Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lipidomik och transkriptomik vid neurologiska sjukdomar

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/59423
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Summary

Denna artikel presenterar ett modulärt protokoll för vävnad lipidomics och transkriptomics och plasma lipidomics i neurologiska sjukdom mus modeller som riktar sig till lipider underliggande inflammation och neuronal aktivitet, membran lipider, nedströms budbärare och mRNA-kodning enzymer/receptorer underliggande lipid funktion. Provtagnings-, provbearbetnings-, extraktions- och kvantifieringsförfaranden beskrivs.

Abstract

Lipider fungerar som det primära gränssnittet till hjärnförolämpningar eller stimuli som främjar neurologiska sjukdomar och är en reservoar för syntes av lipider med olika signalerings- eller ligandfunktion som kan understryka uppkomsten och progressionen av sjukdomar. Lipider förändras ofta på presymtomatisk nivå och är en framväxande källa till läkemedelsmål och biomarkörer. Många neurologiska sjukdomar uppvisar neuroinflammation, neurodegeneration och neuronal excitabilitet som vanliga kännetecken, delvis modulerade av specifika lipidsignaleringssystem. Det ömsesidiga beroendet och sambandet mellan syntes av olika lipider föranleder en multilipid, multienzym och multireceptor analys för att härleda commonalities och specificiteter av neurologiska sammanhang och att påskynda upplösningen av mekanistiska aspekter av sjukdom debut och progression. Att tillskriva lipidroller till distinkta hjärnregioner främjar bestämningen av lipidmolekylär fenotyp och morfologi i samband med en neurologisk sjukdom.

Presenteras här är ett modulärt protokoll som lämpar sig för analys av membran lipider och nedströms lipid signaler tillsammans med mRNA av enzymer och medlare som ligger till grund för deras funktionalitet, extraheras från diskreta hjärnregioner som är relevanta för en viss neurologisk sjukdom och /eller villkor. För att säkerställa korrekt jämförande lipidomisk profilering optimerades och standardiserades arbetsflöden och driftskriterier för: i) hjärnprovtagning och dissekering av regioner av intresse, ii) samextraktion av flera lipidsignaler och membranfetter, iii) dubbel lipid/mRNA-extraktion, iv) kvantifiering genom vätskekromatografi multipla reaktionsövervakning (LC/MRM) och v) standard mRNA-profilering. Detta arbetsflöde är mottagligt för de låga vävnadsmängder som erhålls genom provtagning av de funktionellt diskreta hjärnans subregioner (dvs. genom hjärnslagning), vilket förhindrar partiskhet i multimolekylär analys på grund av vävnads heterogenitet och/eller djurvariation. För att avslöja perifera konsekvenser av neurologiska sjukdomar och upprätta translationella molekylära avläsningar av neurologiska sjukdom stater, perifera organ provtagning, bearbetning och deras efterföljande lipidomic analys, liksom plasma lipidomics, också eftersträvas och beskrivs. Protokollet demonstreras på en akut epilepsi mus modell.

Introduction

De senaste framstegen i lipidernas funktion och deras roll i uppkomsten och progressionen av neurologiska sjukdomar öppnar nya forsknings- och utvecklingsplatser för nya terapeutiska mål och sjukdomsmekanismer klargörande1. Dokumenterade skillnader i lipidsammansättning i olika hjärnregioner, betonade av moderna molekylära bildframställningstekniker som masspektrometri imaging och avancerad masspektrometri profilering, skiftar paradigmet för lipid undersökning från hela hjärnan mot funktionellt distinkta och diskreta hjärnregioner. Det faktum att lipidsammansättning varierar i olika hjärnregioner föranleder ny konceptualisering av både membranfettkänslighet och nedströms lipidsignalering som svar på en hjärnförolämpning eller stimuli över de funktionellt distinkta hjärnregionerna. Därför kräver lipidprotokoll ny utveckling för att ta itu med utmaningen med låga vävnadsmängder för högre rumslig upplösning upptäckt och kvantifiering, och samtidigt analys av flera lipidkomponenter i cellmembran och signalvägar. Också, bestämning av enzymer, lipid ligands, och receptorer som är involverade i regleringen av deras nivåer och funktion är av största vikt för att klargöra signalvägarna som påverkas i en neurologisk sjukdom och vägleda nya mekanistiska undersökningar i ett patofysiologiskt sammanhang.

Förutom den ökade hjärnans rumsliga upplösning finns det två stora svårigheter som utmanar utvecklingen av nya neurolipidomic metoder. För det första är lipidsignaleringsmolekylerna vanligtvis av mycket lågt överflöd jämfört med membrankonstituerande lipider. För det andra uppvisar lipidomet en hög strukturell heterogenitet, svår att dissekera med ett enda analytiskt tillvägagångssätt. Därför är extraktions- och analysmetoder skräddarsydda för olika lipidkategorier och utförs ofta i distinkta vävnadsprover2. Hagelgevär lipidomiska metoder3 är utmärkta verktyg för att snabbt avslöja en bred profil av membranfetter, medan ökad känslighet och selektivitet som erbjuds av de riktade metoderna för upptäckt och kvantifiering av masspektrometri utnyttjas för undersökning av låga rikliga signallipider inklusive: i) inflammatoriska lipider och ii) lipider som är involverade i modulering av neuronal aktivitet, såsom endocannabinoider (eCBs), aminosyralänkade lipider, etc.4,5. För att omfatta lipidförändringar vid både cellmembranet och signalnivån som förekommer i hjärnregioner av neurologiska sjukdomsmodeller utförs vanligtvis lipidutvinning och analys i distinkta vävnadsprover, erhållna från distinkta djurpartier eller från olika halvklot, eller genom att dissekera en större vävnadsregion i flera bitar. När mRNA-nivåer av enzymreceptorer också är av intresse, kräver deras undersökning vanligtvis upphandling av ett distinkt vävnadsprov. Till exempel skulle undersökningen av membranfetter, endogena cannabinoider och mRNA kräva tre olika vävnadsprover (t.ex. två prover för de två lipidutvinningsmetoderna-membranlipider och signalerande lipider - och efterföljande två lipidanalysmetoder - och ett prov för mRNA-analys). Undersökning av inflammatoriska lipider och endogena cannabinoider kräver två distinkta vävnadsprover, extraktionsmetoder respektive analysmetoder. Ett annat exempel är undersökningen av mRNA och av alla lipidkategorier i en hjärnstans eller lasermikrodissectionprov som följaktligen kräver två distinkta djur för att anskaffa två prover per hjärna (sub)region. En betydande grad av variabilitet och/eller dålig reproducerbarhet av resultaten förekommer ofta i sådana fall, med ursprung i biologisk variabilitet och/eller vävnads heterogenitet. Vägledd av dessa praktiska begränsningar av multimolekylär analys, som förekommer särskilt vid hög rumslig upplösning i hjärnan, utformades ett tremoduls neurolipidomics protokoll som omfattar: 1) samextring och samanalys av LC/MRM av inflammatoriska lipider (t.ex. eicosanoids (ecs)) och lipider som är involverade i modulering av neuronal aktivitet, såsom eCBs2; 2) samextraktion av fosfolipider (PLs) och eCBs med efterföljande multiscan LC/MRM och analys av prekursor/neutral förlustskanning2; och 3) dubbel extraktion av membran (fospho)lipider och eCB samt mRNA, med efterföljande LC/MRM och qPCR- eller RNA-sekvenseringsanalys6. Beroende på den biologiska fråga som ska tas upp vid en neurologisk sjukdom och hjärnregionen av intresse kan en kombination av det första och det andra protokollet, eller det första och det tredje protokollet, tillämpas på samma vävnadsprov för vävnader som väger cirka 4 mg. Det första och tredje protokollet kan tillämpas självständigt för vävnader runt 2 mg. Det andra protokollet kan tillämpas för vävnader som väger så lite som 0,5 mg. Oavsett vilken neurolipidomisk protokollmodul som valts är vävnadsprovtagning och föranalysbehandling, hjärnisolering och region dissekering, liksom förfarandet för att offra djurmodellen standardiserade och identiska för alla tre modulerna i protokollet. I vår undersökning av neurologiska sjukdomar samlas perifera organ som är relevanta för sjukdomens patologiska konsekvenser alltid också in och analyseras med hjälp av dessa modulära protokoll. Dessutom provtas blod regelbundet för plasmafetter för att fungera som ett avläsningsverktyg för neurologiska sjukdomar med tanke på framtida translationella tillämpningar. Det här presenterade modulära lipidomics protokollet är mycket mångsidigt: skalbar till större vävnad mängder och lätt tillämplig för praktiskt taget alla vävnad typ och sjukdomar. För tillämpning av modulprotokollet (Bild 1) vid neurologiska sjukdomar är alla standardiserade gnagare modeller av debut och progression av neurologiska störningar, såsom traumatisk hjärnskada, Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom eller epilepsi mottagliga.

Dessa protokoll har tillämpats i stor utsträckning för att studera förändringar i vävnadsfettsom och/eller transkriptom i den akuta fasen av epilepsi i kainisk syra (KA)-inducerad musmodell av epilepsi2,7, en modell som ofta används i prekliniska studier på grund av likheten med human temporallob epilepsi (TLE)8,9,10,11. Med hjälp av dessa protokoll bedömdes den terapeutiska potentialen hos läkemedel som Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 i samma musmodell av epilepsi. Studien identifierade lipid- och mRNA-förändringar vid hög och låg rumslig upplösning i hjärnan och periferin, vid tidpunkten för maximal akut anfallsintensitet (vid 60 min posteizureinduktion) och vid subkronisk och akut behandling med PEA vid fyra olika tidpunkter (20, 60, 120 och 180 min) efter KA-anfallsinduktion, ett tidsfönster som täcker den akuta fasen av epilepsi. Plasma, hjärnor och perifera organ hos obehandlade KA-injicerade möss, akut och subkroniskt PEA-behandlade möss, liksom fordon och PEA-fordon kontroll möss, samlades in vid varje tidpunkt12,13, och undersöktes med denna molekylära analys. De molekylära data var korrelerade med beteendemässiga fenotyper som erhållits genom beslag poäng, liksom med immunohistochemistry-härledda data om neurodegenerativa processer, för att nysta upp progressionen av den akuta epilepsi fasen och PEA potential att lindra det.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla försöksförfaranden som beskrivs här är i enlighet med Europeiska gemenskapens rådsdirektiv av den 22 september 2010 (2010/63EU) och godkändes av den lokala djurkommittén i delstaten Rheinland-Pfalz, Tyskland (filreferens: 23 177-07/G16-1-075).

1. Djurmodell av akut och profylaktiskt behandlad KA-inducerad epilepsi

  1. Utför beslag induktion, behandling och beteendemässiga poängsättning.
    1. Separata möss (minst n = 6 möss per grupp) i enstaka burar.
    2. Förbered injektionslösning för anfallsinduktion och motsvarande fordon (se tabell 1), samt injektionslösning för behandling och motsvarande fordon (se tabell 2).
    3. Injicera möss intraperitoneally (dvs. 10 ml/kg muskroppsmassa) utan anestesi enligt deras gruppidentitet: sjukdom, behandlad eller fordonet som behandlas (dvs. KA, PEA-behandlad KA och de två fordonsgrupperna). Se figur 2, tabell 1 och tabell 2.
    4. Övervaka och poängsätta beteendet enligt följande standardiserade anfallsintensitetsskala: 0 = inget svar; 1 = orörlighet och stirrande; 2 = framben och/eller svansförlängning, styv hållning; 3 = repetitiva rörelser, huvudbobbing; 4 = uppfödning och fall; 5 = kontinuerlig uppfödning och fall; 6 = allvarliga kloniska-toniska anfall; 7 = död14,15 (figur 3).
  2. Utför offrande förfarande för lipidomisk och transkriptomisk analys.
    1. Vid fyra tidpunkter (dvs. 20, 60, 120 och 180 minuter efter KA- respektive fordonsinsprutning) offra sex möss från var och en av följande grupper: PEA-behandlat, PEA-obehandlat epileptiskt fordon 1 och fordon 2, enligt IACUC-godkända protokoll.
    2. Tio sekunder efter att varje tidspunkt har nåtts bedövar du mössen med hjälp av en isofluranindränkt vävnad i en glaskammare. Bekräfta anestesi genom förlusten av högerklickande reflex, indikerad av oförmågan att röra sig medan långsamt vända glaskammaren. Halshugg möss med kirurgisk sax och samla plasma, hjärna och perifera organ (se steg 2.2.2−2.2.4).
      VARNING: Etiska regler för att offra förfaranden varierar mellan lokala djurkommittéer. Se till att kontrollera och följa de föreskrifter som utfärdats av den lokala djurkommittén.
  3. Följ offerproceduren för immunohistokemisk analys.
    1. För immunohistochemical färgning13, beteendemässigt poäng tre möss från var och en av följande grupper: PEA behandlas, PEA-obehandlad epilepsi och fordonsgrupper, under hela tidskursen (180 min).
    2. Offra och perfuse möss 5 dagar senare. Bedöva möss (se steg 1.3.1 för musgrupperna) genom i.p. injektion av pentobarbital (100 mg/kg) och buprenorfin (0,1 mg/kg) som narkotiska läkemedel. Bekräfta djupbedövning genom förlust av reflex mellan tårna.
    3. Fäst musen på en polystyrenplatta och öppna omedelbart bröstkorgen med fin sax och standardtång. Ställ fjärilen i vänster hjärtkammare och skär det högra förmaket med fin sax.
    4. Justera pumpens hastighet och tryck till ett konstant peristaltiskt flöde med en hastighet av 2−3 ml/min. Perfusera med iskall fosfat buffrad saltlösning (PBS) i ~5 min. Byt om det, byt ut fjärilen.
      OBS: Med rätt perfusion börjar de inre organen (utom mjälten) bleka ut inom 1−2 min.
    5. Byt perfusion till iskall 4% paraformaldehydlösning (PFA) i ~5 min. Isolera hela hjärnor enligt beskrivningen i steg 2.2.2 och fixera för 24 h i 4% PFA-lösning vid 4 °C.
    6. Inkubera hjärnor i 30% sackaroslösning för 48 h vid 4 °C. Ta bort den överblivna sackarosen med ett torrt vävnadspapper och frys hjärnan på en metallplatta (-80 °C). Förvara hjärnorna vid -80 °C för färgningsprocedurerna13.

2. Provtagningsförfaranden för lipidomisk/transkriptomisk analys

  1. Förbered för provtagning.
    1. Förkylda EDTA-rör för plasmaprovtagning till 4 °C. Förkyl centrifug- och virvelapparaten till 4 °C. Förkyl metallplattan täckt med aluminiumfolie (för att knäppa frusen hjärna och/eller andra vävnader av intresse) på torris (-80 °C). Förkyl de märkta 2 ml- och 5 ml-rören på torris (-80 °C) för plasma alikvoter, frusen vävnad respektive hjärnsamling. Använd bärnstensrör för att skydda ljuskänsliga molekyler, såsom ecs.
    2. Rengör vävnadsprovtagnings- och isoleringsutrustningen (kirurgisk sax, rak vass fin sax, raka släta standardtångar, fina tångar med spegelfinish, böjda tångar och spatel, polystyrenskumplatta och nålar för fixering) med desinfektionsmedel (t.ex. 70% etanol).
  2. Provtagningsprotokoll
    1. Bestäm ordningen på provtagningen.
      1. Samla blod omedelbart efter halshuggning i förkylda 1 ml EDTA-rör (se steg 2.2.3).
      2. Ta bort hela hjärnan och snap frys omedelbart efter borttagning. Detta steg tar 1−2 min. Förvara frysta hjärnor vid -80 °C för vidare bearbetning (se steg 2.2.2).
      3. Avlägsna perifera organ av intresse (t.ex. lunga, hjärta, lever), inom 5 minuter efter hjärnborttagning, och snapfrys och lagra vid -80 °C för vidare bearbetning (se steg 2.2.4).
    2. Ta bort hjärnan för dissekering eller stansning. Denna procedur tar 1−2 min/hjärna.
      1. Efter halshuggning (se steg 1.2), börja göra ett mittlinjesnitt i huden med en fin sax. Frigör skallen genom att vända huden över ögonen. Nå till toppen av skallen och gör ett litet kaudala snitt som börjar i nivån av intraparietala ben. Undvik att skära genom hjärnan.
      2. Skär fast genom den mest främre delen av skallen mellan ögonen för att underlätta hjärnborttagning. Luta ena sidan av parietalbenet med böjda smala mönstertångar och bryt av. Upprepa det sista steget för den andra sidan.
      3. Ta bort hjärnhinnorna. Skjut en spatel under den främre delen av hjärnan (dvs. luktlampan) och luta hjärnan försiktigt uppåt. Skjut spateln längre ner för att bryta de optiska och andra hjärnskålsnerverna.
      4. Lyft hjärnan ur skallen och knäpp frys hela hjärnan omedelbart på en förkyld (-80 °C) metallplatta med den ventrala sidan vänd mot metallplattan (dorsal upp).
      5. Låt hjärnorna helt frysa och överföras till förkylda 5 ml-rör och lagra vid -80 °C tills hjärnregionerna dissekeras eller stansproceduren (se steg 3.1 och 3.2).
    3. Utför plasmaprovtagning.
      1. Spike förkylda EDTA-rör med 10 μL nyberedd indomethacin-utspädning till en målkoncentration på 10 μM.
      2. Samla upp bålblodet omedelbart efter halshuggning genom att försiktigt klämma in kroppen i förkylda EDTA-rör till en maximal blodvolym på 1 ml.
        OBS: Vid korrekt blodtryck krävs ingen klämning. Om blodvolymen är mindre än 1 ml, minska isfluraninkubationstiden för att möjliggöra korrekt blodflöde.
      3. Centrifugera omedelbart blodrören vid 2 000 x g i 10 min vid 4 °C.
      4. Avlägsna den resulterande övre plasmafasen och för multilipid analys definierade alikvoterade plasmavolymer i förkylda 2 ml-rör enligt följande: 50 μL för eBC/eiCs-analys, 30 μL för pc-analys och den återstående plasmavolymen som reservprov eller för andra typer av analyser.
      5. Förvara plasmaproverna vid -80 °C för ytterligare extraktion (se steg 4.1.2 och 4.1.4).
    4. Utför provtagning av perifera organ.
      OBS: Använd musanatomireferenser16 och dokumentation som tillhandahålls för de obligatoriska kurserna (FELASA) där djurutredare deltar för att identifiera de enskilda organen, deras bindväv och/eller blodkärl.
      1. Immobilisera muskroppen för att underlätta organborttagning med nålar. Gör ett ventralt mittlinjesnitt med en rak skarp sax i höjden av pubis. Använd trubbiga standardtångar för att fixera bukväggen medan du skär för att öppna bukhålan.
      2. Immobilisera huden för att tillåta avlägsnande av bukorgan med trubbiga tång. För hjärt- eller lungborttagning, fortsätt medialskärning i riktning mot bröstgrottan. Ta bort lungan och/eller hjärtat med fina tångar.
      3. Öppna brösthålan försiktigt för att undvika blödning. Skär bindväven och blodkärlen som förankrar respektive organ utan att skära genom organet.
      4. Överför vävnadsbitar omedelbart på förkylda metallplattor (-80 °C) och låt det frysa helt. Överför vävnadsbitar till förkylda rör och förvara vid -80 °C för vidare bearbetning (se steg 4.1).

3. Biologisk materialbearbetning

OBS: För samuttag av eCBs/eiCs använd 2 ml bärnstensrör som extraktionsrör och tillsätt i varje rör sju förkylda stålkulor. För samextraktion av PLs/eCBs och för dubbel lipid- och RNA-samutvinning, använd 2 ml RNAse-fria extraktionsrör spetsade med keramiska pärlor (Materialtabell).

  1. Utför hjärn dissekering och perifer organ bearbetning.
    OBS: Använd förstoringslampor för att öka hjärnans synlighet för dissekering.
    1. Rengör de kirurgiska verktygen, inklusive tången med superfina spetsar, 2x med 70% etanol.
    2. Överför de frusna hjärnorna från -80 °C till en Petriskål som innehåller förkyld fysiologisk buffert (pH 5.5) Se till att Petriskålen är vid 4 °C. Låt hjärnorna helt låsas upp för att tillåta dissekering. Testa noggrant med tång.
      VARNING: Håll inte hjärnan vid 4 °C längre än vad som krävs för upptining.
    3. Förkyl en metallplatta på is (4 °C) och täck den med våta vävnader som blötläggs i iskall fysiologisk buffert (pH 5.5) och överför hjärnan med ventral sida upp försiktigt på en förkyld (4 °C) metallplatta på is. Täck den med våta vävnader som blötläggs i iskall fysiologisk buffert (pH 5.5).
    4. Dissekera hjärnregioner inom högst 5 min med superfina spetstänger. Börja med hypotalamus (HYP) och vrid dorsalsidan upp för att fortsätta med höger sida. Isolera hippocampus (HCr), prefrontal cortex (PFCr), striatum (STRr) och hjärnbarken (cCTXr). Dissekera sedan vänster sida. Isolera hippocampus (HCl), prefrontal cortex (PFCl), striatum (STRl) och hjärnbarken (cCTXl). Dissekera lillhjärnan och thalamic regionen. Använd publicerade anatomiska referenser16,17 för identifiering av hjärnregioner.
    5. Överför varje dissekerad bit direkt på en aluminiumfolietäckt, förkyld metallplatta (-80 °C). Tillåt frysning och överför de isolerade hjärnregionerna i de märkta förkylda 2 ml-rören.
    6. Pulverisera vävnadsbitarna med hjälp av en vävnadspulvriserare (vid -80 °C), vilket undviker upptining av vävnaden. I kylrummet, alikvot vävnad pulver i märkta, förkylda extraktionsrör som innehåller keramiska pärlor eller stålbollar. För dubbel lipidomics/transcriptomics analys, väg vävnad pulver alikvoter i kylrummet. För lipidomik-endast analys, välj mellan normalisering till vävnadsvikt eller proteininnehåll. För den senare, fortsätt vidare utan vävnadsvägning.
    7. Skär de perifera organvävnaderna i bitar med en maximal vikt på 20 mg. Fortsätt med vävnadspulvrisering som i steg 3.1.6.
    8. Fortsätt med extraktion av vävnadsprover (se steg 4.1.1, 4.1.3 eller 4.1.5) eller förvara rör vid -80 °C för senare extraktion.
      OBS: Hjärnmatrisen kan också användas om studiedesignen tillåter. Metoden är dock mer lämplig för ett diskret och begränsat antal hjärnregioner, och det är inte praktiskt att dissekera och isolera alla ovan nämnda hjärnregioner inom den asatta tidsramen.
  2. Utför hjärnslagning.
    1. Montera hela, frusna hjärnor på monteringssystemet (Table of Materials) i kryostaten. Ställ in tjockleken på 50 μm och skiva i trimläge nära den intresseregion som är av intresse.
    2. Fläcka hjärnskiva (18−20 μm) med toluidinblå (0,1%−1%) som referens för att lokalisera underregionen av intresse. Inspektera de färgade skivorna med hjälp av ett mikroskop för att identifiera de områden som ska stansas. Använd en musatlas som referens för att hitta lämpliga anatomiska regioner i hjärnan16. Ta slag med en diameter på 0,8−1,0 mm med provkoratörer i förkylda rör.
    3. Väg frysta slag i kylrummet i märkta, förkylda 2 ml extraktionsrör som innehåller keramiska pärlor eller stålbollar. Använd bärnstensrör för eCB och eC co-extraction.
    4. Starta extraktionen (se steg 4.1.1, 4.1.3 eller 4.1.5) eller förvara rören vid -80 °C för ytterligare extraktion.
  3. Utför plasmabehandling.
    1. Placera de frysta plasmaproverna på is (4 °C) och låt dem tina (~20 min).
    2. Se till att plasman är helt ofryst innan extraktion påbörjas.
    3. Fortsätt med plasmautsugningsförfarandet (se steg 4.1.2 eller 4.1.4).
      OBS: Plasmaprover bör ligga kvar vid -80 °C tills de extraheras. Undvik cykler av upptining och återfrysning.

4. Förfaranden för extraktion

  1. Utför LLE-lipidkoktionsprotokoll (Liquid-Liquid) .
    1. Utför samextraktion av eCBs och eCCs från hjärnbitar, stansar eller vävnadspulverprover.
      OBS: Noggrann pipettering krävs under hela proceduren.
      1. Placera extraktionsrören som innehåller vävnadsproverna och sju stålkulor på is (4 °C). Tillsätt 600 μL iskall MTBE och 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) som innehåller de interna standarderna. Målkoncentrationen för de interna standarderna i den slutliga analysvolymen (50 μL) är följande: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3 000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/mL 1-AG-d5, 2,5 ng/mL PGF2α-d4 och 5 ng/mL för PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 respektive TXB2-d4.
      2. Tillsätt 400 μL 0,1 M myrsyra och homogenisera med en vävnad lyser (30 s-1 min). Centrifugera homogenatet i 15 minuter vid 5 000 x g vid 4 °C. Tillåt frysning av vattenfasen i 10 min vid -80 °C för att underlätta överföringen av den övre organiska fasen.
      3. Överför den organiska fasen i nya rör. Avdunsta under en mild ström av N2 vid 37 °C och rekonstituera i 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) för ytterligare analys.
      4. Förvara vattenfasen vid -20 °C eller -80 °C för ytterligare analys av proteinhalten.
    2. Utför samextraktion av eCB och eC från plasmaprover.
      1. Tina plasma alikvoter vid 4 °C. Tillsätt 800 μL MTBE och 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) som innehåller de interna standarderna (analoga med de som används för vävnadsanalys, se steg 5.1.1). Optimera den interna standardkoncentrationen för spikning med hjälp av referensplasmaprover.
      2. Tillsätt 600 μL 0,1 M myrsyra och virvelprover vid 4 °C i 2 min. Centrifugprover vid 4 000 x g i 15 min vid 4 °C.
      3. Överför den organiska fasen till nya rör, avdunsta under en mild ström av N2 vid 37 °C och rekonstituera i 50 μL ACN/H2O (1:1; v/v) för LC/MRM-analys.
        OBS: Undvik om möjligt lagring av torkade extrakt av eic och fortsätt omedelbart till LC/MRM-analys. Om lagring inte kan undvikas, tillgrip korttidsförvaring i endast 2−3 dagar vid 4 ° C med prover i LC-injektionslösningsmedel.
    3. Utför samextraktion av PLs och eCBs från hjärnregioner, stansar eller andra vävnadspulverprover.
      1. Placera extraktionsrören som innehåller vävnadsprover och keramiska pärlor på is (4 °C). Tillsätt 800 μL MTBE/MeOH (10:3; v/v) och 10 μL MeOH som innehåller de interna standarderna. Målkoncentrationen för de interna standarderna i den slutliga analysvolymen (100 μL) är följande: 150 ng/mL för PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4 000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 respektive 3 ng/mL PEA- d4.
      2. Tillsätt 200 μL 0,1 % myrsyra innehållande 25 μM tetrahydrolipstatin/URB597 och 50 μg/mL BHT. Homogenisera med vävnadshomogenisatorn (Materialtabellen) och centrifugera vid 5 000 x g och 4 °C i 15 minuter.
      3. Återvinn den övre organiska fasen i nya rör och avdunsta under en mild ström av N2 vid 37 °C. Rekonstruera i 90 μL MeOH och antingen lagra vid -20 °C eller -80 °C eller fortsätt med nästa steg.
      4. Tillsätt 10% H2O till en alikvot lipidextrakt (4.1.3.3) och injicera 10 μL i LC/MS för PLs analys. För ytterligare eCB-analys fortsätt med steg 4.3.5.
      5. Ta en alikvot av extraktet (4.1.3.3), avdunsta till torrhet och rekonstituera dig i ACN/H2O (1:1; v/v). Använd 20 μL för LC/MS-injektion för eCB-analys.
    4. Utför samextraktion av PLs och eCBs från plasmaprover.
      1. Tina plasma alikvoter vid 4 °C, tillsätt 1 000 μL MTBE/metanol (10:3; v/v) och 10 μL MeOH som innehåller interna standarder (analogt med steg 4.1.3) och virvel vid 4 °C i 1 min.
      2. Tillsätt 250 μL H2O och virvel i 45 min vid 4 °C. Centrifugprover i 15 minuter vid 5 000 x g och 4 °C. Återvinn den övre organiska fasen, avdunsta under en mild ström av N2 vid 37 °C och rekonstituera sig i 90 μL metanol för ytterligare LC/MS-analys. Förvara vid -20 °C eller -80 °C eller fortsätt till nästa steg.
      3. För PLs analys, tillsätt 10% vatten till en alikvot lipidextrakt (4.1.2.2).
      4. För eCB-analys, tillsätt 10% vatten till en alikvot av lipidextraktet (se 4.1.4.3), avdunsta till torrhet och rekonstituera i 50% ACN/H2O (1:1; v/v).
    5. Utför dubbel extraktion av RNA och lipider (samextraktion av PLs och eCB) från vävnadsprover.
      VARNING: Se till att du arbetar under RNA-fria förhållanden för att undvika RNA-nedbrytning.
      1. Tina vävnadspulver alikvoter eller hjärnklasar (vid 4 °C) och tillsätt 600 μL RLT-buffert innehållande 5 μM THL/URB597, 10 μg/mL BHT och 1% β-mercaptoethanol (för procentandelar av den slutliga volymen homogeniseringsbuffert, se steg 4.1) tillsammans med 200 μL 1-mercaptoethanol (för procentandelar av den slutliga volymen homogeniseringsbuffert, se steg 4.1) tillsammans med 200 μL μL 000 100-merkaptoetanol (för procentandelar av den slutliga volymen homogeniseringsbuffert, se steg 4.1) tillsammans med 200 μL μL 1-mercaptoethanol (för procentandelar av den slutliga volymen homogeniseringsbuffert, se steg 4.1) tillsammans med 200 μL μL 1-mercaptoethanol (för procentandelar av den slutliga volymen homogeniseringsbuffert, se steg 4.1) tillsammans med 200 μL μL 1-mercaptoethanol (för procentandelar av den slutliga volymen homogeniseringsbuffert, se steg 4.1) tillsammans med 200 μL μL 1-mercaptoethanol (för procentandelar av den slutliga volymen homogeniseringsbuffert, se steg 4.1) tillsammans med 200 μL μL 1
      2. Spetsprover med 10 μL intern standardblandning för PLs och eCB-samextraktion (se steg 4.1.3) och homogeniseras via vävnadshomogenisator (hög hastighet, 20 s).
      3. Överför lysates till nya centrifugrör och centrifuger i 5 min med full hastighet och 4 °C för att möjliggöra fasseparation.
      4. Återställ och använd den övre fasen för RNA-extraktion med hjälp av standard RNA-extraktionssatser (Table of Materials). Elute RNA i en total volym av 50 μL RNase-fritt vatten och förvara vid -80 °C.
        OBS: Provet i steg 4.1.5.4 är mottagligt för både RNA-sekvensering och qPCR med lämpliga metoder och instrumentering.
      5. Använd den nedre kloroforminnehållande fasen för lipidextraktion. Tillsätt 800 μL MTBE/metanol (10:3; v/v) och 200 μL 0,1% myrsyra och virvel i 45 min vid 4 °C. Återställ den övre organiska fasen och avdunsta under en mild ström av N2 vid 37 °C.
      6. Rekonstruera i 90 μL metanol för ytterligare LC/MS-analys. Förvara vid -20 °C eller -80 °C eller fortsätt till steg 5.
      7. Tillsätt 10% H2O till en alikvot lipidextrakt (se ovan steg 4.1.5.6) och injicera 10 μL i LC/MS för PLs analys. För ytterligare eCB-analys fortsätt med steg 5.7.
      8. Ta en alikvot av extraktet (se ovan steg 4.1.5.6) avdunsta till torrhet och rekonstituera i ACN/H2O (1:1; v/v). Använd 20 μL för LC/MS-injektion för eCB-analys (analogt med steg 4.3.5).

5. Kvalitativ och kvantitativ profilering av LC/MRM

  1. Förbered LC-lösningsmedelssystem, kalibreringslösningar och kvalitetskontroller.
    1. För PLs, förbered mobil fas A: metanol/vatten (1:1; v/v) som innehåller 7,5 mM ammoniumformat och 0,1% TE. Förbered mobil fas B: metanol/isopropanol (2:8; v/v) innehållande 7,5 mM ammoniumformat och 0,1% TE. Förvara lösningsmedel i LC-flaskor.
    2. För eCB- och eiC-separation, förbered följande LC-lösningsmedel: 0,1% myrsyra som mobil fas A och 100% ACN innehållande 0,1% myrsyra som mobila fas B. Förvara lösningsmedel i LC-flaskor.
    3. Förbered kvalitetskontroller med hjälp av kalibreringsstandarder och interna standarder (tabell 3) i en hästmolekylär eller användardefinierad koncentration.
    4. Förbered kalibreringskurvor med sju koncentrationspunkter. Använd samma interna standardbatch för att spika i kalibreringskurvans lösning och i prover som ska analyseras.
  2. Använd LC-MRM-metoden för kvalitativ och kvantitativ lipidprofilering.
    1. Öppna fliken Byggförvärvsmetod i den kommersiella programvaran (t.ex. analytiker) och välj LC/MRM-läge med polaritetsväxling. Ange jonövergångarna i metoden (enligt tabell 3) för kvantitativ profilering. Ställ in kvitteringstiden till 50 ms.
    2. För PLs profilering ställer du in följande jonkällaparametrar: gardingas = 40 psi; Källvärmarens temperatur = 550 °C; jonsprayspänning = -4 500 V i negativt jonläge och = +5 200 V i positivt jonläge.
    3. För samanalys av eCB och ebc: er, ställ in följande parametrar: gardingas = 40 psi; Källvärmarens temperatur = 550 °C; jonsprayspänning = -4 500 V i negativt jonläge och = +4 500 V i positivt jonläge.
    4. För PL-analys ställer du in kolonnuppvärmningen på 45 °C och flödeshastigheten till 200 μL/min och ställer in följande lutning: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B och min 52 = 40% B. Ställ in injektionsvolymen på 10 μL.
    5. För analys av eCB och eiCs ställer du in kolonntemperaturen vid rumstemperatur och ställer in följande gradient: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Ställ in injektionsvolymen till 20 μL.
      OBS: MRM-villkoren kan variera mellan instrumentella plattformar, därför måste fragmenterings- och MRM-villkor härledas experimentellt och joniseringsparametrar bör testas och justeras vid behov för att få maximal känslighet och selektivitet.
  3. Utför batchanalys.
    1. Öppna batchen Byggförvärv och fyll i de parametrar som krävs för exempelbeskrivning, plats i autosamplerns provställ och anskaffningsmetod (ange steg 5.2).
    2. Inkludera alltid kvalitetskontroller i början och slutet av analysen och inom batchen. Efter varje 25−30 prover, inkludera minst tre kalibreringskurvor i partiet och inkludera ett tvättsteg med ett lösningsmedel som väljs efter varje kvalitetskontrollprov, kalibreringskurva och i slutet av provpartiet.
    3. Överföringsprover som erhållits i steg 4 i LC/MS-injektionsflaska. Placera proverna i lastställen på LC autosampler enligt den position som definierats i partiet och ladda provstället i LC autosampler.
    4. Skicka batch- och startköanalys.
  4. Lipidkvantifiering
    1. Använd den kommersiella programvaran (t.ex. analytiker) och den inbäddade kvantifieringsmodulen för eCB och eiCs kvantifiering och kommersiell programvara (t.ex. Multiquant) för kvantifiering av PLs.
      OBS: Den andra programvaran kan också användas för eCBs och eiCs, särskilt när en intern standard används för kvantifiering av flera analyter.
    2. Öppna byggkvantifieringsmetoden och fyll i parametrarna för analyter, interna standarder, MRM-övergångar och tillskriva de interna standarderna till de analyter som ska kvantifieras (tabell 3). Ställ in den lägsta topphöjden på 500 cps.
    3. Använd följande kriterier eller kombinationer av dessa för tilldelning av lipididentitet och efterföljande kvantifiering6: retentionstidsmatchning av lipid endogena analyter med kalibreringsstandarder och/eller deutererade interna standarder, om sådana finns tillgängliga; Fragmentjonmatchning genom positiv och negativ jonlägesfragmentering för en given m/z lipidalyter för vilka inga standarder tillhandahålls. litteratur-anledd elution beteende av lipider under på samma sätt används LC villkor för att dissekera isomeric och/eller isobaric strukturer; och, i förekommande fall, LC/MS- och MS/MS-analys med högupplöst masspektrometri, med liknande LC-villkor som för riktad analys (med LC/MRM), för att korrekt identifiera identiteten och elueringsbeteendet hos endogena lipider av intresse18,19.
    4. För validering av batchanalys använder du följande kriterier: kvantifieringens noggrannhet ≤ ±20%; regressionskoefficient ≥0,97 (helst ≥0,99).
      OBS: Följ riktlinjerna för utveckling och validering av bioanalytiska metoder för att säkerställa en tillförlitlig, reproducerbar analys av målmolekylerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uppsättningen beskrivna protokoll kan kombineras på olika nivåer på ett målspecifikt sätt, t.ex. val av djurmodell, provtagningsväg, extraktionsmetod och profilering (figur 1).

För att bestämma lipid nivå förändringar i hjärnan och periferin under en tid kurs av ett akut epileptiskt anfall tillstånd och för att nysta upp den potentiella antiepileptiska effekten13 av PEA och dess inverkan på lipidom förändringar i hjärnan och periferin, tre experimentella djur grupper behandlades med fordon, KA för att inducera akut epilepsi och PEA som en antiepileptisk läkemedelskandidat. PEA administrerades via i.p. före KA- injektionen (t.ex. med en enda PEA-injektion för akut behandling och två PEA-injektioner för subkron behandling). För multipla molekylära analyser och/eller immunohistokemi färgning 5 dagar efter behandling upprepades djurförsöken efter behov (figur 2).

KA-induktion av akuta epileptiska anfall leder till en maximal anfallsintensitet 1 h efter injektion15 (figur 3). För att nysta upp hjärnan och perifera lipid nivå förändringar i tillståndet av maximal beslag intensitet, möss offrades vid 1 h efter KA-injektion, följt av plasma, hjärnan och perifera organ provtagning. Frysta hjärnor dissekerades i sex hjärnregioner (se steg 3.1). Hjärnregioner och perifera organvävnader (hjärta och lungor) pulveriserades för att erhålla homogena vävnadsprover och därefter alikvoterades för de två lipidomiska profilering av eCBs och eCCs (figur 4A och steg 4.1.1) och PLs och eCBs (figur 4B och steg 4.1.3).

Protokollet för dubbel extraktion (se steg 4.1.5) tillämpades för att utföra PLs/eCBs och RNA vid en högre rumslig upplösning via profilering från hjärnslag i olika regioner: hypotalamus (HYP), basolateral amygdala (BLA) och ventrala (vHC) och dorsala (dHC) hippocampus (figur 5). Slagprovet provtogs (se steg 3.2) från KA-inducerade epileptiska möss och kontrollmöss vid maximalt anfallstillstånd vid 1 h post-KA injektion (figur 2).

För att bedöma neurodegeneration omfattning och ascribe lipid förändringar i neurodegeneration utsträckning med epilepsi och vid ny epilepsi-behandling med PEA, immunohistochemical dubbel färgning utfördes på hjärnsektioner (se steg 1.3) provtog 5 dagar efter KA-inducerad epileptiska anfall (figur 2) hos möss utan subkron pea behandling (mitten), med subkron PEA behandling (höger) och i saltlösning-injicerade möss (vänster) (figur 6) ). KA-inducerad status epilepticus (SE) orsakade massiv förlust av NeuN signal, främst i CA1, CA3 och hilus regionen i hippocampus, åtföljd av apoptotiska händelser anges av caspase-3 (CASP3) signal (figur 6, mitten bild) jämfört med kontrollen (figur 6, vänster bild). Subchronic PEA-behandling (höger bild) särskilt bevarade neuronal atomkärnor protein (NeuN) signal, medan (CASP3) signal är knappt detekterbar.

KA- och SAL injektionslösning.
KA injektionslösning (8 ml slutlig volym):
1. Väg 24 mg KA i 15 ml rör (varning: använd glothes och mask)
2. Tillsätt 8 ml saltlösning och virvel i 10 min
3. Håll vid 4°C för intermdediate lagring
4. Rekonditionering till rumstemperatur och virvel före injektion
Fordons 1 injektionslösning (8 ml slutlig volym):
Hoppa över steg 1 och fortsätt med steg 2-4

Tabell 1: Beredning av applicering av beslag och fordon 1. Åtgärder för att förbereda kainsyrainsprutningslösningen (KA) för 24 intraperitoneala injektioner (10 ml/kg) i en slutlig koncentration på 30 mg/kg och motsvarande fordonsinsprutningslösning (fordon 1)1.

PEA- och SAL/DMSO/Cremophor (18:2:1, (v/v/v)) injektionslösning.
PEA injektionslösning (8 ml slutlig volym):
1. Väg 32 mg PEA i 15 ml rör
2. Tillsätt 0,4 ml DMSO och virvel i 10 min
3. Tillsätt 3,4 ml SAL och virvel i 5 min
4. Sonicate blandning i 5 min vid 36°C
5. Tillsätt 0,4 ml Cremophor och virvel i 5 min
6. Sonicate i 1 min vid 36°C och tillsätt 3,4 ml SAL
7. Vortex i 30 sek och sonicate i 3 min vid 36°C
8. Håll lösningen vid 36°C vid låg hastighet i skakapparat och virvel före injektion
Fordons 2 injektionslösning (8 ml slutlig volym):
Hoppa över steg 1 och fortsätt med steg 2-8

Tabell 2: Beredning av antiepileptiskt läkemedel och fordons 2-applicering. Exemplifierade steg för att förbereda palmitoylethanolamid (PEA) injektionslösning för 24 intraperitoneala injektioner (10 ml/kg) i en slutlig koncentration av 40 mg/kg och motsvarande fordonsinsprutningslösning (fordon 2)1.

Positivt jonläge
Utvalda PLs för kalibreringsstandarder Motsvarande interna standarder
Analyte Prekursorjon Produktjon m/z Analyte Prekursorjon Produktjon m/z
Namn m/z Namn m/z
AEA 348.3 62.1 AEA-d4 352.3 66.1
2-AG 379.1 287.2 2-AG-d5 384.2 287.2
OEA 326.2 62.1 OEA-d2 328.2 62.1
ÄRTA 300.2 62.1 ÄRTA-d4 304.2 62.1
PC 16:0/18:1 760.59 184.07 PC 17:0/14:1 718.54 184.07
PC 18:2_20:4 806.57 184.07
PC 18:0_20:4 810.6 184.07
LPC 18:0 524.37 184.07 LPC 17:0 510.36 184.07
LPC 20:4 544.34 184.07
SM d18:1/18:0 731.61 184.07 SM d18:1/12:0 647.51 184.07
Negativt jonläge
Utvalda PLs för kalibreringsstandarder Motsvarande interna standarder
Analyte Prekursorjon m/z Produktjon m/z Analyte Prekursorjon Produktjon m/z
Namn Namn m/z
AA 303.05 259.1 AA-d8 311.04 267
5(S)-HETE 319.48 115 5(S)-HETE-d8 327.48 116
8(S)-HETE 319.48 155 12(S)-HETE-d8 327.48 184
12(S)-HETE 319.48 179
15(S)-HETE 319.48 219
19(S)-HETE 319.48 231
20-HETE 319.48 289 20-HETE-d6 325.48 295
LxA4 351.5 115.2 LxA4-d5 356.5 115
PGF2 α 353.48 309.2 PGF2 α-d4 357.5 313.3
TxB2 369 169 TxB2-d4 373 173
PGE2 351.47 315.3 PGE2-d9 360.25 324.3
PGD2 351.47 315.3 PGD2-d4 355.25 319.3
11β-PGF2 α 353.24 193
RvD1 375.22 215.1 RvD1-d5 380.22 180.2
PE 16:0/18:1 716.52 281.25 PE 17:0/14:1 674.48 225.19
PE 38:4 766.54 303.23
PE 40:6 790.54 303.23
PE 40:4 794.57 303.23
PA 16:0/18:1 673.48 255.23 PA 17:0/14:1 631.43 269.25
LPA 16:0 409.24 153 LPA 17:0 423.25 153
LPA 20:4 457.24 153
LPI 20:4 619.29 303.23
PG 16:0/18:1 747.52 281.25 PG 17:0/14:1 705.47 225.19
PG 16:1_20:4 767.49 303.23
PG 18:1_20:4 795.52 303.23
PI 16:0/18:1 835.53 281.25 PI 17:0/14:1 793.49 269.25
PS 16:0/18:1 760.51 255.23 PS 17:0/14:1 718.47 269.25
PS 36:4 782.49 303.23
PS 38:4 810.53 303.23
PI 16:0/18:1 835.53 281.25 PI 17:0/14:1 793.49 269.25
PI 36:4 857.52 303.23
PI 38:4 885.55 303.23
C1P d18:1/16:0 616.47 78.9 C1P d18:1/12:0 560.41 78.9
S1P d18:1 378.24 78.9 S1P d17:1 364.23 78.9

Tabell 3: Lipidstandarder och MRM-övergångar för riktad lipidomikanalys. Tabellinnehåll publicerades ursprungligen i Lerner et al.2

Figure 1
Bild 1: Översikt över arbetsflödesmodulerna. Beroende på studiens syfte och olika provtagningsvägar kan extraktion och profilering kombineras för att möjliggöra ett betydande resultat för studien. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Experimentell utformning av akut kainsyra (KA) inducerad epileptisk anfallsmodell hos möss. Möss behandlas antingen med 1) Saltlösning (10 ml/kg i.p.); 2) KA (30 mg/kg i.p.); och/eller 3) (sub) kroniskt förbehandlad (1−2x 40 mg/kg i.p.) med den potentiella antiepileptiska föreningen Palmitoylethanolamide (PEA). Tjugofyra möss per grupp behandlades som ovan och beteende poängsattes för att utvärdera beslag intensiteter. Sex möss per grupp offrades vid var och en av de fyra olika tidpunkterna (T1−T4) för att bestämma lipid nivå förändringar under en tid kurs av akut epileptiska beslag tillstånd i hjärnan, perifera organ och plasma. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Beteendemässig poängsättning över en tidskurs av akut kainsyra (KA)-inducerad epilepsi kontra kontroller. Bedömning av beslag intensiteter över en tidsförlopp av 180 min post KA-beslag induktion (n = 24) eller saltlösning injektion (n = 24) anges som genomsnittliga beteendemässiga poäng. Inga skillnader hittades mellan de injicerade grupperna för fordon 1 och fordon 2. Felstaplar = SEM. ANOVA upprepad mätning gav betydande interaktioner mellan mätningarnas tidspunkter och testgrupperna, vilket indikerar signifikanta effekter av KA-behandling på beteendepoäng. Beslag intensiteter av KA-behandlade möss publicerades ursprungligen i Post et al.13Please klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Hjärnan och perifer vävnad lipidnivåer vid akut epileptiskt anfallstillstånd. Lipidnivåförändringar som presenteras som medelvärde ± SEM vid maximal anfallsintensitet (t.ex. 1 h post-KA injektion) över sex hjärnregioner (n = 9): hjärnbarken (cCTX), striatum (STR), thalamic region (THL), hippocampus (HC), hypotalamus (HYP), cerebellum (CER), samt hjärta och lungvävnad i KA-inducerad epileptiska möss (övre värde) och kontroller (lägre värde). De basala lipidnivåerna i vävnader avbildas i grått. Värdena för PLs, 2-AG och AA anges i nmol/g. respektive värdena för NAE, eiCs respektive AEA i pmol/g. Alla lipidnivåer normaliseras till vävnadsvikten. För att belysa de specifika molekylära förändringarna representeras lipidnivåerna hos de KA-behandlade mössen som procentandel av saltlösningsinsprutade (KA/sal) i en värmekarta som visar minskade värden vid akut anfallsintensitet jämfört med kontrollen avbildas i ljusblått och de ökade nivåerna jämfört med kontroll i rött. De anses vara betydande till ett p-värde <0,05. Dessa data publicerades ursprungligen i Lerner et al.2Please klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Dubbel extraktion av eCB/PLs och RNA för kvantitativ profilering från mushjärnslag. A) Kvantitativ fördelning av utvalda PLs och eCB över: 1) en underregion till hypotalamus (HYP). 2) den basolaterala amygdala (BLA); och 3) hippocampus ventrala (vHC) och dorsala (dHC) subregioner, från de KA-inducerade epileptiska anfallsmössen (övre värdet) jämfört med kontrollerna (lägre värde) (n = 10). Nivåerna normaliseras till vävnadsvikten (stansar motsvarar cirka 0, 5−1,5 mg) och uttrycks i nmol/g. Endast AEA uttrycks i pmol/g. Lipidnivåerna presenteras som medelvärde ± SEM. Genomsnittlig variation per stansad hjärnregion (SEM som procent av medelvärdet, medelvärdet över alla lipider) är: HYP = 7,83%; BLA = 7,80%; vHC = 6,28%; respektive dHC = 7,90 %. (B) Relativa uttrycksnivåer av endogena enzymer och receptorer som är involverade i lipidsignalering, samt markörer för hjärnaktivitet som undersöks på mRNA-nivå i olika hjärnregioner/subregioner från möss som utsätts för KA-inducerad epileptisk anfall (röd) och kontroller (ljusgrå). Statistiska analyser av skillnaden mellan gruppmedel utfördes med hjälp av den tvåsidiga oparade studentens t-test och ansågs signifikant till ett p-värde <0,05 (n = 10). Dessa data publicerades ursprungligen i Lerner et al.7Please klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Immunohistochemical NeuN och CASP3 dubbel fläck. Fem dagar efter KA injektion immunohistochemistry utfördes på hjärnan avsnitt från obehandlade saltlösning-injiceras möss (vänster), subkroniskt PEA förbehandlade möss (mitten) och epileptiska möss utan förbehandling (höger). PEA-förbehandling visar neuroprotektiva effekter jämfört med obehandlade epileptiska möss (n = 3). Dessa uppgifter publicerades ursprungligen i Post et. al.13Please klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den neurolipidomic och transkriptomic metodik beskrivs här är ett livskraftigt sätt att undersöka någon sjukdom eller hälsosam utveckling vid hög och låg rumslig upplösning i hjärnan och perifera organ. På grund av de optimerade plasmaprovtagnings- och hanteringsförfarandena kan plasmalipidsanalys också utföras från samma djur som offrats för vävnadslipis och transkriptomik, vilket förbättrar tillförlitligheten hos vävnadsblodmolekyler och biomarkörupptäckt. Tillhandahållandet av en bred uppsättning data genom tillämpning av något av de tre protokollen eller kombinationerna av dessa är av värde för att undersöka inte bara en neurologisk sjukdom i ett sammanhang (djurförsök) utan också över och mellan experimentella modellkontexter. Dessutom underlättar en hög nivå av standardisering av provtagning, bearbetning och molekylär analys hög reproducerbarhet av molekylära data, vilket på ett tillförlitligt sätt refererar till molekylära förändringar mellan och inom studier och laboratorier.

Men för att uppnå detta är installationen av en experimentell design som erbjuder maximal avläsningspotential för det definierade studiemålet avgörande. För att uppnå en tillförlitlig jämförelse av de molekylära förändringarna mellan försöksgrupper rekommenderas att använda minst tio djur för att kompensera för djurvariationer och det biologiska intervallet av lipidnivåer. När upphandlingen av djur och/eller logistiken för djurhantering är restriktiv är det absolut nödvändigt att använda minst sex djur per grupp för att ge en säker statistisk analys. Beräkningar av gruppstorlek måste kompensera för modellrelaterad dödlighet (dvs. minst sex, helst tio, djur per grupp krävs för studien trots modellens möjliga dödlighet). En kritisk förutsättning är att säkerställa ålders-, köns- och stammatchade djur per försöksgrupp. För upptäcktsfasen är det viktigt att använda samma leverantör för försöksdjur för alla studier och samma djursats om möjligt, för att undvika partiskhet av resultaten på grund av eventuella beteendemässiga och molekylära fenotypskillnader mellan djurpartier. För att säkerställa tillförlitlighet och reproducerbarhet av den molekylära och beteendemässiga fenotyp som bestäms i studierna är det viktigt att utföra en biologisk replikerad analys när det är möjligt.

Ett annat viktigt steg är att inrätta ett standardiserat, schemalagt experimentellt arbete med djurgrupper. Det är absolut nödvändigt att behandla djuren inom samma tidsfönster på dagen för att kringgå dygnsrytmernas molekylära variabilitet. Tiden på dagen bör ställas in enligt dygnsrytmens kända inverkan på syntesen och nedbrytningen av målmolekylerna eller hållas konsekvent för alla försöksgrupper när ingen information om dygnsrytmeffekter finns tillgänglig. På samma sätt måste inhys- och utfodringsförhållandena före djuroffer upprätthållas konsekventa och strikt kontrollerade mellan olika olika experimentmodeller. Detta är särskilt relevant för lipidomisk profilering på grund av påverkan av näring på lipidplasma och vävnadsmetabolism. Administrering av terapeutiska eller sjukdomsframkallande läkemedel bör alltid utföras parallellt med fordonsadministrationen i kontrollgrupper, varigenom fordonet måste vara detsamma som det som används för läkemedelsadministrationen. För att välja de lämpligaste gnagarstammen och/eller undertexterna för studien bör de läkemedelsbaserade behandlingsstrategierna genomföras i enlighet med läkemedlets specificitet när det gäller tid och frekvens för administrering, doser och administreringsväg samt de särskilda mottagligheterna för läkemedel av olika stammar som härleds från litteratur och/eller tidigare erfarenhet. En tidsförloppsundersökning av en sjukdom och svar på behandling som involverar stora kohortgrupper eller flera djurgrupper är omöjlig att utföra på en dag när det gäller behandling, uppoffring och provtagning. I sådana fall måste bearbetning av djurgrupper schemaläggas och utföras i på varandra följande dagar, men upprätthålla samma villkor när det gäller tid på dagen, experimentell design, bearbetningstid, forskare etc. Beredningen av kemiska injektioner är ett annat kritiskt steg. Läkemedels- eller sjukdomsframkallande föreningar måste vara nyberedd före administrering och enligt läkemedelsspecifikationerna. Användning av samma produktionssats av läkemedlet rekommenderas för att alla kohorter ska jämföras. Detta är särskilt viktigt när det gäller naturliga sammansatta formuleringar såsom kainsyra (KA) som används i denna studie för epilepsiinduktion.

För att möjliggöra tillförlitlig lipidomisk och eller transkriptomisk profilering måste djuruppoffringsförfarandet utföras konsekvent över djurgrupperna inom en tidsram på 5 minuter. Om blod samlas in efter halshuggning är det viktigt att bibehålla en konstant mängd isofluran i glaskammaren. För detta ändamål, blötlägg ofta (efter fem användningar) med isofluran och överskrid inte 10 s under anestesins varaktighet med isofluran, för att undvika uppkomst av arytmi och hjärtklappning och säkerställa korrekt blodtryck för plasmaprovtagning.

Villkoren för provtagning och hantering av biologiskt material (t.ex. tidsfönstret och ordningen för provtagning och hantering av biologiskt material) måste följas strikt och bibehållas som identiska för alla grupper. För att undvika varierande grader av vävnadsupptining och därmed inkonsekventa ex vivo-vävnadsförändringar av lipid- och/eller mRNA-nivåer är det viktigt att upprätthålla strikt kontrollerade tids- och temperaturförhållanden för efterprovtagning
lagring. vävnadsfördissekering eller stansning samt efterföljande bearbetning och analys av prover (se avsnitten 3 och 4). Nyprovade hela hjärnor kan omedelbart dissekeras på en förkyld metallplatta (4 °C) utan föregående snapfrysning, om storleken på de experimentella djurgrupperna möjliggör djuroffer, avlägsnande och dissekering utan att ändra den tidsram som anges här för var och en av dessa förfaranden. Om storleken på experimentella grupper inte är praktisk för dessa förfaranden rekommenderas snapfrysning av hjärnan och efterföljande dissekering för att möjliggöra jämförbar och kontrollerad tid för bearbetning. När strikt följa protokoll och tidslinje riktlinjer anges här, observerades inga avvikelser mellan molekylära nivåer som erhållits genom extraktion av nyligen dissekerade hjärnregioner och hjärnregioner dissekerade från frysta hjärnor.

En kritisk aspekt för att uppnå reproducerbar och minimal variabilitet av lipidnivåerna inom och mellan grupper, förutom provbehandlingen under strikt kontrollerade temperaturförhållanden, är tillhandahållandet av antioxidanter (se avsnitten 2 och 3). Att undvika stressfaktorer (t.ex. lukten av blod) hos djuren före uppoffring är av största vikt, eftersom många lipider som är involverade i neuronal aktivitet som eCB snabbt kan förändras som svar på stress.

För lipidutvinning och analys är det viktigt att nyligen förbereda de interna standarderna, kalibreringslösningarna och extraktionslösningsmedel på dagen för extraktionen. Samma källa till interna standarder skall användas både för beredning av kalibreringskurvan och för provextraktioner. Dessutom, efter strikt kontrollerade temperaturförhållanden för provextraktion, lagring och analys är av största vikt för att minimera och kontrollera ex vivo enzymatiska eller kemiska förändringar av molekyler. För LC/MRM-analys kan uppsättningen riktade lipider skräddarsys efter studiens syfte genom att lägga till eller ta bort mål och motsvarande interna standarder och kalibrar, förutsatt att separations-, detektions- och MRM-övergångarna för en ny uppsättning lipider optimeras. De presenterade extraktionsprotokollen gör det möjligt att tillhandahålla två LC/MRM-replikat för eCBs och eiCs, vilket är avgörande för fall av tekniskt fel eller när replikatanalys är av betydelse för studien. PL-extraktionsprotokoll gör prov-/extraktmängder lämpliga för minst 10 analyser per extrakt (t.ex. flera skanningsexperiment baserade på prekursorjon respektive neutral förlustskanning2, ytterligare LC/MRM-analyser, eller LC/MRM-replikat för att kompensera för tekniskt fel under en körning). Lipidanalysen är inte begränsad till LC/MRM. I själva verket lipid extrakt erhålls med något av dessa protokoll är mottagliga för untargteted, high-end massa spektrometriometriy analys. Med undantag för hjärnslag eller minimal mängd vävnader som erhållits från diskreta regioner (mindre än 3 mg), kan frysta pulveriserade vävnader i regioner större än 2−3 mg alikvoteras och användas för flera extraktionsmoduler som beskrivs här för replikatanalys och/eller för andra undersökningar som kan användas i vävnadspulver.

En allmän fördel med de protokoll som beskrivs här jämfört med vanliga är den ökade totala tidseffektiviteten och känsligheten för multikomponentutvinning och analys vid minskade utgifter för djurresurser, förbrukningsvaror och analyskostnader. Viktigt är att protokollet för dubbel lipid/mRNA-extraktion också ger en högre effektivitet av mRNA-extraktion20,21 och mRNA:s integritet jämfört med motsvarande tillgängliga standardprotokoll, och samtidigt ökad effektivitet av lipidutvinningen7. Detta beror sannolikt också på den minskade matriseffekten för var och en av lipid- och mRNA-fraktionerna när de extraheras i vederbörligt syfte. På grund av detta är metoden lätt tillämplig för hög rumslig upplösning profilering såsom i hjärnan stansar.

En aktuell begränsning av protokollet är dock att de inflammatoriska lipiderna inte är mottagliga för analys och kvantifiering med hjälp av den dubbla lipid/mRNA-extraktionen. Protokollet är således föremål för ytterligare förfining. För detta ändamål kan vävnads- och plasmainflammatoriska lipider och endocannabinoider sam extraheras och samanalyseras, vilket är ett optimerat verktyg för att samtidigt undersöka neuroinflammatoriska processer och endocannabinoider-modulerad neuronal aktivitet (se samtidiga eiCs och eCBs). Införande av fosfolipider i denna senare analys förväntas vara genomförbart.

Med tanke på framtida multi-omic metoder för neurologiska sjukdomar, den proteomiska analysen av protein fraktioner som erhållits efter lipid extraktion protokollet (dvs. sam-extraktion av eCBs och eiCs, samt sam-extraktion av PC och eCBs) förväntas vara genomförbar. Detta är dock ännu inte möjligt när du använder protokollet med dubbla lipid-/mRNA- För det senare utesluter den kemiska miljön för extraktionen även fastställande av proteinmängd med hjälp av standardproteinanalyser såsom bicinchonnic acid assay (BCA). Ytterligare utveckling för att övervinna denna begränsning och påskynda införandet av proteomisk profilering i dessa protokoll planeras.

Med hjälp av det modulära protokoll som beskrivs här var det möjligt att uppnå en regional hjärnkarta över ecs, eCBs och PLs i en djurmodell av akuta epileptiska anfall (figur 4). Protokollet visade hippocampal modulering av inflammatoriska processer av eiCs och av neuronal aktivitet modulering av eCBs i behandlade och obehandlade möss med KA-inducerade akut beslag13. Subregional hjärnlokalisering av fosfolipid, endocannabinoid och mRNA förändringar vid akut epileptiska beslag stater observerades också (figur 5). Dessa resultat belyser värdet och tillämpligheten av de metoder som beskrivs här för att främja kunskapen om ett brett spektrum av lipider som är involverade i modulering av komplexa neurologiska sjukdomar som epilepsi i hjärnregioner och underregioner. Dessa protokoll är av allmän tillämplighet i neurologisk sjukdom undersökning och därefter medan vidare utveckling av protokoll och applikationer för cellpopulationer fortsätter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi tillägnar den här artikeln till Dr. Ermelinda Lomazzo. Under färdigställandet av detta manuskript gick Dr. Ermelinda Lomazzo bort. Hon är förkroppsligandet av passion för vetenskap och osjälviskt engagemang i teamarbete för att uppfylla ett meningsfullt forskningsändamål. Hon drömde alltid om att bidra meningsfullt till människors större välbefinnande. Hennes godhjärtade natur komprometterades aldrig av vetenskapens och livets ansträngande vägar. Hon kommer att förbli ovärderlig, och för evigt, i våra hjärtan.

Julia M. Post finansierades av Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) vid University Medical Center vid Johannes Gutenberg University Mainz och finansieras för närvarande av SPP-2225 EXIT-projektet till LB. Raissa Lerner finansierades delvis av DZHK-projektet 81X2600250 till LB och Lipidomics Core Facility. Partiell finansiering för dessa studier tillhandahölls av Lipidomics Core Facility, Institute of Physiological Chemistry och Intramural fonder (till LB) från University Medical Center vid Johannes Gutenberg University Mainz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12(S)-HETE Biomol Cay10007248-25 Lipid Std
12(S)-HETE-d8 Biomol Cay334570-25 Lipid Std
1200 series LC System Agilent Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer Agilent Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8 Biomol Cay 334230 Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler Applied Biosystems Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes Eppendorf Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software AB SCIEX, Darmstadt Software
Analytical balance Mettler Toledo Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard Biomol Cay-10007277 Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) Instrumentation/Sample prep.
Bino Zeiss Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody Cellsignaling 9661S Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S Leica Biosystems Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler CTC Analytics AG Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 FST 11271-30 Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) FST 11252-00 Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen Kabe Labortechnik 078001 Sample Prep.
EP-1 EconoPump BioRAD 700BR07757 Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish FST 11412-11 Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp FST 14094-11 Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight FST 14568-09 Surgical Tools
Iris Spatulae FST 10094-13 Surgical Tools
Kainic acid Abcam ab120100 Epileptic drug
Lipid View software AB SCIEX, Darmstadt Software
LPC 17:0 Avanis Polaris 855676P Lipid Std
LPC 18:0 Avanis Polaris 855775P Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column Phenomenex 00D-4446-B0 Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp Maul GmbH Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
Motic Camara Motic Microscopy
MTBE Honeywell 34875-1L Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package AB SCIEX, Darmstadt Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Scientific Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1 Avanis Polaris 840857P Lipid Std
PA 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1404 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide Biomol Cay90350-100 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5 Biomol Cay9000573-5 Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1004 Lipid Std
PE 16:0-18:1 Avanis Polaris 850757P Lipid Std
PE 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1104 Lipid Std
PG 16:0-18:1 Avanis Polaris 840457P Lipid Std
PG 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1204 Lipid Std
PI 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1504 Lipid Std
Precelleys 24 Peqlab Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen Peqlab 91-pcs-ck14p Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm Peqlab 91-PCS-MK28P Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm VWR 91-PCS-CK14 Sample Prep.
Prostaglandin D2 Biomol Cay 12010 Lipid Std
Prostaglandin D2-d4 Biomol Cay 312010 Lipid Std
Prostaglandin E2 Biomol Cay10007211-1 Lipid Std
Prostaglandin E2-d9 Biomol Cay10581-50 Lipid Std
PS 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1304 Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS AB SCIEX AU111609004 Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System Appliert Biosystem Instrumentation/qPCR
Resolvin D1 Biomol Cay10012554-11 Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254 Sample Prep.
Security Guard precolumn Phenomenex Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates Thermo Fisher 72110017 Microscopy
Shandon slide rack and lid Thermo Fisher 73310017 Microscopy
SM 18:0 Avanis Polaris 860586P Lipid Std
SM d18:1/12:0 Avanis Polaris LM-2312 Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth FST 11016-17 Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern FST 14130-17 Surgical Tools
T3000 Thermocycler Biometra Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2 Biomol Cay19030-5 Lipid Std
Thromboxane B2-d4 Biomol Cay319030-25 Lipid Std
Tissue Lyser II Qiagen/ Retsch 12120240804 Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek Sakura Finetek 4583 Microscopy
Toluidinblau Roth 0300.2 Microscopy
Vapotherm Barkey 4004734 Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv VWR 9814920 Solvent/LCMS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
  2. Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
  3. Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  4. Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
  5. Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
  6. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
  7. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
  8. Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
  9. Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. Microglia-Neuron Communication in Epilepsy. Glia. 65 (1), 5-18 (2017).
  10. Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
  11. Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
  12. Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
  13. Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
  14. Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
  15. Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
  16. Konsman, J. P. The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
  17. Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).
  18. Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
  19. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  20. Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
  21. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).

Tags

Neurovetenskap nummer 181 lipidomik transkriptomik hjärnregioner djurmodeller av neurologiska sjukdomar hjärnans höga rumsliga upplösning kvantitativ lipidomik
Lipidomik och transkriptomik vid neurologiska sjukdomar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Post, J. M., Lerner, R., Schwitter,… More

Post, J. M., Lerner, R., Schwitter, C., Lutz, B., Lomazzo, E., Bindila, L. Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (181), e59423, doi:10.3791/59423 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter