Summary
Dit artikel presenteert een modulair protocol voor weefsellipideomica en transcriptomica, en plasmalipideomica in neurologische ziektemuismodellen gericht op lipiden die ten grondslag liggen aan ontsteking en neuronale activiteit, membraanlipiden, stroomafwaartse boodschappers en mRNA-coderende enzymen / receptoren die ten grondslag liggen aan de lipidefunctie. Bemonsterings-, monsterverwerkings-, extractie- en kwantificeringsprocedures worden beschreven.
Abstract
Lipiden dienen als de primaire interface voor hersenbeledigingen of stimuli die bevorderlijk zijn voor neurologische ziekten en zijn een reservoir voor de synthese van lipiden met verschillende signalerings- of ligandfuncties die het begin en de progressie van ziekten kunnen onderstrepen. Lipiden veranderen vaak op presymptomatisch niveau en zijn een opkomende bron van medicijndoelen en biomarkers. Veel neurologische ziekten vertonen neuro-inflammatie, neurodegeneratie en neuronale prikkelbaarheid als gemeenschappelijke kenmerken, gedeeltelijk gemoduleerd door specifieke lipide signaleringssystemen. De onderlinge afhankelijkheid en onderlinge samenhang van de synthese van verschillende lipiden leidt tot een multilipiden-, multi-enzym- en multireceptoranalyse om de overeenkomsten en specificiteiten van neurologische contexten af te leiden en de ontrafeling van mechanistische aspecten van het begin en de progressie van de ziekte te versnellen. Het toeschrijven van lipiderollen aan verschillende hersengebieden bevordert de bepaling van lipide moleculair fenotype en morfologie geassocieerd met een neurologische ziekte.
Hier wordt een modulair protocol gepresenteerd dat geschikt is voor de analyse van membraanlipiden en downstream lipidesignalen, samen met mRNA van enzymen en mediatoren die ten grondslag liggen aan hun functionaliteit, geëxtraheerd uit discrete hersengebieden die relevant zijn voor een bepaalde neurologische ziekte en / of aandoening. Om nauwkeurige vergelijkende lipidomische profilering te garanderen, werden de workflows en operationele criteria geoptimaliseerd en gestandaardiseerd voor: i) hersenbemonstering en dissectie van interessante regio's, ii) co-extractie van meerdere lipidesignalen en membraanlipiden, iii) dubbele lipide / mRNA-extractie, iv) kwantificering door vloeistofchromatografie multiple reaction monitoring (LC / MRM), en v) standaard mRNA-profilering. Deze workflow is vatbaar voor de lage weefselhoeveelheden die worden verkregen door bemonstering van de functioneel discrete hersensubregio's (d.w.z. door brain punching), waardoor bias in multimoleculaire analyse als gevolg van weefselheterogeniteit en / of dierlijke variabiliteit wordt voorkomen. Om perifere gevolgen van neurologische ziekten te onthullen en translationele moleculaire uitlezingen van neurologische ziektetoestanden vast te stellen, worden perifere orgaanbemonstering, verwerking en hun daaropvolgende lipidomische analyse, evenals plasmalipideomica, ook nagestreefd en beschreven. Het protocol wordt gedemonstreerd op een acuut epilepsiemuismodel.
Introduction
Recente ontwikkelingen in de functie van lipiden en hun rol in het begin en de progressie van neurologische ziekten openen nieuwe onderzoeks- en ontwikkelingslocaties van nieuwe therapeutische doelen en opheldering van het ziektemechanisme1. Gedocumenteerde verschillen in lipidesamenstelling in verschillende hersengebieden, benadrukt door moderne moleculaire beeldvormingstechnieken zoals massaspectrometrie beeldvorming en geavanceerde massaspectrometrieprofilering, verschuift het paradigma van lipidenonderzoek van hele hersenen naar functioneel verschillende en discrete hersengebieden. Het feit dat de lipidesamenstelling varieert in verschillende hersengebieden leidt tot nieuwe conceptualisering van zowel membraanlipidegevoeligheid als stroomafwaartse lipidesignalering als reactie op een hersenbelediging of stimuli in de functioneel verschillende hersengebieden. Daarom vereisen lipideprotocollen nieuwe ontwikkelingen om de uitdaging van lage weefselhoeveelheden aan te pakken voor detectie en kwantificering met een hogere ruimtelijke resolutie, en tegelijkertijd analyse van meerdere lipidecomponenten van celmembranen en signaalroutes. Ook de bepaling van enzymen, lipideliganden en receptoren die betrokken zijn bij de regulatie van hun niveaus en functie is van het grootste belang om de signaalroutes die bij een neurologische ziekte worden beïnvloed, op te helderen en nieuwe mechanistische onderzoeken in een pathofysiologische context te begeleiden.
Naast de verhoogde ruimtelijke resolutie van de hersenen, zijn er twee grote problemen die de ontwikkeling van nieuwe neurolipidomische benaderingen uitdagen. Ten eerste zijn de lipide-signaleringsmoleculen meestal van zeer lage abundantie in vergelijking met membraanvormende lipiden. Ten tweede vertoont het lipidoom een hoge structurele heterogeniteit, moeilijk te ontleden met behulp van een enkele analytische benadering. Daarom zijn extractie- en analysemethoden afgestemd op verschillende lipidecategorieën en worden ze vaak uitgevoerd in verschillende weefselmonsters2. Shotgun lipidomische methoden3 zijn uitstekende hulpmiddelen om snel een breed profiel van membraanlipiden te onthullen, terwijl verhoogde gevoeligheid en selectiviteit die worden geboden door de gerichte ontdekking en kwantificering massaspectrometrische methoden worden benut voor onderzoek van laag overvloedige signaallipiden, waaronder: i) inflammatoire lipiden en ii) lipiden die betrokken zijn bij de modulatie van neuronale activiteit, zoals endocannabinoïden (eCB's), aminozuurgerelateerde lipiden, enz.4,5. Om lipideveranderingen op zowel het celmembraan als het signaleringsniveau te omvatten die optreden in hersengebieden van neurologische ziektemodellen, worden de lipide-extractie en -analyse meestal uitgevoerd in verschillende weefselmonsters, verkregen uit verschillende dierlijke batches of uit verschillende hemisferen, of door een groter weefselgebied in meerdere stukken te ontleden. Wanneer mRNA-niveaus van enzymreceptoren ook van belang zijn, vereist hun onderzoek meestal de verkrijging van een afzonderlijk weefselmonster. Het onderzoek van membraanlipiden, endogene cannabinoïden en mRNA zou bijvoorbeeld drie verschillende weefselmonsters vereisen (bijvoorbeeld twee monsters voor de twee lipide-extractiemethoden - membraanlipiden en signaleringslipiden - en daaropvolgende twee lipidenanalysemethoden - en één monster voor mRNA-analyse). Onderzoek naar inflammatoire lipiden en endogene cannabinoïden vereist respectievelijk twee verschillende weefselmonsters, extractiemethoden en analysemethoden. Een ander voorbeeld is het onderzoek van mRNA en van elke lipidecategorie in een hersenpunch- of lasermicrodissectiemonster, waardoor twee verschillende dieren twee monsters per hersengebied (sub)regio moeten verkrijgen. Een aanzienlijke mate van variabiliteit en/of slechte reproduceerbaarheid van de resultaten komt in dergelijke gevallen vaak voor, als gevolg van biologische variabiliteit en/of weefselheterogeniteit. Geleid door deze praktische beperkingen van multimoleculaire analyse, die met name optreden bij hoge ruimtelijke resolutie in de hersenen, werd een driemodule neurolipidomicsprotocol ontworpen dat omvat: 1) co-extractie en co-analyse door LC / MRM van inflammatoire lipiden (bijv. Eicosanoïden (eiCs)) en lipiden die betrokken zijn bij modulatie van neuronale activiteit, zoals eCB's2; 2) co-extractie van fosfolipiden (PR's) en eCB's met daaropvolgende multiscan LC/MRM en precursor/neutrale verliesscananalyse2; en 3) dubbele extractie van membraan (fosfo)lipiden en eCB's, evenals mRNA, met daaropvolgende LC/MRM en qPCR of RNA sequencing analyse6. Afhankelijk van de biologische vraag die moet worden behandeld bij een neurologische ziekte en het hersengebied van belang, kan een combinatie van het eerste en het tweede protocol, of het eerste en het derde protocol, worden toegepast op hetzelfde weefselmonster voor weefsels met een gewicht van ongeveer 4 mg. Het eerste en derde protocol kunnen onafhankelijk worden toegepast voor weefsels rond 2 mg. Het tweede protocol kan worden toegepast voor weefsels met een gewicht van slechts 0,5 mg. Ongeacht de geselecteerde neurolipidomische protocolmodule zijn de weefselbemonstering en pre-analytische verwerking, de hersenisolatie en regiodissectie, evenals de procedure voor het opofferen van het diermodel gestandaardiseerd en identiek voor alle drie de modules van het protocol. In ons onderzoek naar neurologische aandoeningen worden perifere organen die relevant zijn voor de pathologische gevolgen van de ziekte altijd ook verzameld en geanalyseerd met behulp van deze modulaire protocollen. Bovendien wordt bloed regelmatig bemonsterd voor plasmalipideomica om te dienen als een uitleesinstrument van neurologische ziekten met het oog op prospectieve translationele toepassingen. Het hier gepresenteerde modulaire lipidomics-protocol is zeer veelzijdig: schaalbaar naar grotere weefselhoeveelheden en gemakkelijk toepasbaar voor vrijwel elk weefseltype en elke ziekte. Voor de toepassing van het modulaire protocol (Figuur 1) bij neurologische ziekten is elk gestandaardiseerd knaagdiermodel van het begin en de progressie van neurologische aandoeningen, zoals traumatisch hersenletsel, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer of epilepsie vatbaar.
Deze protocollen zijn uitgebreid toegepast om veranderingen in het weefsellipideoom en /of transcriptoom in de acute fase van epilepsie te bestuderen in het door kaïnzuur (KA) geïnduceerde muismodel van epilepsie2,7, een model dat veel wordt gebruikt in preklinische studies vanwege de gelijkenis met humane temporale kwab epilepsie (TLE)8,9,10,11. Met behulp van deze protocollen werd het therapeutisch potentieel van geneesmiddelen zoals Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 beoordeeld in hetzelfde muismodel van epilepsie. De studie identificeerde lipide- en mRNA-veranderingen bij hoge en lage ruimtelijke resolutie in de hersenen en periferie, op het tijdstip van maximale acute aanvalsintensiteiten (bij 60 min posteizure inductie), en bij subchronische en acute behandeling met PEA op vier verschillende tijdstippen (20, 60, 120 en 180 min) na KA-aanvalsinductie, een tijdvenster dat de acute fase van epilepsie bestrijkt. Plasma, hersenen en perifere organen van onbehandelde KA-geïnjecteerde muizen, acute en subchronisch PEA-behandelde muizen, evenals voertuig- en PEA-voertuigcontrolemuizen, werden verzameld op elk tijdstip12,13 en onderzocht met deze moleculaire analyse. De moleculaire gegevens werden gecorreleerd met gedragsfenotypen verkregen door het scoren van aanvallen, evenals met immunohistochemische afgeleide gegevens over neurodegeneratieve processen, om de progressie van de acute epilepsiefase en het potentieel van PEA om het te verlichten te ontrafelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven experimentele procedures zijn in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschap van 22 september 2010 (2010/63EU) en zijn goedgekeurd door het plaatselijke dierencomité van de deelstaat Rijnland-Palts, Duitsland (dossierreferentie: 23 177-07/G16-1-075).
1. Diermodel van acute en profylactisch behandelde KA-geïnduceerde epilepsie
- Voer epileptische inductie, behandeling en gedragsscores uit.
- Scheid muizen (minimaal n = 6 muizen per groep) in enkele kooien.
- Bereid de injectieoplossing voor aanvallen en inductie en het bijbehorende medium (zie tabel 1), alsmede de behandelingsinjectieoplossing en het bijbehorende medium (zie tabel 2).
- Injecteer muizen intraperitoneaal (i.p.) (10 ml / kg lichaamsgewicht van de muis) zonder anesthesie volgens hun groepsidentiteit: ziekte, behandeld of behandeld vehikel (d.w.z. KA, met PEA behandeld KA en de twee voertuiggroepen). Zie figuur 2, tabel 1 en tabel 2.
- Monitor en scoor het gedrag volgens de volgende gestandaardiseerde aanvalsintensiteitsschaal: 0 = geen respons; 1 = immobiliteit en staren; 2 = voorpoot en/of staartverlenging, stijve houding; 3 = repetitieve bewegingen, hoofd dobberen; 4 = opfokken en vallen; 5 = continu opfokken en vallen; 6 = ernstige clonische-tonische aanvallen; 7 = overlijden14,15 (figuur 3).
- Voer een opofferingsprocedure uit voor lipidomische en transcriptomische analyse.
- Op vier tijdstippen (d.w.z. respectievelijk 20, 60, 120 en 180 minuten na KA- of voertuiginjectie) offeren zes muizen uit elk van de volgende groepen: PEA-behandeld, PEA-onbehandeld epileptisch voertuig 1 en voertuig 2, volgens IACUC-goedgekeurde protocollen.
- Tien seconden nadat elk tijdstip is bereikt, verdooft u de muizen met behulp van een met isofluraan doordrenkt weefsel in een glazen kamer. Bevestig de anesthesie door het verlies van de rechtrichtreflex, aangegeven door het onvermogen om te bewegen terwijl de glazen kamer langzaam omvalt. Onthoofd muizen met een chirurgische schaar en verzamel plasma, hersenen en perifere organen (zie stappen 2.2.2−2.2.2.4).
LET OP: Ethische voorschriften voor het opofferen van procedures variëren tussen lokale dierencomités. Zorg ervoor dat u de voorschriften van de lokale dierencommissie controleert en volgt.
- Volg de opofferingsprocedure voor immunohistochemische analyse.
- Voor immunohistochemische kleuring13, gedragsmatig scoren drie muizen uit elk van de volgende groepen: PEA behandeld, PEA-onbehandelde epilepsie en voertuiggroepen, over het hele tijdsverloop (180 min).
- Offer en laat muizen 5 dagen later doordringen. Verdoving muizen diep (zie stap 1.3.1 voor de muizengroepen) door o.a. injectie van pentobarbital (100 mg/kg) en buprenorfine (0,1 mg/kg) als verdovende middelen. Bevestig diepe anesthesie door het verlies van reflex tussen de tenen.
- Bevestig de muis op een polystyreenplaat en open de thorax onmiddellijk met een fijne schaar en standaardtang. Plaats de vlinder in de linkerhartkamer en knip het rechteratrium met een fijne schaar.
- Pas de snelheid en druk van de pomp aan op een constante peristaltische stroom met een snelheid van 2−3 ml/min. Perfuseer met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende ~ 5 min. Vervang indien nodig de vlinder.
OPMERKING: Met de juiste perfusie beginnen de inwendige organen (behalve de milt) binnen 1−2 min uit te bleken. - Schakel perfusie over op ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing gedurende ~ 5 min. Isoleer hele hersenen zoals beschreven in stap 2.2.2 en fixeer gedurende 24 uur in 4% PFA-oplossing bij 4 °C.
- Incubeer de hersenen in 30% sucrose-oplossing gedurende 48 uur bij 4 °C. Verwijder de overgebleven sucrose met een droog tissuepapier en vries de hersenen in op een metalen plaat (-80 °C). Bewaar de hersenen bij -80 °C voor de kleuringsprocedures13.
2. Bemonsteringsprocedures voor lipidomische/transcriptomische analyse
- Bereid je voor op bemonstering.
- Voorkoelde EDTA-buizen voor plasmabemonstering tot 4 °C. Koel de centrifuge en vortexapparatuur voor tot 4 °C. Koel de metalen plaat bedekt met aluminiumfolie (om bevroren hersenen en /of andere interessante weefsels te breken) op droogijs (-80 °C). Precool de gelabelde buizen van 2 ml en 5 ml op droogijs (-80 °C) voor respectievelijk plasma-aliquots, bevroren weefsel en hersenverzameling. Gebruik amberkleurige buizen om lichtgevoelige moleculen, zoals eiCs, te beschermen.
- Reinig de weefselbemonsterings- en isolatieapparatuur (chirurgische schaar, rechte scherpe fijne schaar, rechte gladde standaardtang, fijne tang met spiegelafwerking, gebogen tang en spatel, polystyreenschuimplaat en naalden voor fixatie) met een ontsmettingsmiddel (bijv. 70% ethanol).
- Bemonsteringsprotocollen
- Bepaal de volgorde van de bemonstering.
- Verzamel bloed onmiddellijk na onthoofding in voorgekoelde EDTA-buisjes van 1 ml (zie stap 2.2.3).
- Verwijder de hele hersenen en klik onmiddellijk na verwijdering vast. Deze stap duurt 1−2 min. Bewaar bevroren hersenen bij -80 °C voor verdere verwerking (zie stap 2.2.2).
- Verwijder perifere organen van belang (bijv. long, hart, lever), binnen 5 minuten na hersenverwijdering, en klik in en bewaar bij -80 °C voor verdere verwerking (zie stap 2.2.4).
- Verwijder de hersenen voor dissectie- of ponsprocedures. Deze procedure duurt 1−2 min/hersenen.
- Begin na onthoofding (zie stap 1.2) met het maken van een middellijnincisie in de huid met behulp van een fijne schaar. Bevrijd de schedel door de huid over de ogen te draaien. Reik naar de bovenkant van de schedel en maak een kleine caudale incisie beginnend ter hoogte van het intrapariëtale bot. Vermijd het doorsnijden van de hersenen.
- Snijd stevig door het meest voorste deel van de schedel tussen de ogen om hersenverwijdering te vergemakkelijken. Kantel een kant van het pariëtale bot met behulp van een gebogen tang met smal patroon en breek af. Herhaal de laatste stap voor de andere kant.
- Verwijder de hersenvliezen. Schuif een spatel onder het voorste deel van de hersenen (d.w.z. de reukbol) en kantel de hersenen voorzichtig naar boven. Schuif de spatel verder naar beneden om de optische en andere hersenzenuwen te breken.
- Til de hersenen uit de schedel en knip de hele hersenen onmiddellijk in op een voorgekoelde (-80 °C) metalen plaat met de ventrale kant naar de metalen plaat (dorsaal omhoog).
- Laat de hersenen volledig bevriezen en overbrengen in voorgekoelde buizen van 5 ml en bewaar bij -80 °C tot de dissectie van de hersengebieden of de ponsprocedure (zie stappen 3.1. en 3.2).
- Voer plasmamonsters uit.
- Spike voorgekoelde EDTA-buizen met 10 μL vers bereide indomethacine-verdunning tot een streefconcentratie van 10 μM.
- Verzamel het rompbloed onmiddellijk na onthoofding door het lichaam zachtjes in voorgekoelde EDTA-buizen te knijpen tot een maximaal bloedvolume van 1 ml.
OPMERKING: In het geval van de juiste bloeddruk is knijpen niet nodig. Als het bloedvolume minder dan 1 ml is, verlaag dan de isofluraan incubatietijd om een goede bloedstroom mogelijk te maken. - Centrifugeer onmiddellijk bloedbuizen bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verwijder de resulterende bovenste plasmafase en met het oog op multilipid-analyse aliquot gedefinieerde plasmavolumes in voorgekoelde buizen van 2 ml als volgt: 50 μL voor eCB's/eiCs-analyse, 30 μL voor PR-analyse en het resterende plasmavolume als back-upmonster of voor andere soorten analyses.
- Bewaar de plasmamonsters bij -80 °C voor verdere extractie (zie stappen 4.1.2 en 4.1.4).
- Voer perifere orgaanbemonstering uit.
OPMERKING: Gebruik muisanatomische referenties16 en documentatie voor de verplichte cursussen (FELASA) die door dieronderzoekers worden bijgewoond om de individuele organen, hun bindweefsels en / of bloedvaten te identificeren.- Immobiliseer de romp van de muis om orgaanverwijdering met behulp van naalden te vergemakkelijken. Maak een ventrale middellijnincisie met een rechte scherpe schaar ter hoogte van het schaambeen. Gebruik stompe standaardtang om de buikwand te fixeren tijdens het snijden om de buikholte te openen.
- Immobiliseer de huid om het verwijderen van buikorganen mogelijk te maken met behulp van stompe tangen. Voor hart- of longverwijdering gaat u verder met de mediale snede in de richting van de borstgrot. Verwijder de long en/of het hart met een fijne tang.
- Open de borstholte voorzichtig om bloedingen te voorkomen. Snijd de bindweefsels en bloedvaten die het respectieve orgaan verankeren zonder door het orgaan te snijden.
- Breng weefselstukken onmiddellijk over op voorgekoelde metalen platen (-80 °C) en laat volledig bevriezen. Breng weefselstukken over in voorgekoelde buizen en bewaar bij -80 °C voor verdere verwerking (zie stap 4.1).
- Bepaal de volgorde van de bemonstering.
3. Biologische materiaalverwerking
OPMERKING: Gebruik voor co-extractie van eCB's /eiCs 2 ml amberkleurige buizen als extractiebuizen en voeg in elke buis zeven voorgekoelde stalen kogels toe. Gebruik voor co-extractie van PR's /eCB's en voor dubbele lipide- en RNA-co-extractie 2 ml RNAse-vrije extractiebuizen met keramische kralen (tabel met materialen).
- Voer hersendissectie en perifere orgaanverwerking uit.
OPMERKING: Gebruik vergrootlampen om de zichtbaarheid van de hersenen voor dissectie te vergroten.- Reinig de chirurgische hulpmiddelen, waaronder de tang met superfijne uiteinden, 2x met 70% ethanol.
- Breng de bevroren hersenen over van -80 °C naar een petrischaal met voorgekoelde fysiologische buffer (pH 5,5) Zorg ervoor dat de petrischaal op 4 °C staat. Laat hersenen volledig ontdooien om dissectie mogelijk te maken. Test zorgvuldig met een tang.
LET OP: Houd de hersenen niet langer op 4 °C dan nodig is om te ontdooien. - Precool een metalen plaat op ijs (4 °C) en bedek deze met natte weefsels gedrenkt in ijskoude fysiologische buffer (pH 5,5) en breng de hersenen met ventrale zijde voorzichtig over op een voorgekoelde (4 °C) metalen plaat op ijs. Bedek het met natte weefsels gedrenkt in ijskoude fysiologische buffer (pH 5,5).
- Ontleed hersengebieden binnen maximaal 5 minuten met behulp van superfijne tiptang. Begin met de hypothalamus (HYP) en draai de dorsale kant omhoog om verder te gaan met de rechterkant. Isoleer de hippocampus (HCr), prefrontale cortex (PFCr), striatum (STRr) en hersenschors (cCTXr). Ontleed vervolgens de linkerkant. Isoleer de hippocampus (HCl), prefrontale cortex (PFCl), striatum (STRl) en hersenschors (cCTXl). Ontleed het cerebellum en het thalamische gebied. Gebruik gepubliceerde anatomische referenties16,17 voor de identificatie van hersengebieden.
- Breng elk ontleed stuk rechtstreeks over op een met aluminiumfolie bedekte, voorgekoelde metalen plaat (-80 °C). Laat bevriezen en breng de geïsoleerde hersengebieden over in de gelabelde voorgekoelde buizen van 2 ml.
- Verpulver de weefselstukken met behulp van een weefselverpulver (bij -80 °C), waardoor het ontdooien van het weefsel wordt voorkomen. In de koelcel, aliquot weefselpoeder in gelabelde, voorgekoelde extractiebuizen met keramische kralen of stalen ballen. Voor de dual lipidomics/transcriptomics analyse, weeg de weefselpoeder aliquots in de koude kamer. Voor analyse van alleen lipidomics kunt u kiezen tussen normalisatie van het weefselgewicht of het eiwitgehalte. Voor de laatste, ga verder zonder weefselweging.
- Snijd de perifere orgaanweefsels in stukken met een maximumgewicht van 20 mg. Ga verder met weefselverpulvering zoals in stap 3.1.6.
- Ga verder met de extractie van weefselmonsters (zie stappen 4.1.1, 4.1.3 of 4.1.5) of bewaar buizen bij -80 °C voor latere extractie.
OPMERKING: De hersenmatrix kan ook worden gebruikt als de onderzoeksopzet dit toelaat. De methode is echter meer geschikt voor een discreet en beperkt aantal hersengebieden en het is niet praktisch om alle bovengenoemde hersengebieden binnen het gestelde tijdsbestek te ontleden en te isoleren.
- Voer hersenstoten uit.
- Monteer de hele, bevroren hersenen op het montagesysteem (Table of Materials) in de cryostaat. Stel de dikte in op 50 μm en snijd in trim-modus dicht bij het gewenste gebied.
- Kleuring hersenschijf (18−20 μm) met behulp van toluidineblauw (0,1%−1%) als referentie om de subregio van belang te lokaliseren. Inspecteer de gekleurde plakjes met behulp van een microscoop om de gebieden van belang te identificeren die moeten worden gestanst. Gebruik een muizenatlas als referentie om de juiste anatomische hersengebieden te vinden16. Neem ponsen met een diameter van 0,8−1,0 mm met behulp van monstercorers in voorgekoelde buizen.
- Weeg bevroren ponsen in de koelcel in gelabelde, voorgekoelde afzuigbuizen van 2 ml met keramische kralen of stalen ballen. Gebruik amberkleurige buizen voor eCBs en eiCs co-extractie.
- Begin met de extractie (zie stappen 4.1.1, 4.1.3 of 4.1.5) of bewaar buizen bij -80 °C voor verdere extractie.
- Voer plasmaverwerking uit.
- Plaats de ingevroren plasmamonsters op ijs (4 °C) en laat ze ontdooien (~20 min).
- Zorg ervoor dat het plasma volledig is ontdooid voordat u met de extractie begint.
- Ga verder met de plasma-extractieprocedure (zie stap 4.1.2 of 4.1.4).
OPMERKING: Plasmamonsters moeten bij -80 °C blijven tot de extractie. Vermijd cycli van ontdooien en opnieuw invriezen.
4. Extractieprocedures
- Voer Liquid-Liquid (LLE) lipide co-extractieprotocollen uit.
- Voer co-extractie uit van eCB's en eiCs uit hersenstukken, ponsen of weefselpoedermonsters.
OPMERKING: Nauwkeurig pipetteren is vereist tijdens de hele procedure.- Plaats de extractiebuizen met de weefselmonsters en zeven stalen ballen op ijs (4 °C). Voeg 600 μL ijskoude MTBE en 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) toe met daarin de interne normen. De streefconcentratie van de interne normen in het uiteindelijke analysevolume (50 μL) is als volgt: 1 ng/ml AEA-d4, 125 ng/ml 2-AG-d5, 3.000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/ml 1-AG-d5, 2,5 ng/ml PGF2α-d4 en 5 ng/ml voor PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; Respectievelijk 20-HETE-d6 en TXB2-d4.
- Voeg 400 μL mierenzuur van 0,1 M toe en homogeniseer met een weefsellyser (30 s-1 min). Centrifugeer het homogenaat gedurende 15 minuten bij 5.000 x g bij 4 °C. Laat het invriezen van de waterige onderste fase gedurende 10 minuten bij -80 °C toe om de overdracht van de bovenste organische fase te vergemakkelijken.
- Breng de organische fase over in nieuwe buizen. Verdamp onder een zachte stroom van N2 bij 37 °C en reconstitueer in 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) voor verdere analyse.
- Bewaar de waterige fase bij -20 °C of -80 °C voor verdere analyse van het eiwitgehalte.
- Voer co-extractie uit van eCB's en eIC's uit plasmamonsters.
- Ontdooi plasma aliquots bij 4 °C. Voeg 800 μL MTBE en 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) toe met de interne normen (analoog aan die welke worden gebruikt voor weefselanalyse, zie stap 5.1.1). Optimaliseer de interne standaardconcentratie voor spiking met behulp van referentieplasmamonsters.
- Voeg gedurende 2 minuten 600 μl mierenzuur en vortexmonsters bij 4 °C 600 μL mierenzuur en vortexmonsters toe. Centrifugeer monsters bij 4.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Breng de organische fase over in nieuwe buizen, verdamp onder een zachte stroom van N2 bij 37 °C en reconstitueer in 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) voor LC/MRM-analyse.
OPMERKING: Vermijd indien mogelijk de opslag van gedroogde extracten van eiCs en ga onmiddellijk over tot LC/MRM-analyse. Als opslag niet kan worden vermeden, gebruik dan een korte opslag gedurende slechts 2−3 dagen bij 4 ° C met monsters in LC-injectieoplosmiddel.
- Voer co-extractie uit van PR's en eCB's uit hersengebieden, stoten of andere weefselpoedermonsters.
- Plaats de extractiebuizen met de weefselmonsters en keramische kralen op ijs (4 °C). Voeg 800 μL MTBE/MeOH (10:3; v/v) en 10 μL MeOH toe met daarin de interne normen. De streefconcentratie van de interne normen in het eindvolume voor analyse (100 μL) is als volgt: 150 ng/ml voor PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/ml PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/ml AEA-d4, 60 ng/ml 2-AG-d5, 4.000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d2 en 3 ng/ml PEA-d4 respectievelijk.
- Voeg 200 μL 0,1% mierenzuur toe dat 25 μM tetrahydrolipstatine/URB597 en 50 μg/ml BHT bevat. Homogeniseer met de weefselhomogenisator (Materiaaltafel) en centrifugeer bij 5.000 x g en 4 °C gedurende 15 min.
- Herstel de bovenste organische fase in nieuwe buizen en verdamp onder een zachte stroom van N2 bij 37 °C. Reconstitueer in 90 μL MeOH en bewaar bij -20 °C of -80 °C of ga verder met de volgende stap.
- Voeg 10% H2O toe aan een hoeveelheid lipidenextract (4.1.3.3) en injecteer 10 μL in de LC/MS voor PLs-analyse. Ga voor verdere eCB-analyse verder met stap 4.3.5.
- Neem een aliquot van het extract (4.1.3.3), verdamp tot droogheid en reconstitueer in ACN/H2O (1:1; v/v). Gebruik 20 μL voor LC/MS-injectie voor eCB-analyse.
- Voer co-extractie uit van PR's en eCB's uit plasmamonsters.
- Ontdooi plasma aliquots bij 4 °C, voeg 1.000 μL MTBE/methanol (10:3; v/v) en 10 μL MeOH met interne normen (analoog aan stap 4.1.3) en vortex toe bij 4 °C gedurende 1 min.
- Voeg 250 μL H2O en vortex gedurende 45 minuten bij 4 °C toe. Centrifugeer monsters gedurende 15 minuten bij 5.000 x g en 4 °C. Herstel de bovenste organische fase, verdamp onder een zachte stroom van N2 bij 37 °C en reconstitueer in 90 μL methanol voor verdere LC/MS-analyse. Bewaren bij -20 °C of -80 °C of doorgaan naar de volgende stap.
- Voeg voor de analyse van DE's 10% water toe aan een hoeveelheid lipidenextract (4.1.2.2).
- Voeg voor eCB-analyse 10% water toe aan een hoeveelheid lipidenextract (zie 4.1.4.3), verdamp tot droogheid en reconstitueer in 50% ACN/H2O (1:1; v/v).
- Voer dubbele extractie van RNA en lipiden (co-extractie van PR's en eCB's) uit weefselmonsters uit.
LET OP: Zorg ervoor dat u onder RNA-vrije omstandigheden werkt om RNA-degradatie te voorkomen.- Ontdooi weefselpoeder aliquots of hersenbossen (bij 4 °C) en voeg 600 μL RLT-buffer met 5 μM THL/URB597, 10 μg/ml BHT en 1% β-mercaptoethanol (voor percentages van het uiteindelijke volume homogenisatiebuffer, zie stap 4.1) samen met 200 μL chloroform toe aan extractiebuizen met bevroren hersenstoten en keramische kralen.
- Spikemonsters met 10 μL intern standaardmengsel voor PR's en eCB-co-extractie (zie stap 4.1.3) en homogeniseren via weefselhomogenisator (hoge snelheid, 20 s).
- Breng lysaten over in nieuwe centrifugebuizen en centrifugeer gedurende 5 minuten op volle snelheid en 4 °C om de fasescheiding mogelijk te maken.
- Herstel en gebruik de bovenste fase voor RNA-extractie met behulp van standaard RNA-extractieprocedurekits (Tabel met materialen). Eluut-RNA in een totaal volume van 50 μL RNase-vrij water en opslaan bij -80 °C.
OPMERKING: Het monster in stap 4.1.5.4 is geschikt voor zowel RNA-sequencing als qPCR met behulp van de juiste methoden en instrumentatie. - Gebruik de onderste chloroform-bevattende fase voor lipide-extractie. Voeg 800 μL MTBE/methanol (10:3; v/v) en 200 μL 0,1% mierenzuur en vortex toe gedurende 45 minuten bij 4 °C. Herstel de bovenste organische fase en verdamp onder een zachte stroom van N2 bij 37 °C.
- Reconstitueer in 90 μL methanol voor verdere LC/MS-analyse. Bewaren bij -20 °C of -80 °C of ga verder met stap 5.
- Voeg 10% H2O toe aan een aliquot lipide-extract (zie bovenstaande stap 4.1.5.6) en injecteer 10 μL in de LC/MS voor PR-analyse. Ga voor verdere eCB-analyse verder met stap 5.7.
- Neem een aliquot van het extract (zie stap 4.1.5.6) verdampen tot droogheid en reconstitueren in ACN/H2O (1:1; v/v). Gebruik 20 μL voor LC/MS-injectie voor eCB-analyse (analoog aan stap 4.3.5).
- Voer co-extractie uit van eCB's en eiCs uit hersenstukken, ponsen of weefselpoedermonsters.
5. Kwalitatieve en kwantitatieve profilering van LC/MRM
- Bereid LC-oplosmiddelsystemen, kalibratieoplossingen en kwaliteitscontrolemonsters voor.
- Bereid voor PV's mobiele fase A: methanol/water (1:1; v/v) met 7,5 mM ammoniumformiaat en 0,1% THEE. Bereid mobiele fase B voor: methanol/isopropanol (2:8; v/v) met 7,5 mM ammoniumformiaat en 0,1% TEA. Bewaar oplosmiddelen in LC-flessen.
- Bereid voor eCB- en eiC-scheiding de volgende LC-oplosmiddelen voor: 0,1% mierenzuur als mobiele fase A en 100% ACN met 0,1% mierenzuur als mobiele fase B. Bewaar oplosmiddelen in LC-flessen.
- Bereid kwaliteitscontroles voor met behulp van de kalibratienormen en interne normen (tabel 3) in een equivalente of door de gebruiker gedefinieerde concentratie.
- Bereid kalibratiecurven voor met zeven concentratiepunten. Gebruik dezelfde interne standaardbatch om de kalibratiecurveoplossing en de te analyseren monsters te verhogen.
- Gebruik de LC-MRM-methode voor kwalitatieve en kwantitatieve lipidenprofilering.
- Open het tabblad Build Acquisition Method in de commerciële software (bijv. Analyst) en selecteer LC/MRM-modus met polariteitsschakeling. Stel in de methode de ionovergangen in (zoals aangegeven in tabel 3) voor kwantitatieve profilering. Stel de bezinkingstijd in op 50 ms.
- Stel voor PLs-profilering de volgende ionenbronparameters in: gordijngas = 40 psi; temperatuur bronverwarming = 550 °C; ionensproeispanning = -4.500 V in negatieve ionenmodus en = +5.200 V in positieve ionenmodus.
- Stel voor co-analyse van eCB's en EIC's de volgende parameters in: gordijngas = 40 psi; temperatuur bronverwarming = 550 °C; ionensproeispanning = -4.500 V in negatieve ionenmodus en = +4.500 V in positieve ionenmodus.
- Stel voor PL-analyse de kolomverwarming in op 45 °C en het debiet op 200 μL/min en stel de volgende gradiënt in: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B, en min 52 = 40% B. Stel het injectievolume in op 10 μL.
- Stel voor de analyse van eCB's en eIC's de kolomtemperatuur in op kamertemperatuur en stel de volgende gradiënt in: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Stel het injectievolume in op 20 μL.
OPMERKING: MRM-omstandigheden kunnen variëren tussen instrumentele platforms, vandaar dat fragmentatie en MRM-omstandigheden experimenteel moeten worden afgeleid en ionisatieparameters moeten worden getest en indien nodig worden aangepast om maximale gevoeligheid en selectiviteit te krijgen.
- Batchanalyse uitvoeren.
- Open build acquisition batch en vul de vereiste parameters in voor monsterbeschrijving, locatie in het monsterrek van autosampler en acquisitiemethode (ingesteld als stap 5.2).
- Neem altijd kwaliteitscontroles op aan het begin en einde van de analyse en binnen de batch. Neem na elke 25−30 monsters ten minste drie kalibratiecurven op in de batch en neem een wasstap op met een oplosmiddel naar keuze na elk kwaliteitscontrolemonster, kalibratiecurve en aan het einde van de monsterbatch.
- Breng de bij stap 4 verkregen monsters over in injectieflacons met LC/MS. Plaats de monsters in de laadrekken van de LC autosampler volgens de positie die in de batch is gedefinieerd en laad het monsterrek in de LC autosampler.
- Batch indienen en wachtrijanalyse starten.
- Kwantificering van lipiden
- Gebruik de commerciële software (bijv. Analyst) en de geïntegreerde kwantificeringsmodule voor eCB's en eIC-kwantificering en commerciële software (bijv. Multiquant) voor PLs-kwantificering.
OPMERKING: De tweede software kan ook worden gebruikt voor eCB's en eiCs, vooral wanneer één interne standaard wordt gebruikt voor de kwantificering van meerdere analyten. - Open Build Quantification Method en vul de parameters in voor analyten, interne standaarden, MRM-overgangen en schrijf de interne standaarden toe aan de te kwantificeren analyten (tabel 3). Stel de minimale piekhoogte in op 500 cps.
- Gebruik de volgende criteria of combinatie daarvan voor de toewijzing van lipidenidentiteit en de daaropvolgende kwantificering6: retentietijdmatching van lipide-endogene analyten met kalibratiestandaarden en/of gedeutereerde interne normen, indien beschikbaar; fragmentionenmatching door positieve en negatieve ionenmodusfragmentatie voor een bepaalde m/z lipideanalyten waarvoor geen normen zijn voorzien; literatuur-afgeleid elutiegedrag van lipiden onder op vergelijkbare wijze gebruikte LC-omstandigheden om isomeer- en/of isobare structuren te ontleden; en, indien beschikbaar, LC/MS- en MS/MS-analyse met hoge-resolutie massaspectrometrie, waarbij gebruik wordt gemaakt van vergelijkbare LC-omstandigheden als voor gerichte analyse (met behulp van LC/MRM), om de identiteit en het elutiegedrag van endogene lipiden van belang nauwkeurig te identificeren18,19.
- Gebruik voor de validatie van batchanalyse de volgende criteria: nauwkeurigheid van kwantificering ≤ ±20%; regressiecoëfficiënt ≥0,97 (idealiter ≥0,99).
OPMERKING: Volg de richtlijnen voor de ontwikkeling en validatie van bioanalytische methoden om een betrouwbare, reproduceerbare analyse van de doelmoleculen te garanderen.
- Gebruik de commerciële software (bijv. Analyst) en de geïntegreerde kwantificeringsmodule voor eCB's en eIC-kwantificering en commerciële software (bijv. Multiquant) voor PLs-kwantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De reeks beschreven protocollen kan op verschillende niveaus op een doelspecifieke manier worden gecombineerd, zoals de keuze van het diermodel, de bemonsteringsroute, de extractiemethode en de profilering (figuur 1).
Om veranderingen in het lipidenniveau in de hersenen en de periferie te bepalen gedurende een tijdsverloop van een acute epileptische aanvalstoestand en om het potentiële anti-epileptische effect13 van PEA en de impact ervan op lipidoomveranderingen in hersenen en periferie te ontrafelen, werden drie experimentele diergroepen behandeld met vehikel, KA om acute epilepsie te induceren en PEA als een kandidaat-geneesmiddel tegen anti-epileptica. PEA werd toegediend via i.p. voorafgaand aan de KA-injectie (bijv. met een enkele PEA-injectie voor acute behandeling en twee PEA-injecties voor subchronische behandeling). Ten behoeve van meervoudige moleculaire analyse en/of immunohistochemische kleuring 5 dagen na de behandeling werden de dierproeven indien nodig herhaald (figuur 2).
KA-inductie van acute epileptische aanvallen leidt tot een maximale aanvalsintensiteit 1 uur na injectie15 (figuur 3). Om veranderingen in de hersenen en het perifere lipidenniveau te ontrafelen bij de toestand van maximale aanvalsintensiteiten, werden muizen opgeofferd op 1 uur na KA-injectie, gevolgd door plasma-, hersen- en perifere orgaanbemonstering. Bevroren hersenen werden ontleed in zes hersengebieden (zie stap 3.1). Hersengebieden en perifere orgaanweefsels (hart en longweefsel) werden verpulverd om homogene weefselmonsters te verkrijgen en vervolgens gealiquoteerd voor de twee lipidomische profilering van eCB's en eiCs (figuur 4A en stap 4.1.1) en PR's en eCB's (figuur 4B en stap 4.1.3).
Het duale extractieprotocol (zie stap 4.1.5) werd toegepast om PLs/eCB's en RNA met een hogere ruimtelijke resolutie uit te voeren via profilering van hersenstoten in verschillende regio's: de hypothalamus (HYP), basolaterale amygdala (BLA) en de ventrale (vHC) en dorsale (dHC) hippocampus (figuur 5). Stoten werden bemonsterd (zie stap 3.2) van KA-geïnduceerde epileptische muizen en controlemuizen in de maximale aanvalstoestand 1 uur na KA-injectie (figuur 2).
Om de omvang van neurodegeneratie te beoordelen en lipideveranderingen toe te schrijven aan de mate van neurodegeneratie bij epilepsie en bij nieuwe epilepsiebehandeling met PEA, werd immunohistochemische dubbele kleuring uitgevoerd op hersensecties (zie stap 1.3) bemonsterd 5 dagen na KA-geïnduceerde epileptische aanvallen (figuur 2) bij muizen zonder subchronische PEA-behandeling (midden), met subchronische PEA-behandeling (rechts) en bij met zoutoplossing geïnjecteerde muizen (figuur 6) (figuur 6 ). KA-geïnduceerde status epilepticus (SE) veroorzaakte massaal verlies van NeuN-signaal, voornamelijk in het CA1-, CA3- en hilusgebied van de hippocampus, vergezeld van apoptotische gebeurtenissen aangegeven door caspase-3 (CASP3) signaal (figuur 6, middelste afbeelding) in vergelijking met de controle (figuur 6, linker afbeelding). Subchronische PEA-behandeling (rechterbeeld) met name geconserveerd neuronale kerneneiwit (NeuN) signaal, terwijl (CASP3) signaal nauwelijks detecteerbaar is.
| KA- en SAL-injectieoplossing . |
| KA-injectieoplossing (8 ml eindvolume): |
| 1. Weeg 24 mg KA af in een tube van 15 ml (let op: draag glothes en masker) |
| 2. Voeg 8 ml zoutoplossing en vortex toe gedurende 10 minuten |
| 3. Bewaren op 4°C voor ontermdediate opslag |
| 4. Reconditioneer tot kamertemperatuur en vortex voorafgaand aan injectie |
| Medium 1 injectieoplossing (8 ml eindvolume): |
| Sla stap 1 over en ga verder met stap 2-4 |
Tabel 1: Bereiding van inbeslagname-inducerende drug en toepassing van voertuig 1. Stappen voor het bereiden van de Kainic acid (KA) injectieoplossing voor 24 intraperitoneale injecties (10 ml/kg) in een eindconcentratie van 30 mg/kg en de overeenkomstige injectieoplossing van het medium (medium 1)1.
| PEA- en SAL/DMSO/Cremophor (18:2:1, (v/v/v)) injectieoplossing. |
| PEA-injectieoplossing (8 ml eindvolume): |
| 1. Weeg 32 mg PEA af in een tube van 15 ml |
| 2. Voeg 0,4 ml DMSO en vortex toe gedurende 10 minuten |
| 3. Voeg 3,4 ml SAL en vortex toe gedurende 5 minuten |
| 4. Sonicate mengsel gedurende 5 min bij 36°C |
| 5. Voeg 0,4 ml Cremophor en vortex toe gedurende 5 minuten |
| 6. Soniceer gedurende 1 minuut bij 36 °C en voeg 3,4 ml SAL toe |
| 7. Vortex gedurende 30 sec en sonicate gedurende 3 min bij 36°C |
| 8. Houd de oplossing op 36°C bij lage snelheid in shaker en vortex voorafgaand aan injectie |
| Medium 2 injectieoplossing (8 ml eindvolume): |
| Sla stap 1 over en ga verder met stap 2-8 |
Tabel 2: Bereiding van het anti-epileptische geneesmiddel en toepassing van voertuig 2. Aanbevolen stappen voor het bereiden van Palmitoylethanolamide (PEA)-injectieoplossing voor 24 intraperitoneale injecties (10 ml/kg) in een eindconcentratie van 40 mg/kg en de overeenkomstige injectieoplossing (medium 2)1.
| Positieve ionenmodus | ||||||
| Geselecteerde kalibratiestandaardenPL's | Overeenkomstige interne normen | |||||
| Analyt | Voorloper ion | Product ion m/z | Analyt | Voorloper ion | Product ion m/z | |
| naam | m/z | naam | m/z | |||
| AEA | 348.3 | 62.1 | AEA-d4 | 352.3 | 66.1 | |
| 2-AG | 379.1 | 287.2 | 2-AG-d5 | 384.2 | 287.2 | |
| OEA | 326.2 | 62.1 | OEA-d2 | 328.2 | 62.1 | |
| ERWT | 300.2 | 62.1 | PEA-d4 | 304.2 | 62.1 | |
| PC 16:0/18:1 | 760.59 | 184.07 | PC 17:0/14:1 | 718.54 | 184.07 | |
| PC 18:2_20:4 | 806.57 | 184.07 | ||||
| PC 18:0_20:4 | 810.6 | 184.07 | ||||
| LPC 18:0 | 524.37 | 184.07 | LPC 17:0 | 510.36 | 184.07 | |
| LPC 20:4 | 544.34 | 184.07 | ||||
| SM d18:1/18:0 | 731.61 | 184.07 | SM d18:1/12:0 | 647.51 | 184.07 | |
| Negatieve ionenmodus | ||||||
| Geselecteerde kalibratiestandaardenPL's | Overeenkomstige interne normen | |||||
| Analyt | Voorloper ion m/z | Product ion m/z | Analyt | Voorloper ion | Product ion m/z | |
| naam | naam | m/z | ||||
| AA | 303.05 | 259.1 | AA-D8 | 311.04 | 267 | |
| 5(S)-HETE | 319.48 | 115 | 5(S)-HETE-d8 | 327.48 | 116 | |
| 8(S)-HETE | 319.48 | 155 | 12(S)-HETE-d8 | 327.48 | 184 | |
| 12(EN)-HETE | 319.48 | 179 | ||||
| 15(EN)-HETE | 319.48 | 219 | ||||
| 19(EN)-HETE | 319.48 | 231 | ||||
| 20-HETE | 319.48 | 289 | 20-HETE-d6 | 325.48 | 295 | |
| LxA4 | | 351.5 | 115.2 | LxA4-D5 | 356.5 | 115 | |
| PGF2 α | 353.48 | 309.2 | PGF2 α-d4 | 357.5 | 313.3 | |
| TxB2 | 369 | 169 | TxB2-d4 | 373 | 173 | |
| PGE2 | 351.47 | 315.3 | PGE2-d9 | 360.25 | 324.3 | |
| Pgd2 | 351.47 | 315.3 | PGD2-d4 | 355.25 | 319.3 | |
| 11β-PGF2 α | 353.24 | 193 | ||||
| RvD1 | 375.22 | 215.1 | RvD1-d5 | 380.22 | 180.2 | |
| PE 16:0/18:1 | 716.52 | 281.25 | PE 17:0/14:1 | 674.48 | 225.19 | |
| PE 38:4 | 766.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:6 | 790.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:4 | 794.57 | 303.23 | ||||
| PA 16:0/18:1 | 673.48 | 255.23 | PA 17:0/14:1 | 631.43 | 269.25 | |
| LPA 16:0 | 409.24 | 153 | LPA 17:0 | 423.25 | 153 | |
| LPA 20:4 | 457.24 | 153 | ||||
| LPI 20:4 | 619.29 | 303.23 | ||||
| PG 16:0/18:1 | 747.52 | 281.25 | PG 17:0/14:1 | 705.47 | 225.19 | |
| PG 16:1_20:4 | 767.49 | 303.23 | ||||
| PG 18:1_20:4 | 795.52 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PS 16:0/18:1 | 760.51 | 255.23 | PS 17:0/14:1 | 718.47 | 269.25 | |
| PS 36:4 | 782.49 | 303.23 | ||||
| PS 38:4 | 810.53 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PI 36:4 | 857.52 | 303.23 | ||||
| PI 38:4 | 885.55 | 303.23 | ||||
| C1P d18:1/16:0 | 616.47 | 78.9 | C1P d18:1/12:0 | 560.41 | 78.9 | |
| S1P d18:1 | 378.24 | 78.9 | S1P d17:1 | 364.23 | 78.9 | |
Tabel 3: Lipidenstandaarden en MRM-overgangen voor gerichte lipidomics-analyse. De inhoud van de tabel werd oorspronkelijk gepubliceerd in Lerner et al.2
Figuur 1: Overzicht van de workflowmodules. Afhankelijk van het doel van het onderzoek en verschillende bemonsteringsroutes kunnen extractie en profilering worden gecombineerd om een significante uitkomst voor het onderzoek mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimenteel ontwerp van acuut kaienzuur (KA)-geïnduceerd epileptisch aanvalsmodel bij muizen. Muizen worden behandeld met 1) zoutoplossing (10 ml / kg i.p.); 2) KA (30 mg/kg i.p.); en/of 3) (sub) chronisch voorbehandeld (1−2x 40 mg/kg i.p.) met de potentiële anti-epileptische verbinding Palmitoylethanolamide (PEA). Vierentwintig muizen per groep werden behandeld zoals hierboven en gedrag werd gescoord om de intensiteit van aanvallen te evalueren. Zes muizen per groep werden opgeofferd op elk van de vier verschillende tijdspunten (T1-T4) om veranderingen in het lipideniveau te bepalen gedurende een tijdsverloop van acute epileptische aanvalstoestand in de hersenen, perifere organen en plasma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gedragsscore over een tijdsverloop van acute kainic acid (KA)-geïnduceerde epilepsie versus controles. Beoordeling van aanvalsintensiteiten over een tijdsverloop van 180 minuten na KA-aanvalsinductie (n = 24) of zoutoplossinginjectie (n = 24) gegeven als gemiddelde gedragsscores. Er werden geen verschillen gevonden tussen de voertuig 1 en voertuig 2 geïnjecteerde groepen. Foutbalken = SEM. Herhaalde meting van ANOVA leverde significante interacties op tussen de tijdspunten van de metingen en de testgroepen, wat wijst op significante effecten van KA-behandeling op gedragsscores. Aanvalsintensiteiten van ka-behandelde muizen werden oorspronkelijk gepubliceerd in Post et al.13Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Lipideniveaus in de hersenen en perifeer weefsel bij acute epileptische aanvallen. Veranderingen in lipidenniveau gepresenteerd als gemiddelde waarde ± SEM bij maximale aanvalsintensiteit (bijv. 1 uur na KA-injectie) in zes hersengebieden (n = 9): hersenschors (cCTX), striatum (STR), thalamisch gebied (THL), hippocampus (HC), hypothalamus (HYP), cerebellum (CER), evenals hart- en longweefsel bij KA-geïnduceerde epileptische muizen (bovenste waarde) en controles (lagere waarde). De basale lipideniveaus in weefsels zijn grijs weergegeven. De waarden van PR's, 2-AG en AA worden gegeven in respectievelijk nmol/g. en de waarden voor NAE's, eiCs en AEA in pmol/g. Alle lipideniveaus worden genormaliseerd naar het weefselgewicht. Om de specifieke moleculaire veranderingen te benadrukken, worden de lipideniveaus van de met KA behandelde muizen weergegeven als percentage van de geïnjecteerde zoutoplossing (KA / sal) in een heatmap met verminderde waarden bij acute aanvalsintensiteit in vergelijking met de controle worden weergegeven in respectievelijk lichtblauw en de verhoogde niveaus in vergelijking met controle in rood. Ze worden als significant beschouwd bij een p-waarde <0,05. Deze gegevens werden oorspronkelijk gepubliceerd in Lerner et al.2Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Dubbele extractie van eCB's/PR's en RNA voor kwantitatieve profilering van muizenhersenenstoten. (A) Kwantitatieve verdeling van geselecteerde PR's en eCB's over: 1) een subregio van de hypothalamus (HYP); 2) de basolaterale amygdala (BLA); en 3) de ventrale (vHC) en dorsale (dHC) subregio's van de hippocampus, van de KA-geïnduceerde epileptische aanvalsmuizen (bovenste waarde) versus de controles (lagere waarde) (n = 10). De niveaus worden genormaliseerd naar het weefselgewicht (stoten komen overeen met ongeveer 0,5−1,5 mg) en uitgedrukt in nmol/g. Alleen AEA wordt uitgedrukt in pmol/g. De lipideniveaus worden gepresenteerd als gemiddelde waarde ± SEM. Gemiddelde variatie per gestanst hersengebied (SEM als percentage van het gemiddelde, gemiddeld over alle lipiden) is: HYP = 7,83%; BLA = 7,80%; vHC = 6,28%; en dHC = respectievelijk 7,90%. (B) Relatieve expressieniveaus van endogene enzymen en receptoren die betrokken zijn bij lipidesignalering, evenals markers voor hersenactiviteit onderzocht op mRNA-niveau in verschillende hersengebieden / subregio's van muizen die werden onderworpen aan KA-geïnduceerde epileptische aanvallen (rood) en controles (lichtgrijs). Statistische analyses van het verschil tussen groepsmiddelen werden uitgevoerd met behulp van de tweezijdige ongepaarde Student's t-test en beschouwd als significant bij een p-waarde <0,05 (n = 10). Deze gegevens werden oorspronkelijk gepubliceerd in Lerner et al.7Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Immunohistochemische NeuN en CASP3 dubbele kleuring. Vijf dagen na DE KA-injectie werd immunohistochemie uitgevoerd op hersensecties van onbehandelde zoutoplossing-geïnjecteerde muizen (links), subchronisch PEA voorbehandelde muizen (midden) en epileptische muizen zonder voorbehandeling (rechts). PEA-voorbehandeling vertoont neuroprotectieve effecten in vergelijking met onbehandelde epileptische muizen (n = 3). Deze gegevens werden oorspronkelijk gepubliceerd in Post et. al.13Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De neurolipidomische en transcriptomische methodologie die hier wordt beschreven, is een levensvatbaar middel om elke ziekte of gezonde ontwikkeling bij hoge en lage ruimtelijke resolutie in de hersenen en perifere organen te onderzoeken. Vanwege de geoptimaliseerde plasmabemonsterings- en behandelingsprocedures kan plasmalipomische analyse ook worden uitgevoerd van dezelfde dieren die zijn opgeofferd voor weefsellipomica en transcriptomica, waardoor de betrouwbaarheid van moleculaire correlaten van weefselbloed en de ontdekking van biomarkers wordt verbeterd. Het verstrekken van een brede set gegevens door toepassing van een van de drie protocollen of combinaties daarvan, is van waarde om niet alleen een neurologische ziekte binnen een context (diermodelexperiment) maar ook over en tussen experimentele modelcontexten te onderzoeken. Bovendien vergemakkelijkt een hoog niveau van standaardisatie van bemonstering, verwerking en moleculaire analyse een hoge reproduceerbaarheid van moleculaire gegevens, waardoor moleculaire veranderingen tussen en binnen studies en laboratoria betrouwbaar worden verwezen.
Om dit te bereiken, is het echter van cruciaal belang om een experimenteel ontwerp op te zetten dat het maximale uitleespotentieel biedt voor het gedefinieerde studiedoel. Om een betrouwbare vergelijking van de moleculaire veranderingen tussen experimentele groepen te bereiken, wordt aanbevolen om minimaal tien dieren te gebruiken om de dierlijke variabiliteit en het biologische bereik van lipideniveaus te compenseren. Wanneer de aankoop van dieren en/of de logistiek van de omgang met dieren beperkend zijn, is het gebruik van minimaal zes dieren per groep noodzakelijk om een betrouwbare statistische analyse mogelijk te maken. Groepsgrootteberekeningen moeten compenseren voor modelgerelateerde sterftecijfers (d.w.z. een minimum van zes, idealiter tien, dieren per groep zijn vereist voor het onderzoek, ondanks het mogelijke sterftecijfer van het model). Een essentiële vereiste is om ervoor te zorgen dat dieren per experimentele groep op leeftijd, geslacht en stam overeenkomen. Voor de ontdekkingsfase is het essentieel om dezelfde aanbieder voor proefdieren te gebruiken voor alle studies en dezelfde dierbatch indien mogelijk, om vertekening van de bevindingen als gevolg van mogelijke gedrags- en moleculaire fenotypeverschillen tussen dierlijke batches te voorkomen. Om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van het moleculaire en gedragsfenotype dat in de studies is bepaald, te garanderen, is het van cruciaal belang om waar mogelijk een biologische replicaatanalyse uit te voeren.
Een andere cruciale stap is het opzetten van een gestandaardiseerd, gepland experimenteel werk met diergroepen. Het is noodzakelijk om de dieren binnen hetzelfde tijdsbestek van de dag te behandelen om circadiane moleculaire variabiliteit te omzeilen. Het tijdstip van de dag moet worden ingesteld op basis van de bekende impact van het circadiane ritme op de synthese en afbraak van de doelmoleculen of consistent worden gehouden voor alle experimentele groepen wanneer er geen informatie over circadiane ritme-effecten beschikbaar is. Evenzo moeten de huisvestings- en voedingsomstandigheden voorafgaand aan het offeren van dieren consistent en strikt gecontroleerd worden in alle experimentele modellen. Dit is met name relevant voor lipidomische profilering vanwege de invloed van voeding op lipideplasma en weefselmetabolisme. Toediening van therapeutische of ziekte-inducerende geneesmiddelen moet steevast parallel aan de toediening van het voertuig in controlegroepen worden uitgevoerd, waarbij het voertuig hetzelfde moet zijn als het voertuig dat wordt gebruikt voor de toediening van het geneesmiddel. Om de meest geschikte knaagdierstam en/of substrains voor het doel van het onderzoek te kiezen, moeten de op geneesmiddelen gebaseerde behandelingsstrategieën worden uitgevoerd op basis van de geneesmiddelspecificiteit in termen van tijd en frequentie van toediening, doses en toedieningsweg, en de specifieke gevoeligheid voor geneesmiddelen van verschillende stammen die zijn afgeleid uit literatuur en/of eerdere ervaring. Een tijdsverlooponderzoek van een ziekte en respons op therapie waarbij grote cohortgroepen of meerdere diergroepen betrokken zijn, is onmogelijk om in één dag uit te voeren in termen van behandeling, opoffering en bemonstering. In dergelijke gevallen moet de verwerking van diergroepen in opeenvolgende dagen worden gepland en uitgevoerd, maar met behoud van dezelfde omstandigheden in termen van tijdstip van de dag, experimenteel ontwerp, verwerkingstijd, onderzoekers, enz. De bereiding van chemische injecties is een andere kritieke stap. Geneesmiddel- of ziekte-inducerende verbindingen moeten vóór toediening vers worden bereid en volgens de specificaties van het geneesmiddel. Het gebruik van dezelfde productiebatch van het medicijn wordt aanbevolen voor alle cohorten die moeten worden vergeleken. Dit is vooral belangrijk in het geval van natuurlijke samengestelde formuleringen zoals kaïnzuur (KA) die in deze studie worden gebruikt voor epilepsie-inductie.
Om betrouwbare lipidomische en/of transcriptomische profilering mogelijk te maken, moet de opofferingsprocedure voor dieren binnen een tijdsbestek van 5 minuten consistent worden uitgevoerd in de diergroepen. Als bloed wordt verzameld na onthoofding, is het belangrijk om een constante hoeveelheid isofluraan in de glazen kamer te behouden. Voor dit doel, week vaak (na vijf keer gebruik) met isofluraan en niet meer dan 10 s voor de duur van de anesthesie met behulp van isofluraan, om het begin van aritmie en hartkloppingen te voorkomen en te zorgen voor een goede bloeddruk voor plasmabemonstering.
De voorwaarden voor de bemonstering en hantering van biologisch materiaal (bv. het tijdsvenster en de volgorde van bemonstering en hantering van biologisch materiaal) moeten strikt worden nageleefd en voor alle groepen identiek worden gehouden. Om variabele graden van weefselontdooding en dus inconsistente ex vivo weefselveranderingen van lipide- en/of mRNA-niveaus te voorkomen, is het essentieel om strikt gecontroleerde tijd- en temperatuuromstandigheden te handhaven voor post-sampling
opslag. weefseldissectie of ponsen, en daaropvolgende monsterverwerking en -analyse (zie rubrieken 3 en 4). Vers bemonsterde hele hersenen kunnen onmiddellijk worden ontleed op een voorgekoelde metalen plaat (4 °C) zonder voorafgaande snapfreezing, als de grootte van de experimentele diergroepen het offeren, verwijderen en dissectie van dieren mogelijk maakt zonder het hier voor elk van deze procedures aangegeven tijdsbestek te wijzigen. Als de grootte van experimentele groepen niet praktisch is voor deze procedures, wordt het vastvriezen van de hersenen en de daaropvolgende dissectie aanbevolen om vergelijkbare en gecontroleerde verwerkingstijd mogelijk te maken. Bij het strikt volgen van de protocollen en tijdlijnrichtlijnen die hier zijn aangegeven, werden geen discrepanties waargenomen tussen moleculaire niveaus verkregen door extractie van vers ontleedde hersengebieden en hersengebieden ontleed uit bevroren hersenen.
Een cruciaal aspect voor het bereiken van reproduceerbare en minimale variabiliteit van de lipideniveaus binnen en tussen groepen, afgezien van de monsterverwerking onder strikt gecontroleerde temperatuuromstandigheden, is de levering van antioxidanten (zie rubrieken 2 en 3). Het vermijden van stressfactoren (bijv. De geur van bloed) van de dieren voorafgaand aan het offeren is van het grootste belang, omdat veel lipiden die betrokken zijn bij neuronale activiteit zoals eCB's snel kunnen veranderen als reactie op stress.
Voor lipide-extractie en -analyse is het essentieel om de interne normen, kalibratieoplossingen en extractiemiddelen op de dag van de extractie vers te bereiden. Dezelfde bron van interne normen moet worden gebruikt voor zowel de voorbereiding van de kalibratiecurve als voor monsterextracties. Ook het volgen van strikt gecontroleerde temperatuuromstandigheden voor monsterextractie, opslag en analyse is van het grootste belang om ex vivo enzymatische of chemische veranderingen van moleculen te minimaliseren en te beheersen. Voor LC/MRM-analyse kan de set gerichte lipiden worden afgestemd op het onderzoeksdoel door doelen en dienovereenkomstig interne normen en kalibraten toe te voegen of te verwijderen, op voorwaarde dat de scheiding, detectie en MRM-overgangen voor een nieuwe set lipiden worden geoptimaliseerd. De gepresenteerde extractieprotocollen maken het mogelijk om twee LC/MRM-replicaties voor eCB's en eIC's te leveren, wat van groot belang is voor gevallen van technisch falen of wanneer replicatieanalyse van belang is voor het onderzoek. PL-extractieprotocollen maken monster-/extracthoeveelheden geschikt voor ten minste 10 analyses per extract (bijv. meerdere scanexperimenten op basis van respectievelijk precursorionen- en neutrale verliesscans2; aanvullende LC/MRM-analyses; of LC/MRM-replicaties om technische storingen tijdens een run te compenseren). De lipidenanalyse is niet beperkt tot LC/MRM; in feite zijn de lipide-extracten verkregen met een van deze protocollen vatbaar voor ongerichte, high-end massaspectrometriy-analyse. Met uitzondering van hersenstoten of minieme hoeveelheden weefsels verkregen uit afzonderlijke regio's (minder dan 3 mg), kunnen bevroren verpulverde weefsels van gebieden groter dan 2−3 mg worden gealiquoteerd en gebruikt voor meerdere extractiemodules zoals hier beschreven voor replicatieanalyse en /of voor andere onderzoeken die vatbaar zijn voor weefselpoeder.
Een algemeen voordeel van de hier beschreven protocollen in vergelijking met veelgebruikte protocollen is de verhoogde algehele tijdseffectiviteit en gevoeligheid voor multicompound extractie en analyse tegen lagere uitgaven van dierlijke hulpbronnen, verbruiksartikelen en analysekosten. Belangrijk is dat het duale lipide / mRNA-extractieprotocol ook een hogere efficiëntie van mRNA-extractie20,21 en integriteit van het mRNA biedt in vergelijking met overeenkomstige beschikbare standaardprotocollen, en tegelijkertijd een verhoogde efficiëntie van de lipide-extractie7. Dit is waarschijnlijk ook te wijten aan het verminderde matrixeffect voor elk van de lipide- en mRNA-fracties wanneer dubbel geëxtraheerd. Hierdoor is de methode gemakkelijk toepasbaar voor profilering met een hoge ruimtelijke resolutie, zoals bij hersenstoten.
Een huidige beperking van het protocol is echter dat de inflammatoire lipiden niet vatbaar zijn voor analyse en kwantificering met behulp van de dubbele lipide / mRNA-extractie. Het protocol is dus onderhevig aan verdere verfijning. Hiertoe kunnen weefsel- en plasma-inflammatoire lipiden en endocannabinoïden samen worden geëxtraheerd en geanalyseerd, wat een geoptimaliseerd hulpmiddel is om tegelijkertijd neuro-inflammatoire processen en endocannabinoïden-gemoduleerde neuronale activiteit te onderzoeken (zie co-extractie van eiCs en eCB's). Opname van fosfolipiden in deze laatste test zal naar verwachting haalbaar zijn.
Met het oog op prospectieve multi-omische benaderingen voor neurologische aandoeningen, wordt verwacht dat de proteomische analyse van eiwitfracties verkregen na het lipide-extractieprotocol (d.w.z. co-extractie van eCB's en eIC's, evenals co-extractie van PR's en eCB's) haalbaar zal zijn. Dit is echter nog niet mogelijk bij gebruik van het dual lipide/mRNA protocol. Voor de laatste sluit de chemische omgeving van de extractie zelfs bepaling van de eiwithoeveelheid uit met behulp van standaard eiwittests zoals de bicinchoninezuurtest (BCA). Verdere ontwikkelingen om deze beperking te overwinnen en de opname van proteomische profilering in deze protocollen te versnellen, zijn gepland.
Met behulp van het hier beschreven modulaire protocol was het mogelijk om een regionale hersenkaart van EIC's, eCB's en PR's te verkrijgen in een diermodel van acute epileptische aanvallen (figuur 4). Het protocol toonde de hippocampusmodulatie van ontstekingsprocessen door eiCs en van neuronale activiteitsmodulatie door eCB's bij behandelde en onbehandelde muizen met KA-geïnduceerde acute aanvallen13. Subregionale hersenlokalisatie van fosfolipide, endocannabinoïde en mRNA-veranderingen bij respectievelijk acute epileptische aanvallen werden ook waargenomen (figuur 5). Deze resultaten benadrukken de waarde en toepasbaarheid van de hier beschreven methoden bij het bevorderen van de kennis over een breed spectrum van lipiden die betrokken zijn bij modulatie van een complexe neurologische ziekte zoals epilepsie in hersengebieden en subregio's. Deze protocollen zijn van algemene toepasbaarheid in neurologisch ziekteonderzoek en daarbuiten, terwijl de verdere ontwikkeling van de protocollen en toepassingen voor celpopulaties doorgaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We dragen dit artikel op aan Dr. Ermelinda Lomazzo. Tijdens de voltooiing van dit manuscript overleed Dr. Ermelinda Lomazzo. Ze is de belichaming van passie voor wetenschap en onbaatzuchtige betrokkenheid bij teamwerk om een zinvol onderzoeksdoel te vervullen. Ze heeft er altijd van gedroomd om een zinvolle bijdrage te leveren aan het grotere welzijn van de mens. Haar goedhartige aard werd nooit aangetast door de inspannende wegen van wetenschap en leven. Ze zal van onschatbare waarde blijven, en voor altijd, in onze harten.
Julia M. Post werd gefinancierd door focusprogramma voor translationele neurowetenschappen (FTN) aan het Universitair Medisch Centrum van de Johannes Gutenberg Universiteit Mainz en wordt momenteel gefinancierd door het SPP-2225 EXIT-project aan LB. Raissa Lerner werd gedeeltelijk gefinancierd door DZHK-project 81X2600250 naar LB en Lipidomics Core Facility. Gedeeltelijke financiering voor deze studies werd verstrekt door de Lipidomics Core Facility, Institute of Physiological Chemistry en Intramurale fondsen (aan LB) van het Universitair Medisch Centrum van de Johannes Gutenberg Universiteit Mainz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
- Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
- Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
- Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
- Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
- Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
- Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J.
- Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
- Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
- Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
- Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
- Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
- Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
- Konsman, J. P.
- Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).
- Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
