonzentration der internen Standards im endgültigen Analysevolumen (100 μL) ist wie folgt: 150 ng/ml für PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/ml PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/ml AEA-d4, 60 ng/ml 2-AG-d5, 4.000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d2 bzw. 3 ng/ml PEA-d4.
- Fügen Sie 200 μL 0,1% Ameisensäure mit 25 μM Tetrahydrolipstatin/URB597 und 50 μg/mL BHT hinzu. Mit dem Gewebehomogenisator homogenisieren (Materialtabelle) und 15 min bei 5.000 x g und 4 °C zentrifugieren.
- Gewinnen Sie die obere organische Phase in neuen Rohren zurück und verdampfen Sie unter einem sanften N2-Strom bei 37 °C. Rekonstituieren Sie in 90 μL MeOH und lagern Sie es entweder bei -20 °C oder -80 °C oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
- 10% H2O zu einem Aliquot Lipidextrakt (4.1.3.3) geben und 10 μL in die LC/MS zur PLs-Analyse injizieren. Für weitere eCB-Analysen fahren Sie mit Schritt 4.3.5 fort.
- Ein Aliquot des Extrakts (4.1.3.3) wird entnommen, getrocknet und in ACN/H2O (1:1; v/v) rekonstituiert. Verwenden Sie 20 μL für die LC/MS-Injektion für die eCB-Analyse.
- Führen Sie eine Co-Extraktion von PLs und eCBs aus Plasmaproben durch.
- Plasma-Aliquots bei 4 °C auftauen, 1.000 μL MTBE/Methanol (10:3; v/v) und 10 μL MeOH mit internen Standards (analog zu Schritt 4.1.3) und Wirbel bei 4 °C für 1 min hinzufügen.
- 250 μL H2O zugeben und 45 min bei 4 °C wirbeln. Zentrifugenproben für 15 min bei 5.000 x g und 4 °C. Gewinnen Sie die obere organische Phase zurück, verdampfen Sie unter einem sanften Strom von N2 bei 37 °C und rekonstituieren Sie in 90 μL Methanol für weitere LC / MS-Analysen. Bei -20 °C oder -80 °C lagern oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Für die PLs-Analyse werden 10 % Wasser zu einem Aliquot Lipidextrakt (4.1.2.2) gegeben.
- Für die eCB-Analyse werden 10 % Wasser zu einem Aliquot des Lipidextrakts gegeben (siehe 4.1.4.3), bis zur Trockenheit verdampft und in 50 % ACN/H2O (1:1; v/v) rekonstituiert.
- Führen Sie eine doppelte Extraktion von RNA und Lipiden (Co-Extraktion von PLs und eCBs) aus Gewebeproben durch.
VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Sie unter RNA-freien Bedingungen arbeiten, um einen RNA-Abbau zu vermeiden.- Tauen Sie Gewebepulver aliquots oder Gehirnbündel (bei 4 °C) auf und geben Sie 600 μL RLT-Puffer mit 5 μM THL/URB597, 10 μg/ml BHT und 1% β-Mercaptoethanol (für Prozentsätze des Endvolumens des Homogenisierungspuffers siehe Schritt 4.1) zusammen mit 200 μL Chloroform in Extraktionsröhrchen mit gefrorenen Hirnstempeln und Keramikperlen.
- Spike-Proben mit 10 μL interner Standardmischung für PLs und eCB-Co-Extraktion (siehe Schritt 4.1.3) und homogenisieren mit Gewebehomogenisator (hohe Geschwindigkeit, 20 s).
- Lysate in neue Zentrifugenrohre und Zentrifugen für 5 min bei voller Geschwindigkeit und 4 °C überführen, um die Phasentrennung zu ermöglichen.
- Rückgewinnung und Verwendung der oberen Phase für die RNA-Extraktion unter Verwendung von Standard-RNA-Extraktionsverfahrenskits (Materialtabelle). RNA in einem Gesamtvolumen von 50 μL RNase-freiem Wasser eluieren und bei -80 °C lagern.
ANMERKUNG: Die Probe in Schritt 4.1.5.4 ist sowohl für die RNA-Sequenzierung als auch für die qPCR unter Verwendung der geeigneten Methoden und Instrumente geeignet. - Verwenden Sie die untere chloroformhaltige Phase für die Lipidextraktion. 800 μL MTBE/Methanol (10:3; v/v) und 200 μL 0,1% Ameisensäure und Wirbel für 45 min bei 4 °C zugeben. Gewinnen Sie die obere organische Phase zurück und verdampfen Sie unter einem sanften N2-Strom bei 37 °C.
- Rekonstitution in 90 μL Methanol für weitere LC/MS-Analysen. Bei -20 °C oder -80 °C lagern oder mit Schritt 5 fortfahren.
- 10% H2O zu einem Aliquot Lipidextrakt geben (siehe oben Schritt 4.1.5.6) und 10 μL in die LC/MS zur PLs-Analyse injizieren. Für weitere eCB-Analysen fahren Sie mit Schritt 5.7 fort.
- Ein Aliquot des Extrakts (siehe oben Schritt 4.1.5.6) wird verdampft und in ACN/H2O (1:1; v/v) rekonstituiert. Verwenden Sie 20 μL für die LC/MS-Injektion für die eCB-Analyse (analog zu Schritt 4.3.5).
- Führen Sie eine Co-Extraktion von eCBs und EICs aus Gehirnstücken, Stanzen oder Gewebepulverproben durch.
5. Qualitatives und quantitatives LC/MRM-Profiling
- Bereiten Sie LC-Lösungsmittelsysteme, Kalibrierlösungen und Qualitätskontrollproben vor.
- Für PLs bereiten Sie die mobile Phase A vor: Methanol/Wasser (1:1; v/v) mit 7,5 mM Ammoniumformiat und 0,1% TEA. Herstellung der mobilen Phase B: Methanol/Isopropanol (2:8; v/v) mit 7,5 mM Ammoniumformiat und 0,1 % TEA. Lagern Sie Lösungsmittel in LC-Flaschen.
- Bereiten Sie für die Trennung von eCB und eiC die folgenden LC-Lösungsmittel vor: 0,1% Ameisensäure als mobile Phase A und 100% ACN mit 0,1% Ameisensäure als mobile Phase B. Lagern Sie Lösungsmittel in LC-Flaschen.
- Bereiten Sie Qualitätskontrollen unter Verwendung der Kalibrierstandards und internen Standards (Tabelle 3) in einer äquimolaren oder benutzerdefinierten Konzentration vor.
- Bereiten Sie Kalibrierkurven mit sieben Konzentrationspunkten vor. Verwenden Sie dieselbe interne Standardcharge, um die Kalibrierkurvenlösung und die zu analysierenden Proben zu spitzen.
- Verwenden Sie die LC-MRM-Methode für qualitative und quantitative Lipidprofile.
- Öffnen Sie die Registerkarte Build Acquisition Method in der kommerziellen Software (z. B. Analyst) und wählen Sie den LC/MRM-Modus mit Polaritätsumschaltung. Setzen Sie in der Methode die Ionenübergänge (wie in Tabelle 3 angegeben) für die quantitative Profilerstellung ein. Setzen Sie die Einschwingzeit auf 50 ms.
- Stellen Sie für die PLs-Profilierung die folgenden Ionenquellenparameter ein: Vorhanggas = 40 psi; Temperatur des Heizkörpers = 550 °C; Ionensprühspannung = -4.500 V im negativen Ionenmodus und = +5.200 V im positiven Ionenmodus.
- Stellen Sie für die Co-Analyse von eCBs und EICs die folgenden Parameter ein: Vorhanggas = 40 psi; Temperatur des Heizkörpers = 550 °C; Ionensprühspannung = -4.500 V im negativen Ionenmodus und = +4.500 V im positiven Ionenmodus.
- Für die PL-Analyse die Säulenerwärmung auf 45 °C und den Durchfluss auf 200 μL/min einstellen und folgenden Gradienten einstellen: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B und min 52 = 40% B. Injektionsvolumen auf 10 μL einstellen.
- Stellen Sie für die eCBs- und EICs-Analyse die Säulentemperatur auf Raumtemperatur ein und stellen Sie den folgenden Gradienten ein: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Injektionsvolumen auf 20 μL einstellen.
HINWEIS: MrM-Bedingungen können zwischen instrumentellen Plattformen variieren, daher müssen Fragmentierung und MRM-Bedingungen experimentell abgeleitet werden und Ionisationsparameter sollten getestet und bei Bedarf angepasst werden, um maximale Empfindlichkeit und Selektivität zu erhalten.
- Führen Sie eine Chargenanalyse durch.
- Öffnen Sie den Build Acquisition-Batch und geben Sie die erforderlichen Parameter für die Probenbeschreibung, die Position im Probenrack des Autosamplers und die Erfassungsmethode (festgelegt als Schritt 5.2) ein.
- Schließen Sie Qualitätskontrollen immer zu Beginn und am Ende der Analyse und innerhalb der Charge ein. Fügen Sie nach jeweils 25-30 Proben mindestens drei Kalibrierkurven in die Charge ein und fügen Sie nach jeder Qualitätskontrollprobe, Kalibrierkurve und am Ende der Probencharge einen Waschschritt mit einem Lösungsmittel Ihrer Wahl hinzu.
- Transferproben, die in Schritt 4 in LC/MS-Durchstechflaschen gewonnen wurden. Legen Sie die Proben entsprechend der in der Charge definierten Position in die Ladegestelle des LC-Autosamplers und laden Sie das Probenrack in den LC-Autosampler.
- Stapel- und Warteschlangenanalyse senden.
- Lipidquantifizierung
- Verwenden Sie die kommerzielle Software (z. B. Analyst) und das eingebettete Quantifizierungsmodul für die Quantifizierung von eCBs und EICs sowie kommerzielle Software (z. B. Multiquant) für die PLs-Quantifizierung.
HINWEIS: Die zweite Software kann auch für eCBs und EICs verwendet werden, insbesondere wenn ein interner Standard für die Quantifizierung mehrerer Analyten verwendet wird. - Öffnen Sie die Build-Quantifizierungsmethode und füllen Sie die Parameter für Analyten, interne Standards, MRM-Übergänge aus und schreiben Sie die internen Standards den zu quantifizierenden Analyten zu (Tabelle 3). Stellen Sie die minimale Peakhöhe auf 500 cps ein.
- Verwenden Sie die folgenden Kriterien oder kombinationen davon für die Lipididentitätszuweisung und die anschließende Quantifizierung6: Retentionszeitabgleich von endogenen Lipidanalyten mit Kalibrierstandards und/oder deuterierten internen Standards, sofern verfügbar; Fragmentionenanpassung durch positive und negative Ionenmodenfragmentierung für einen gegebenen m/z von Lipidanalyten, für die keine Standards angegeben sind; literaturgeleitetes Elutionsverhalten von Lipiden unter ähnlich eingesetzten LC-Bedingungen zur Sezierung isomerer und/oder isobarer Strukturen; und, soweit verfügbar, LC/MS- und MS/MS-Analysen mit hochauflösender Massenspektrometrie unter Verwendung ähnlicher LC-Bedingungen wie bei der gezielten Analyse (unter Verwendung von LC/MRM), um die Identität und das Elutionsverhalten endogener Lipide von Interesse genau zu identifizieren18,19.
- Verwenden Sie für die Validierung der Chargenanalyse die folgenden Kriterien: Genauigkeit der Quantifizierung ≤ ±20%; Regressionskoeffizient ≥0,97 (idealerweise ≥0,99).
HINWEIS: Befolgen Sie die Richtlinien für die Entwicklung und Validierung bioanalytischer Methoden, um eine zuverlässige, reproduzierbare Analyse der Zielmoleküle zu gewährleisten.
- Verwenden Sie die kommerzielle Software (z. B. Analyst) und das eingebettete Quantifizierungsmodul für die Quantifizierung von eCBs und EICs sowie kommerzielle Software (z. B. Multiquant) für die PLs-Quantifizierung.
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Representative Results
Der Satz der beschriebenen Protokolle kann auf verschiedenen Ebenen zielspezifisch kombiniert werden, z. B. wahlweise des Tiermodells, Probenahmeweg, Extraktionsmethode und Profilerstellung (Abbildung 1).
Um Lipidspiegeländerungen im Gehirn und in der Peripherie über einen bestimmten Verlauf eines akuten epileptischen Anfallszustands zu bestimmen und die potenzielle antiepileptische Wirkung13 von PEA und ihre Auswirkungen auf Lipidomveränderungen im Gehirn und in der Peripherie zu entschlüsseln, wurden drei Versuchstiergruppen mit Vehikel, KA zur Induktion akuter Epilepsie und PEA als Antiepileptika-Kandidat behandelt. PEA wurde vor der KA-Injektion über i.p. verabreicht (z. B. mit einer einzigen PEA-Injektion zur Akutbehandlung und zwei PEA-Injektionen zur subchronischen Behandlung). Für die Zwecke der multiplen molekularen Analyse und/oder immunhistochemischen Färbung 5 Tage nach der Behandlung wurden die Tierversuche nach Bedarf wiederholt (Abbildung 2).
Die KA-Induktion akuter epileptischer Anfälle führt zu einer maximalen Anfallsintensität 1 h nach der Injektion15 (Abbildung 3). Um Veränderungen des Gehirn- und peripheren Lipidspiegels im Zustand maximaler Anfallsintensitäten zu entschlüsseln, wurden Mäuse 1 h nach der KA-Injektion geopfert, gefolgt von Plasma-, Gehirn- und peripheren Organproben. Gefrorene Gehirne wurden in sechs Hirnregionen seziert (siehe Schritt 3.1). Hirnregionen und periphere Organgewebe (Herz und Lunge) wurden pulverisiert, um homogene Gewebeproben zu erhalten, und anschließend für die beiden lipidomischen Profile von eCBs und EiCs (Abbildung 4A und Schritt 4.1.1) und PLs und eCBs (Abbildung 4B und Schritt 4.1.3) aliquotiert.
Das duale Extraktionsprotokoll (siehe Schritt 4.1.5) wurde angewendet, um PLs/eCBs und RNA mit einer höheren räumlichen Auflösung durch Profiling aus Gehirnschlägen in verschiedenen Regionen durchzuführen: dem Hypothalamus (HYP), der basolateralen Amygdala (BLA) und dem ventralen (vHC) und dorsalen (dHC) Hippocampus (Abbildung 5). Die Stempel wurden (siehe Schritt 3.2) von KA-induzierten epileptischen Mäusen und Kontrollmäusen im maximalen Anfallszustand 1 h nach der KA-Injektion entnommen (Abbildung 2).
Um das Ausmaß der Neurodegeneration zu beurteilen und Lipidveränderungen dem Ausmaß der Neurodegeneration mit Epilepsie und bei einer neuen Epilepsiebehandlung mit PEA zuzuordnen, wurde eine immunhistochemische Doppelfärbung an Hirnschnitten (siehe Schritt 1.3) durchgeführt, die 5 Tage nach KA-induzierten epileptischen Anfällen (Abbildung 2) bei Mäusen ohne subchronische PEA-Behandlung (Mitte), mit subchronischer PEA-Behandlung (rechts) und bei kochsalzinjizierten Mäusen (links) entnommen wurden (Abbildung 6 ). Ka-induzierter Status epilepticus (SE) verursachte einen massiven Verlust des NeuN-Signals, vorwiegend in der CA1-, CA3- und Hilus-Region des Hippocampus, begleitet von apoptotischen Ereignissen, die durch das Caspase-3-Signal (CASP3) angezeigt wurden (Abbildung 6, mittleres Bild) im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 6, linkes Bild). Die subchronische PEA-Behandlung (rechtes Bild) konservierte insbesondere das Signal des neuronalen Kernproteins (NeuN), während das Signal (CASP3) kaum nachweisbar ist.
| KA- und SAL-Injektionslösung . |
| KA Injektionslösung (8 ml Endvolumen): |
| 1. 24 mg KA in 15 ml Röhrchen abwiegen (Vorsicht: Tragen Sie Glothes und Maske) |
| 2. Fügen Sie 8 ml Kochsalzlösung und Wirbel für 10 min hinzu |
| 3. Bei 4 °C aufbewahren für die Lagerung zwischeneinander |
| 4. Aufarbeitung auf Raumtemperatur und Wirbel vor der Injektion |
| Fahrzeug 1 Injektionslösung (8 ml Endvolumen): |
| Überspringen Sie Schritt 1 und fahren Sie mit den Schritten 2-4 fort |
Tabelle 1: Vorbereitung von anfallsinduzierendem Medikament und Vehikel 1 Anwendung. Schritte zur Herstellung der Kainsäure (KA)-Injektionslösung für 24 intraperitoneale Injektionen (10 ml/kg) in einer Endkonzentration von 30 mg/kg und der entsprechenden Vehikelinjektionslösung (Vehikel 1)1.
| PEA- und SAL/DMSO/Cremophor (18:2:1, (v/v/v)) Injektionslösung. |
| PEA-Injektionslösung (8 ml Endvolumen): |
| 1. 32 mg PEA im 15-ml-Röhrchen abwiegen |
| 2. Fügen Sie 0,4 ml DMSO und Wirbel für 10 min hinzu |
| 3. Fügen Sie 3,4 ml SAL und Wirbel für 5 min hinzu |
| 4. Schallmischung für 5 min bei 36°C |
| 5. Fügen Sie 0,4 ml Cremophor und Wirbel für 5 min hinzu |
| 6. 1 min bei 36°C beschallen und 3,4 ml SAL hinzufügen |
| 7. Wirbel für 30 Sek. und Ultraschall für 3 min bei 36°C |
| 8. Die Lösung vor der Injektion bei 36 °C bei niedriger Geschwindigkeit im Shaker und Wirbel aufbewahren |
| Fahrzeug 2 Injektionslösung (8 ml Endvolumen): |
| Überspringen Sie Schritt 1 und fahren Sie mit den Schritten 2-8 fort |
Tabelle 2: Vorbereitung des Antiepileptikas und Vehikel 2 Anwendung. Beispielhafte Schritte zur Herstellung einer Palmitoylethanolamid (PEA)-Injektionslösung für 24 intraperitoneale Injektionen (10 ml/kg) in einer Endkonzentration von 40 mg/kg und der entsprechenden Vehikelinjektionslösung (Vehikel 2)1.
| Positiver Ionenmodus | ||||||
| Ausgewählte Kalibrierstandards PLs | Entsprechende interne Standards | |||||
| Analyt | Vorläufer-Ion | Produkt ion m/z | Analyt | Vorläufer-Ion | Produkt ion m/z | |
| Name | m/z | Name | m/z | |||
| AEA | 348.3 | 62.1 | AEA-d4 | 352.3 | 66.1 | |
| 2-AG | 379.1 | 287.2 | 2-AG-d5 | 384.2 | 287.2 | |
| OEA | 326.2 | 62.1 | OEA-d2 | 328.2 | 62.1 | |
| ERBSE | 300.2 | 62.1 | PEA-d4 | 304.2 | 62.1 | |
| PC 16:0/18:1 | 760.59 | 184.07 | PC 17:0/14:1 | 718.54 | 184.07 | |
| PC 18:2_20:4 | 806.57 | 184.07 | ||||
| PC 18:0_20:4 | 810.6 | 184.07 | ||||
| LPC 18:0 | 524.37 | 184.07 | LPC 17:0 | 510.36 | 184.07 | |
| LPC 20:4 | 544.34 | 184.07 | ||||
| SM d18:1/18:0 | 731.61 | 184.07 | SM d18:1/12:0 | 647.51 | 184.07 | |
| Negativer Ionenmodus | ||||||
| Ausgewählte Kalibrierstandards PLs | Entsprechende interne Standards | |||||
| Analyt | Vorläuferion m/z | Produkt ion m/z | Analyt | Vorläufer-Ion | Produkt ion m/z | |
| Name | Name | m/z | ||||
| AA | 303.05 | 259.1 | AA-d8 | 311.04 | 267 | |
| 5(S)-HETE | 319.48 | 115 | 5(S)-HETE-d8 | 327.48 | 116 | |
| 8(S)-HETE | 319.48 | 155 | 12(S)-HETE-d8 | 327.48 | 184 | |
| 12(S)-HETE | 319.48 | 179 | ||||
| 15(S)-HETE | 319.48 | 219 | ||||
| 19(S)-HETE | 319.48 | 231 | ||||
| 20 HETE | 319.48 | 289 | 20-HETE-d6 | 325.48 | 295 | |
| LxA4 | 351.5 | 115.2 | LxA4-d5 | 356.5 | 115 | |
| PGF2 α | 353.48 | 309.2 | PGF2 α-d4 | 357.5 | 313.3 | |
| TxB2 | 369 | 169 | TxB2-d4 | 373 | 173 | |
| PGE2 | 351.47 | 315.3 | PGE2-d9 | 360.25 | 324.3 | |
| PGD2 | 351.47 | 315.3 | PGD2-d4 | 355.25 | 319.3 | |
| 11β-PGF2 α | 353.24 | 193 | ||||
| RvD1 | 375.22 | 215.1 | RvD1-d5 | 380.22 | 180.2 | |
| PE 16:0/18:1 | 716.52 | 281.25 | PE 17:0/14:1 | 674.48 | 225.19 | |
| PE 38:4 | 766.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:6 | 790.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:4 | 794.57 | 303.23 | ||||
| PA 16:0/18:1 | 673.48 | 255.23 | PA 17:0/14:1 | 631.43 | 269.25 | |
| LPA 16:0 | 409.24 | 153 | LPA 17:0 | 423.25 | 153 | |
| LPA 20:4 | 457.24 | 153 | ||||
| LPI 20:4 | 619.29 | 303.23 | ||||
| PG 16:0/18:1 | 747.52 | 281.25 | PG 17:0/14:1 | 705.47 | 225.19 | |
| PG 16:1_20:4 | 767.49 | 303.23 | ||||
| PG 18:1_20:4 | 795.52 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PS 16:0/18:1 | 760.51 | 255.23 | PS 17:0/14:1 | 718.47 | 269.25 | |
| PS 36:4 | 782.49 | 303.23 | ||||
| PS 38:4 | 810.53 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PI 36:4 | 857.52 | 303.23 | ||||
| PI 38:4 | 885.55 | 303.23 | ||||
| C1P d18:1/16:0 | 616.47 | 78.9 | C1P d18:1/12:0 | 560.41 | 78.9 | |
| S1P d18:1 | 378.24 | 78.9 | S1P d17:1 | 364.23 | 78.9 | |
Tabelle 3: Lipidstandards und MRM-Übergänge für die gezielte Lipidomik-Analyse. Der Tabelleninhalt wurde ursprünglich in Lerner et al.2 veröffentlicht.
Abbildung 1: Übersicht über die Workflow-Module. Je nach Studienziel und verschiedenen Probenwegen können Extraktion und Profilierung kombiniert werden, um ein signifikantes Ergebnis für die Studie zu erzielen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Experimentelles Design eines akuten Kainsäure (KA)-induzierten epileptischen Anfallsmodells bei Mäusen. Mäuse werden entweder mit 1) Kochsalzlösung (10 ml/kg i.p.); 2) KA (30 mg/kg i.p.); und/oder 3) (sub) chronisch vorbehandelt (1−2x 40 mg/kg i.p.) mit der potentiellen Antiepileptika-Verbindung Palmitoylethanolamid (PEA). Vierundzwanzig Mäuse pro Gruppe wurden wie oben behandelt und das Verhalten wurde bewertet, um die Anfallsintensitäten zu bewerten. Sechs Mäuse pro Gruppe wurden zu jedem der vier verschiedenen Zeitpunkte (T1-T4) geopfert, um Lipidspiegeländerungen über einen Zeitverlauf des akuten epileptischen Anfallszustands im Gehirn, in peripheren Organen und im Plasma zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Verhaltensbewertung über einen Zeitverlauf von akuter Kainsäure (KA)-induzierter Epilepsie vs. Kontrollen. Beurteilung der Anfallsintensitäten über einen Zeitverlauf von 180 minuten nach KA-Anfallsinduktion (n = 24) oder Kochsalzinjektion (n = 24), angegeben als mittlere Verhaltenswerte. Es wurden keine Unterschiede zwischen den eingespritzten Gruppen von Fahrzeug 1 und Fahrzeug 2 gefunden. Fehlerbalken = REM. Die wiederholte ANOVA-Messung ergab signifikante Wechselwirkungen zwischen den Zeitpunkten der Messungen und den Testgruppen, was auf signifikante Auswirkungen der KA-Behandlung auf die Verhaltenswerte hinweist. Anfallsintensitäten von KA-behandelten Mäusen wurden ursprünglich in Post et al. veröffentlicht.13Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Lipidspiegel im Gehirn und im peripheren Gewebe im akuten epileptischen Anfallszustand. Lipidspiegeländerungen, die als Mittelwert ± REM bei maximaler Anfallsintensität (z. B. 1 h nach der KA-Injektion) in sechs Gehirnregionen (n = 9) dargestellt wurden: Großhirnrinde (cCTX), Striatum (STR), Thalamische Region (THL), Hippocampus (HC), Hypothalamus (HYP), Kleinhirn (CER) sowie Herz- und Lungengewebe bei KA-induzierten epileptischen Mäusen (oberer Wert) und Kontrollen (niedrigerer Wert). Die basalen Lipidspiegel im Gewebe sind grau dargestellt. Die Werte von PLs, 2-AG und AA sind in nmol/g. und die Werte für NAEs, EiCs und AEA in pmol/g angegeben. Alle Lipidspiegel werden auf das Gewebegewicht normalisiert. Um die spezifischen molekularen Veränderungen hervorzuheben, werden die Lipidspiegel der KA-behandelten Mäuse als Prozentsatz der injizierten Kochsalzlösung (KA/sal) in einer Heatmap dargestellt, die im Vergleich zur Kontrolle verminderte Werte bei akuter Anfallsintensität in Hellblau und die erhöhten Werte im Vergleich zur Kontrolle in Rot darstellt. Sie gelten bei einem p-Wert <0,05 als signifikant. Diese Daten wurden ursprünglich in Lerner et al. veröffentlicht.2Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Duale Extraktion von eCBs/PLs und RNA für quantitatives Profiling aus Maus-Hirnstempeln. (A) Quantitative Verteilung ausgewählter PLs und eCBs auf: 1) eine Subregion des Hypothalamus (HYP); 2) die basolaterale Amygdala (BLA); und 3) die ventralen (vHC) und dorsalen (dHC) Subregionen des Hippocampus, von den KA-induzierten epileptischen Anfallsmäusen (oberer Wert) versus den Kontrollen (unterer Wert) (n = 10). Die Konzentrationen werden auf das Gewebegewicht normalisiert (Stempel entsprechen etwa 0,5−1,5 mg) und in nmol/g ausgedrückt. Nur AEA wird in pmol/g ausgedrückt. Die Lipidspiegel werden als Mittelwert ± REM dargestellt. Die mittlere Variation pro gestanzter Hirnregion (REM als Prozentsatz des Mittelwerts, gemittelt über alle Lipide) beträgt: HYP = 7,83%; BLA = 7,80%; vHC = 6,28%; und dHC = 7,90%. (B) Relative Expressionsniveaus von endogenen Enzymen und Rezeptoren, die an der Lipidsignalisierung beteiligt sind, sowie Marker für die Gehirnaktivität, die auf mRNA-Ebene in verschiedenen Hirnregionen/Subregionen von Mäusen untersucht wurden, die einem KA-induzierten epileptischen Anfall (rot) und Kontrollen (hellgrau) ausgesetzt waren. Statistische Analysen der Differenz zwischen den Gruppenmittelwerten wurden unter Verwendung des zweiseitigen ungepaarten Student's t-Tests durchgeführt und bei einem p-Wert <0,05 (n = 10) als signifikant angesehen. Diese Daten wurden ursprünglich in Lerner et al. veröffentlicht.7Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Immunhistochemische NeuN- und CASP3-Doppelfärbung. Fünf Tage nach der KA-Injektion wurde eine Immunhistochemie an Hirnschnitten von unbehandelten, in Kochsalzlösung injizierten Mäusen (links), subchron PEA-vorbehandelten Mäusen (Mitte) und epileptischen Mäusen ohne Vorbehandlung (rechts) durchgeführt. Die PEA-Vorbehandlung zeigt neuroprotektive Effekte im Vergleich zu unbehandelten epileptischen Mäusen (n = 3). Diese Daten wurden ursprünglich in Post et. al.13Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die hier beschriebene neurolipidomische und transkriptomische Methodik ist ein praktikables Mittel, um jede Krankheit oder gesunde Entwicklung bei hoher und niedriger räumlicher Auflösung im Gehirn und in peripheren Organen zu untersuchen. Aufgrund der optimierten Plasmaprobenahme- und Handhabungsverfahren kann die Plasmalipidomanalyse auch von denselben Tieren durchgeführt werden, die für die Gewebelipidomik und Transkriptomik geopfert wurden, wodurch die Zuverlässigkeit der molekularen Korrelate von Gewebeblut und der Entdeckung von Biomarkern verbessert wird. Die Bereitstellung eines breiten Datensatzes durch Anwendung eines der drei Protokolle oder Kombinationen davon ist von Wert, um nicht nur eine neurologische Erkrankung in einem Kontext (Tiermodellversuch), sondern auch zwischen experimentellen Modellkontexten zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht ein hohes Maß an Standardisierung der Probenahme, Verarbeitung und molekularen Analyse eine hohe Reproduzierbarkeit molekularer Daten und verweist somit zuverlässig auf molekulare Veränderungen zwischen und innerhalb von Studien und Laboren.
Um dies zu erreichen, ist jedoch der Aufbau eines experimentellen Designs entscheidend, das das maximale Auslesepotenzial für das definierte Studienziel bietet. Um einen zuverlässigen Vergleich der molekularen Veränderungen zwischen den Versuchsgruppen zu erreichen, wird empfohlen, mindestens zehn Tiere zu verwenden, um die Variabilität der Tiere und den biologischen Bereich der Lipidspiegel auszugleichen. Wenn die Beschaffung von Tieren und/oder die Logistik der Tierhandhabung restriktiv sind, ist die Verwendung von mindestens sechs Tieren pro Gruppe unerlässlich, um eine zuverlässige statistische Analyse zu ermöglichen. Gruppengrößenberechnungen müssen modellbezogene Mortalitätsraten kompensieren (d.h. trotz der möglichen Mortalitätsrate des Modells sind mindestens sechs, idealerweise zehn Tiere pro Gruppe für die Studie erforderlich). Eine entscheidende Voraussetzung ist es, alters-, geschlechts- und stammangepasste Tiere pro Versuchsgruppe sicherzustellen. Für die Entdeckungsphase ist es wichtig, für alle Studien denselben Anbieter für Versuchstiere und nach Möglichkeit die gleiche Tiercharge zu verwenden, um verzerrungen der Ergebnisse aufgrund möglicher Verhaltens- und molekularer Phänotypunterschiede zwischen Tierchargen zu vermeiden. Um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit des in den Studien ermittelten molekularen und Verhaltensphänotyps zu gewährleisten, ist es wichtig, wann immer möglich eine biologische Replikatanalyse durchzuführen.
Ein weiterer entscheidender Schritt ist der Aufbau einer standardisierten, planmäßigen Experimentellenarbeit mit Tiergruppen. Es ist unerlässlich, die Tiere innerhalb des gleichen Zeitfensters des Tages zu behandeln, um die zirkadiane molekulare Variabilität zu umgehen. Die Tageszeit sollte entsprechend dem bekannten Einfluss des circadianen Rhythmus auf die Synthese und den Abbau der Zielmoleküle festgelegt oder für alle experimentellen Gruppen konsistent gehalten werden, wenn keine Informationen über die Auswirkungen des circadianen Rhythmus verfügbar sind. Ebenso müssen die Haltungs- und Fütterungsbedingungen vor dem Tieropfer konsistent gehalten und über experimentelle Modelle hinweg streng kontrolliert werden. Dies ist besonders relevant für das lipidomische Profiling aufgrund des Einflusses der Ernährung auf den Lipidplasma- und Gewebestoffwechsel. Die Verabreichung von therapeutischen oder krankheitserregenden Arzneimitteln sollte ausnahmslos parallel zur Vehikelverabreichung in Kontrollgruppen erfolgen, wobei das Vehikel mit dem für die Arzneimittelverabreichung verwendeten Vehikel identisch sein muss. Um den für die Zwecke der Studie am besten geeigneten Nagetierstamm und/oder Substrains auszuwählen, sollten die arzneimittelbasierten Behandlungsstrategien entsprechend der Arzneimittelspezifität in Bezug auf Zeit und Häufigkeit der Verabreichung, Dosen und Verabreichungsweg sowie die spezifischen Anfälligkeiten für Arzneimittel verschiedener Stämme, die aus der Literatur und/oder früheren Erfahrungen abgeleitet wurden, durchgeführt werden. Eine zeitliche Verlaufsuntersuchung einer Krankheit und das Ansprechen auf eine Therapie mit großen Kohortengruppen oder mehreren Tiergruppen ist an einem Tag in Bezug auf Behandlung, Opfer und Probenahme unmöglich durchzuführen. In solchen Fällen muss die Verarbeitung von Tiergruppen an aufeinanderfolgenden Tagen geplant und durchgeführt werden, wobei jedoch die gleichen Bedingungen in Bezug auf Tageszeit, Versuchsdesign, Verarbeitungszeit, Forscher usw. beibehalten werden müssen. Die Herstellung von chemischen Injektionen ist ein weiterer kritischer Schritt. Arzneimittel- oder krankheitsauslösende Verbindungen müssen vor der Verabreichung und gemäß den Arzneimittelspezifikationen frisch zubereitet werden. Die Verwendung der gleichen Produktionscharge des Arzneimittels wird für alle zu vergleichenden Kohorten empfohlen. Dies ist besonders wichtig bei natürlichen Verbindungsformulierungen wie Kainsäure (KA), die in dieser Studie zur Epilepsieinduktion verwendet werden.
Um ein zuverlässiges lipidomisches und/oder transkriptomisches Profiling zu ermöglichen, muss das Tieropferverfahren innerhalb eines Zeitrahmens von 5 Minuten konsistent über die Tiergruppen hinweg durchgeführt werden. Wenn nach der Enthauptung Blut gesammelt wird, ist es wichtig, eine konstante Menge an Isofluran in der Glaskammer aufrechtzuerhalten. Zu diesem Zweck häufig (nach fünf Anwendungen) mit Isofluran einweichen und 10 s für die Dauer der Anästhesie mit Isofluran nicht überschreiten, um das Auftreten von Arrhythmien und Herzklopfen zu vermeiden und einen angemessenen Blutdruck für die Plasmaentnahme sicherzustellen.
Die Bedingungen für die Probenahme und Handhabung von biologischem Material (z. B. das Zeitfenster und die Reihenfolge der Probenahme und Handhabung von biologischem Material) müssen strikt befolgt und für alle Gruppen identisch gehalten werden. Um ein variables Auftauen des Gewebes und damit inkonsistente ex vivo Gewebeveränderungen der Lipid- und/oder mRNA-Spiegel zu vermeiden, ist es wichtig, streng kontrollierte Zeit- und Temperaturbedingungen für die Nachentnahme aufrechtzuerhalten.
Lagerung. Zerlegung oder Stanzen von Geweben und anschließende Probenbearbeitung und -analyse (siehe Abschnitte 3 und 4). Frisch beprobte ganze Gehirne können sofort auf einer vorgekühlten Metallplatte (4 °C) ohne vorheriges Snapfreezing seziert werden, wenn die Größe der Versuchstiergruppen Tieropfer, Entfernung und Dissektion zulässt, ohne den hier für jedes dieser Verfahren angegebenen Zeitrahmen zu verändern. Wenn die Größe der experimentellen Gruppen für diese Verfahren nicht praktikabel ist, wird das Einfrieren des Gehirns und die anschließende Dissektion empfohlen, um eine vergleichbare und kontrollierte Zeit für die Verarbeitung zu ermöglichen. Bei strikter Einhaltung der hier angegebenen Protokolle und Zeitlinien wurden keine Diskrepanzen zwischen molekularen Ebenen beobachtet, die durch Extraktion von frisch sezierten Gehirnregionen erhalten wurden, und Gehirnregionen, die aus gefrorenen Gehirnen seziert wurden.
Ein kritischer Aspekt für das Erreichen einer reproduzierbaren und minimalen Variabilität der Lipidspiegel innerhalb und zwischen gruppen, abgesehen von der Probenverarbeitung unter streng kontrollierten Temperaturbedingungen, ist die Bereitstellung von Antioxidantien (siehe Abschnitte 2 und 3). Die Vermeidung von Stressfaktoren (z. B. Blutgeruch) der Tiere vor dem Opfern ist von größter Bedeutung, da sich viele Lipide, die an der neuronalen Aktivität beteiligt sind, wie eCBs, als Reaktion auf Stress schnell ändern können.
Für die Lipidextraktion und -analyse ist es wichtig, die internen Standards, Kalibrierlösungen und Extraktionslösungsmittel am Tag der Extraktion frisch vorzubereiten. Sowohl für die Vorbereitung der Kalibrierkurve als auch für die Probenextraktion muss dieselbe Quelle interner Standards verwendet werden. Auch die Einhaltung streng kontrollierter Temperaturbedingungen für die Probenextraktion, -lagerung und -analyse ist von größter Bedeutung, um enzymatische oder chemische Ex-vivo-Veränderungen von Molekülen zu minimieren und zu kontrollieren. Für die LC/MRM-Analyse kann der Satz der Ziellipide durch Hinzufügen oder Entfernen von Zielen und entsprechend internen Standards und Kalibranten auf das Studienziel zugeschnitten werden, sofern die Trennungs-, Nachweis- und MRM-Übergänge für einen neuen Satz von Lipiden optimiert werden. Die vorgestellten Extraktionsprotokolle ermöglichen die Bereitstellung von zwei LC/MRM-Replikaten für eCBs und EICs, was für Fälle von technischem Versagen oder wenn die Replikatanalyse für die Studie von Bedeutung ist, von entscheidender Bedeutung ist. PL-Extraktionsprotokolle machen Proben-/Extraktmengen für mindestens 10 Analysen pro Extrakt geeignet (z. B. mehrere Scan-Experimente basierend auf Vorläufer-Ionen- bzw. Neutralverlust-Scanning2; zusätzliche LC/MRM-Analysen; oder LC/MRM-Replikate, um technische Fehler während eines Laufs auszugleichen). Die Lipidanalyse ist nicht auf LC/MRM beschränkt; Tatsächlich sind die Lipidextrakte, die mit einem dieser Protokolle erhalten werden, für eine untargtete High-End-Massenspektrometrium-Analyse geeignet. Mit Ausnahme von Gehirnstempeln oder winzigen Gewebemengen, die aus diskreten Regionen (weniger als 3 mg) gewonnen werden, können gefrorene pulverisierte Gewebe von Regionen, die größer als 2−3 mg sind, aliquotediert und für mehrere Extraktionsmodule verwendet werden, wie hier beschrieben, für die Replikatanalyse und/oder für andere Untersuchungen, die in Gewebepulver zugänglich sind.
Ein allgemeiner Vorteil der hier beschriebenen Protokolle im Vergleich zu den häufig verwendeten ist die erhöhte Gesamtzeitwirksamkeit und Sensitivität für die Extraktion und Analyse von Mehrkomponenten bei geringerem Aufwand für Tierressourcen, Verbrauchsmaterialien und Analysekosten. Wichtig ist, dass das Dual-Lipid/mRNA-Extraktionsprotokoll auch eine höhere Effizienz der mRNA-Extraktion20,21 und Integrität der mRNA im Vergleich zu entsprechenden verfügbaren Standardprotokollen sowie eine gleichzeitig erhöhte Effizienz der Lipidextraktion7 bietet. Dies ist wahrscheinlich auch auf den verringerten Matrixeffekt für jede der Lipid- und mRNA-Fraktionen bei doppelter Extraktion zurückzuführen. Aus diesem Grund ist die Methode leicht für die Erstellung von Profilen mit hoher räumlicher Auflösung wie z. B. bei Gehirnstempeln anwendbar.
Eine aktuelle Einschränkung des Protokolls besteht jedoch darin, dass die Entzündungslipide nicht für die Analyse und Quantifizierung mit der Dual-Lipid/mRNA-Extraktion geeignet sind. Somit unterliegt das Protokoll einer weiteren Verfeinerung. Zu diesem Zweck können entzündliche Lipide und Endocannabinoide aus Gewebe und Plasma co-extrahiert und co-analysiert werden, was ein optimiertes Werkzeug zur gleichzeitigen Untersuchung neuroinflammatoratorischer Prozesse und endocannabinoid-modulierter neuronaler Aktivität ist (siehe Koextraktion von EICs und eCBs). Es wird erwartet, dass die Einbeziehung von Phospholipiden in diesen letztgenannten Assay möglich ist.
Im Hinblick auf prospektive multioline Ansätze für neurologische Erkrankungen wird erwartet, dass die proteomische Analyse von Proteinfraktionen, die nach dem Lipidextraktionsprotokoll erhalten werden (d.h. Co-Extraktion von eCBs und EICs sowie Co-Extraktion von PLs und eCBs), durchführbar ist. Dies ist jedoch bei Verwendung des Dual-Lipid/mRNA-Protokolls noch nicht möglich. Für letztere schließt die chemische Umgebung der Extraktion sogar die Proteinmengenbestimmung mit Standardproteinassays wie dem Bicinchoninsäure-Assay (BCA) aus. Weitere Entwicklungen, um diese Einschränkung zu überwinden und die Aufnahme von Proteom-Profiling in diese Protokolle zu beschleunigen, sind geplant.
Mit dem hier beschriebenen modularen Protokoll war es möglich, eine regionale Gehirnkarte von EICs, eCBs und PLs in einem Tiermodell akuter epileptischer Anfälle zu erhalten (Abbildung 4). Das Protokoll zeigte die Hippocampus-Modulation von Entzündungsprozessen durch EiCs und der neuronalen Aktivitätsmodulation durch eCBs bei behandelten und unbehandelten Mäusen mit KA-induzierten akuten Anfällen13. Subregionale Hirnlokalisierung von Phospholipid-, Endocannabinoid- und mRNA-Veränderungen bei akuten epileptischen Anfallszuständen wurde ebenfalls beobachtet (Abbildung 5). Diese Ergebnisse unterstreichen den Wert und die Anwendbarkeit der hier beschriebenen Methoden zur Weiterentwicklung des Wissens über ein breites Spektrum von Lipiden, die an der Modulation komplexer neurologischer Erkrankungen wie Epilepsie in Hirnregionen und Subregionen beteiligt sind. Diese Protokolle sind von allgemeiner Anwendbarkeit in der neurologischen Krankheitsuntersuchung und darüber hinaus, während die Weiterentwicklung der Protokolle und Anwendungen für Zellpopulationen fortgesetzt wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir widmen diesen Artikel Dr. Ermelinda Lomazzo. Während der Fertigstellung dieses Manuskripts verstarb Dr. Ermelinda Lomazzo. Sie ist die Verkörperung der Leidenschaft für die Wissenschaft und des selbstlosen Engagements in der Teamarbeit, um einen sinnvollen Forschungszweck zu erfüllen. Sie träumte immer davon, einen sinnvollen Beitrag zum größeren Wohlergehen der Menschen zu leisten. Ihre gutherzige Natur wurde nie durch die anstrengenden Wege der Wissenschaft und des Lebens beeinträchtigt. Sie wird von unschätzbarem Wert und für immer in unseren Herzen bleiben.
Julia M. Post wurde durch das Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) an der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz gefördert und wird derzeit durch das SPP-2225 EXIT Projekt an LB gefördert. Raissa Lerner wurde teilweise durch das DZHK-Projekt 81X2600250 an LB und Lipidomics Core Facility gefördert. Eine Teilfinanzierung dieser Studien erfolgte durch die Lipidomics Core Facility, das Institut für Physiologische Chemie und Intramurale Mittel (an LB) der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
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